专利名称：Rsv f 蛋白组合物和其制作方法
RSV F蛋白组合物和其制作方法相关申请本申请要求2009年7月15日提交的美国专利申请第61/225，805号以及2010年I月12日提交的美国专利申请第61/294，426号的权益。上述申请的全部说明通过参考纳入本文。
背景技术：
呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)肺炎病毒属(Pneumovirus)中的包膜不分节负链RNA病毒。其为儿童出生后第一年中细支气管炎和肺炎的主要原因。RSV还引起重复感染包括严重下呼吸道疾病，其可在任何年龄发作，特别是在老年人或心脏、肺或免疫系统受损的人中。为了感染宿主细胞，与其他包膜病毒如流感病毒和HIV —样，副粘病毒如RSV需要病毒膜与宿主细胞膜融合。对于RSV，保守融合蛋白(RSV F)通过偶联不可逆的蛋白重折叠和膜并置来融合病毒和细胞膜。在基于副粘病毒研究的现有模型中，所述RSV F蛋白最初折叠为亚稳态“融合前”构型。进入细胞时，所述融合前构型经历重折叠且构型变化为其稳定的“融合后”构型。RSV F蛋白由mRNA翻译为约574个氨基酸的蛋白，称为匕。Ftl的翻译后加工包括通过内质网中的信号肽酶移除N端信号肽。转运高尔基体内的细胞蛋白酶(特别是弗林蛋白酶(furin))还在两个位置(约109/110和约136/137)切割F。。该切割导致短干扰序列移除并产生两种仍彼此相关的亚基，称为Fl (约50kDa ；C端；约为残基137-574)和F2 (约20kDa #端；约为残基1-109)。F1在N端含疏水性融合肽以及2个两性七肽重复区(HRA和HRB)。HRA靠近所述融合肽，HRB靠近所述跨膜结构域。3个F1-F2异源二聚体在病毒粒子中组装为F1-F2同源三聚体。 还未获得但需要针对RSV感染的疫苗。生产疫苗的一种可能方法为基于纯化的RSV F蛋白的亚基疫苗。然而，此方法需要纯化的RSV F蛋白为长期稳定的单一形式和构型，在疫苗批次之间保持一致且方便纯化。RSV F蛋白可被截短，例如通过缺失跨膜结构域和胞质尾，以使其表达为可能可溶的胞外域。此外，尽管RSV F蛋白最初翻译为单体，但该单体切割并组装为三聚体。RSV F蛋白为切割的三聚体形式时会暴露所述疏水性融合肽。不同三聚体如可溶性胞外域三聚体上的所述暴露疏水性融合肽可彼此结合，形成玫瑰花结型。所述疏水性融合肽也可与来自例如用于表达重组可溶RSV F蛋白的细胞的脂质和脂蛋白结合。由于RSV F蛋白加工、构造和重折叠的复杂性，难以获得纯化的、均质的免疫原性制备物。因此，需要改善RSV F蛋白组合物和制作RSV F蛋白组合物的方法。发明概述本发明涉及含一种或多种RSV F多肽的免疫原性组合物，和某些遗传改造的RSV F蛋白和编码该遗传改造的RSV F蛋白的核酸。一方面所述RSV F蛋白可溶。例如，该RSV F蛋白可缺失跨膜区域和胞质尾。在一些方面，所述可溶RSV F含一种或多种的I) 一或两个弗林蛋白酶切割位置的一种或多种突变，2)融合肽的一种或多种突变，3)p27接头的一种或多种突变，4)含添加的寡聚化序列，和5)含提供蛋白酶切割位置的添加的氨基酸序列。在其他或替代的方面，所述RSV F蛋白为单体、三聚体或单体和三聚体的组合。所述三聚体可为单分散性或为玫瑰花结形式。在额外或替代方面，所述RSV F蛋白可为融合前构型、中间构型或融合后构型。在一个方面，所述免疫原性组合物含一种或多种呼吸道合胞病毒F(RSV F)多肽，其中氨基酸 100-150 用氨基酸序列 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO:4,SEQ ID NO 5,SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 ；SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 13,SEQ ID NO :91或SEQ ID NO :92替代。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一方面，所述免疫原性组合物含RSV F多肽，其中RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID NO: 12替代。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一个方面，所述免疫原性组合物含RSV F多肽，其中RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO :8、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO :92 替代。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一方面，所述免疫原性组合物含RSV F多肽，其中氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID N0:9替代。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一方面，所述免疫原性组合物含RSV F多肽，其中RSV F含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :2的氨基酸23-99和151-524。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在一个方面，所述免疫原性组合物含选自下组的多肽SEQ ID NO :49、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO :71、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ IDNO :31、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQID NO 43, SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 5USEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO:55、SEQ ID NO :57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ IDNO 62, SEQ ID NO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQID NO 69, SEQ ID NO :70、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89和SEQ ID NO :93。在一些实施方式中，省略所述信号肽和/或HIS标记。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在一方面，所述免疫原性组合物含SEQ ID NO :68或其中省略所述信号肽和任选所述 HIS 标记的 SEQ ID NO :68。在另一方面，所述免疫原性组合物含选自下组的多肽SEQ ID NO :49、SEQ ID NO 71和其中省略所述信号肽和任选所述HIS标记的任何上述序列。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在优选实施方式中，所述免疫原性组合物会包括佐剂。所述佐剂优选铝盐、水包角鲨烯乳液(如MF59)、苯并萘啶化合物、磷脂化合物(如E6020)、小分子免疫增强剂或任何上述的任何两种或更多的组合。本发明的另一方面包括重组RSV F多肽。所述RSV F形式可为单体、三聚体、三聚体玫瑰花结或单体和三聚体的组合。所述重组多肽可包括异源寡聚化结构域、表位或信号肽。所述异源寡聚化结构域优选来自流感血凝素，来自SARS刺突，或来自HIV gp41、NadA、改良的GCN4、或天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)的三聚结构域。
在一个方面，所述重组RSV F多肽的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 12,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :91 或 SEQ ID NO :92替代。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一方面，所述重组RSV F多肽中RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQID NO: 12替代。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一个方面，所述重组RSV F多肽中RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQID NO :9、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 ；SEQ IDNO 8,SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO :92 替代。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在另一方面，所述重组RSV F多肽中RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQID N0:9替代。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。在一个方面，所述重组多肽选自下组SEQ ID NO :49、SEQ ID NO :68、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ IDNO :33、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO 5U SEQ ID NO 52, SEQ ID NO 53, SEQ ID NO 54, SEQ ID NO 55, SEQ ID NO:57、SEQ ID NO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ IDNO :63、SEQ ID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQID NO 70, SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89、SEQ ID NO :93及其任何组合。任选地，省略所述信号肽和/或HIS标记。在一些实施方式中，所述RSV F多肽可溶(如，胞外域)。另一方面包括编码任何上述多肽的核酸。所述核酸可为自复制RNA分子。本发明的另一方面为含编码RSV F多肽的自复制RNA的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物可包括递送系统。本发明的另一方面包括通过给予任何所述免疫原性组合物来诱导对RSV F免疫应答的方法。本发明涉及制备组合物的方法以及含RSV F蛋白如可溶性RSV F胞外域多肽的组合物，包括免疫原性组合物。所述RSV F胞外域多肽可为单一形式，如未切割单体、未切割三聚体、切割三聚体或切割三聚体的玫瑰花结。所述RSV F胞外域多肽也可为两种或更多形式，例如处于平衡的两种或更多形式如未切割单体和未切割三聚体之间的平衡。本发明提供数种优点。例如，将所述组合物给予对象时，免疫原性组合物中存在的单一所需形式的RSV F提供了更易预测的免疫应答，且配制到疫苗中时提供更一致的稳定性和其他物理和化学特性。在一个方面，本发明是生产含经切割RSV F蛋白胞外域多肽的组合物的方法。所述方法包括a)提供含一种或多种蛋白酶切割位置的未切割RSV F蛋白胞外域多肽，其切割时产生F1和F2片段，和b)用蛋白酶或识别所述蛋白酶切割位置或多个位置的蛋白酶切割所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。通常，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改变的弗林蛋白酶切割位置，且所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主细胞，该宿主细胞生成氨基酸101-氨基酸161位没有被切割(如106-109和131-136位的弗林蛋白酶切割位置没有被切割)的所述多肽。在一些实施方式中，纯化a)中提供的未切割RSV F蛋白胞外域多肽。a)中提供的所述未切割RSV F蛋白胞外域多肽可包括完整融合肽或改变的融合肽(如缺失的融合肽或突变的融合肽)。a)中提供的所述未切割RSV F蛋白胞外域多肽包括完整融合肽时，步骤b)中的切割导致形成三聚体的玫瑰花结。a)中提供的所述未切割RSV F蛋白胞外域多肽包括改变的融合肽时，步骤b)中的切割导致形成三聚体。所述方法还可包括任选的步骤纯化通过切割所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽生成的玫瑰花结或三聚体。在优选的实施方式中，按所述方法生成的经切割RSV F蛋白胞外域多肽基本不含脂质和脂蛋白。
在另一个方面，本发明是生产含未切割RSV F蛋白胞外域多肽单体、三聚体或单体和三聚体组合的组合物的方法。所述方法包括a)提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料；和b)从所述生物材料中纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体或三聚体。通常，所述未切割RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改变的弗林蛋白酶切割位置，且所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主细胞，该宿主细胞生成氨基酸101-氨基酸161位没有被切割(如106-109和131-136位的弗林蛋白酶切割位置没有被切割)的所述多肽。在一些实施方式中，所述未切割RSVF蛋白胞外域多肽的氨基酸序列还包括改变的胰蛋白酶切割位置，且胰蛋白酶没有在氨基酸101-氨基酸161之间的位置切割所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。在另一个实施方式中，所述未切割RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列还包括改变的融合肽。在一些实施方式中，纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚体。在其他实施方式中，纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体。在其他实施方式中，纯化可能处于动态平衡的未切割RSV F蛋白胞外域单体和三聚体的混合物。在优选的实施方式中，按所述方法生成的经切割RSV F蛋白胞外域多肽基本不含脂质和脂蛋白。在另一方面，本发明是生产含切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体、三聚体或单体和三聚体组合的组合物的方法。所述方法包括a)提供含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，所述多肽含改变的融合肽；和幻从所述生物材料中纯化切割的RSV F蛋白胞外域多肽。在一些实施方式中，纯化切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚体。在其他实施方式中，纯化切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体。在其他实施方式中，纯化可能处于动态平衡的切割的RSV F蛋白胞外域单体和三聚体的混合物。在优选的实施方式中，按所述方法生成的经切割RSV F蛋白胞外域多肽优选基本不含脂质和脂蛋白。在另一个实施方式中，纯化含已改变融合肽的切割的RSV F蛋白胞外域三聚体。在其他方面，本发明提供用本发明方法生产的组合物，包括免疫原性组合物。附图简要说明图I显示野生型RSV F (
图1A)和移除跨膜结构域与胞质尾且在C末端任选地添加了 HIS6标记的胞外域构建(图IB)的示意图。为了清楚起见，残基编号涉及野生型A2株系RSV F，从N端信号肽开始，且其在含氨基酸缺失的构建中没有改变。示意图中的标记为信号序列或信号肽(sp)。图IA是RSV F蛋白的示意图，显示信号序列或信号肽(SP)、p27接头区、融合肽(FP) ,HRA结构域(HRA) ,HRB结构域(HRB)、跨膜区(I'M)和胞质尾(CT)。所述胞外域的C末端边界可变化。图IB为RSV F胞外域构建的总体示意图，描述与图IA的示意图共有的特征，并包括任选的HIS6标记(HIS TAG)。弗林蛋白酶切割位置位于氨基酸109/110和136/137位。图IC还显示RSV F(野生型)的氨基酸100-150的氨基酸序列(SEQ ID NO 108)和其中一个或两个弗林蛋白酶切割位置和/或融合肽区域突变或缺失的数种蛋白(Furmt-SEQ ID NO 3 ；FurdeI-SEQ ID NO 4 ；Furx-SEQ ID NO 6 ；Furx R113Q,K123N, K124N-SEQ ID NO 5 ；Furx R113Q, K123Q, K124Q-SEQ ID NO :92 ；Delp21 furx-SEQID NO 7 ；Delp23 furx-SEQ ID NO 8 ；Delp23 furdel-SEQ ID NO :9 ;N 末端弗林蛋白酶(Furin) -SEQ ID NO :10 ;C 末端弗林蛋白酶-SEQ ID NO :11 ;融合肽缺失 I-SEQ ID NO :12 ;和Xa因子-SEQ ID NO:13)。在图IC中，符号表示该位置的氨基酸缺失。图2显示从氨基酸488到RSV F (野生型)的TM区起始的羧基末端的氨基酸序列(SEQ ID NO :94)和数种含添加的蛋白酶切割位置的蛋白(SEQ ID NOS :95-100)。在图2中，符号表示该位置没有氨基酸。图3为用尺寸排阻色谱法的电泳凝胶的色谱图和图像，显示RSV F单体(3)的纯化。图4A-4F显示编码pT7_TC83R-FL. RSVF (A317)自复制RNA分子的质粒的核苷酸序列(SEQ ID NO :101)，所述分子编码呼吸道合胞病毒F糖蛋白(RSV-F)。编码RSV-F的核苷酸序列有下划线。图5为数种RSV株系的F蛋白氨基酸序列比对。用Corpet, Nucleic AcidsResearch，1998，16 (22) =10881-10890公开的算法获得所述比对，使用默认参数(Blossum62符号对照表，缺口开放罚分12，缺口延伸罚分A2，A2株系的F蛋白(登录号AF035006)(SEQ ID NO :102) ;CP52，CP52株系的F蛋白(登录号AF013255) (SEQ ID NO :103) ;B，B株系的 F 蛋白(登录号 AF013254) (SEQ ID NO :104) ;long，long株的 F 蛋白(登录号 AY911262)株系(SEQ ID NO :105)，和 18537 株系，18537 株系的 F 蛋白(登录号 Swiss Prot P13843)(SEQ ID NO :106)。还显示共有 F 蛋白序列(SEQ ID NO :107)图6显示来自选择RSV F抗原纯化的尺寸排阻(SEC)色谱图的相关区域。含指示抗原的主峰用星号表示，Superdex P20016/60柱(GE医疗保健公司(GE Healthcare))的保留时间用毫升数表示。在校准柱上，约47mls、65mls和77mls的保留时间分别对应于柱空体积、RSV F三聚体保留和RSV F单体保留。在图6A中，未切割的Delp23 Furdel( A p23Furdel)构建纯化自约77mls的单体峰值。用胰蛋白酶处理未切割的Delp23 Furdel RSVF抗原时，蛋白可形成玫瑰花结，其在约47mls的SEC空体积中 迁移(图6B)。RSV F融合肽缺失的经切割三聚体种类纯化自约65mls保留时间的三聚体峰值(图6C)而未切割的Delp21Furx构建(A p21 Furx)纯化自约77mls的单体峰值(图6D)。图7显示选择的RSV F抗原的典型EM图。图7A显示胰蛋白酶处理前RSVFAp23(Delp23)的EM图。图7A中的拐杖形状与融合后的三聚体构型一致，其并未总是在未切割的Ap23(Delp23)Furdel构建中观察到。所述A p23 (Delp23) Furdel构建用胰蛋白酶处理并从SEC柱的空体积中纯化并通过EM观察时，发现所述蛋白采用玫瑰花结构型(图7B)。从SEC柱的所述三聚体峰中纯化RSV F融合肽缺失构建时观察到单分散的拐杖形状，与融合后三聚体一致(图7C)。图7D所示为三种制备物AP21 (Delp21)furx RSV F(标记为单体)、融合肽缺失RSV F (标记为三聚体的泳道)和纯化的RSV F玫瑰花结(标记为玫瑰花结)。所述凝胶含数个GE全范围标准(分子量标准标注在该凝胶左侧)的泳道,而RSV F片段的近似保留时间表示在该凝胶的右侧。
图8A-8C表示棉鼠中RSV F胞外域多肽的单体(未切割的Ap21 (Delp21) furx)、三聚体的玫瑰花结(切割的A P23(DelP23) Furdel)和三聚体(融合肽缺失)为免疫原性。抗RSV F IgG和中和抗RSV抗体的血清效价在第一次疫苗接种后2周(2wpl)、第一次疫苗接种后3周(3wpl)和/或弟_■次疫苗接种后2周(2wp2)测量。发明详述本发明涉及呼吸道合胞病毒F(RSV F)多肽和/或蛋白、含RSV F多肽和/或蛋白的免疫原性组合物、生产RSV F多肽和/或蛋白和含RSV F多肽和/或蛋白的组合物的方法以及编码RSV F多肽和/或蛋白的核酸。总体上，所述免疫原性组合物包括含突变(如氨基酸取代、缺失或插入)的RSV F多肽和/或蛋白，其能提供有益的特征，如一种或多种的I)稳定融合前或中间(非融合后)构型，2)减少或消除融合肽的暴露，3)改善稳定性(如减少聚集和/或降解)，和4)更紧密地组装活性F1/F2病毒蛋白。这些特征为免疫原性组合物和免疫原性组合物的加工提供了优点。例如，如本文所述，RSV F蛋白的非融合后构型(即融合前构型、中间构型)可以是更好的免疫原并引发更好的中和抗体应答。例如通过引起弗林蛋白酶切割位置的突变或缺失来减少或消除所述融合肽的暴露，能降低所述多肽的疏水性并有助于纯化，还能减少或消除RSV F蛋白与给予所述蛋白的对象的细胞膜的结合。给予对象所述组合物时，改善的蛋白稳定性有助于生产免疫原性组合物，其中所述蛋白聚集或降解的倾向降低，这提供了更有预测性的免疫应答。最终，突变的RSV F多肽或蛋白通过例如缺失全部或部分所述p27接头区而与F1/F2病毒蛋白类似，其可引发更好的中和抗体应答。本发明的其他优点如本文所述。本发明还涉及制备含RSV F蛋白，具体是含RSV F胞外域多肽的组合物的方法，并涉及含RSV F蛋白的组合物，包括免疫原性组合物。所述RSV F胞外域多肽优选为单一形式或为已知形式之间的动态平衡。定义本文所用“群体”表示组合物中存在多于一种RSV F多肽或蛋白。所述群体可为基本均质，其中几乎所有RSV F多肽或蛋白为基本相同(如相同氨基酸序列、相同构型)、异质或具有需要程度的均质性(如至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约99%的所述RSV F多肽或蛋白是融合前构型、融合后构型、单体、三聚体。)所述RSV F蛋白的“融合后构型”为三聚体，特征为存在含3HRB和3HRA区域的六螺旋束。所述RSV F蛋白的“融合前构型”的构型特征是含包括3HRB区域的三螺旋的三聚体。
如本文所用，“RSV F胞外域多肽”表示主要含成熟RSV F蛋白的胞外部分的RSVF蛋白多肽，其具有或不具有所述信号肽(如约氨基酸I到约氨基酸524，或约氨基酸22到约氨基酸524)但缺失天然产生的RSV F蛋白的跨膜结构域和胞质尾。如本文所用，“切割的RSV F胞外域多肽”指在约101/102-约160/161的一个或多个位置上切割而产生两个亚基的RSV F胞外域多肽，其中一个所述亚基包括F1，另一个亚基包括F2。如本文所用，“C末端未切割的RSV F胞外域多肽”指在约101/102-约131/132的一个或多个位置上切割且在约132/133-约160/161的一个或多个位置上没有切割而产生两个亚基的RSV F胞外域多肽，其中一个所述亚基包括F1,另一个亚基包括F2。如本文所用，“未切割的RSV F胞外域多肽”指在约101/102-约160/161的一个或多个位置上没有切割的RSV F胞外域多肽。未切割的RSV F胞外域多肽可为例如单体或三聚体。
如本文所用，“融合肽”表示RSV F蛋白的氨基酸137-154。如本文所用，“改变的融合肽”表示其中一种或多种氨基酸独立地被替换或缺失的融合肽，包括替换或缺失137-154位的所有氨基酸。含“改变的融合肽”的经切割RSV F胞外域多肽优选不形成玫瑰花结。如本文所用，“纯化的”蛋白或多肽是重组或合成生产，或由其天然宿主产生的蛋白或多肽，其从所述重组或合成生产系统或天然宿主的其他组分中分离出，从而相对于组合物中存在的其他大分子组分，所述蛋白的含量明显高于粗品中存在的量。通常，纯化的蛋白质的均质性至少约50%，更优选至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或基本均质。如本文所用，“基本不含脂质和脂蛋白^示在SDS PAGE凝胶上观察蛋白和/或多肽(如RSV F多肽)的纯度和用UV280吸收或BCA分析测量总蛋白含量，并用磷脂酶C试验(Wako，编号433-36201)测量脂质和脂蛋白含量时，质量上至少约95 %不含脂质和脂蛋白的组合物、蛋白或多肽。如本文所用，“改变的弗林蛋白酶切割位置”表示天然产生的RSV F蛋白中约106-109位和约133-136位上的氨基酸序列，所述序列被弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶识别并切割，但在未切割的RSV F蛋白胞外域多肽中含一种或多种氨基酸替换、一种或多种氨基酸缺失、或一种或多种氨基酸替换和一种或多种氨基酸缺失的组合，从而含改变的弗林蛋白酶切割位置的RSV F胞外域多肽分泌自细胞，该细胞生成在所述改变的弗林蛋白酶切割位置未切割的所述多肽。适用于本发明的RSV F蛋白胞外域特征在本文中参考具体氨基酸描述，所述氨基酸由来自所述A2株系的RSV F蛋白序列(SEQ ID NO 1)中的氨基酸位置鉴别。RSV F蛋白胞外域可具有来自所述A2株系或任何其他所需株系的F蛋白的氨基酸序列。使用非A2株系的株系F蛋白胞外域时，所述F蛋白的氨基酸编号参考所述A2株系的F蛋白的编号，需要时插入缺口。这可通过对任何所需RSV F蛋白和所述株系A2的F蛋白序列进行比对实现，如本文所示的来自所述A2株系、CP52株系、B株系、long株、和所述18537株系的F蛋白。参见图 5。优选用 Corpet，Nucleic Acids Research, 1998,16(22) : 10881-10890 公开的算法进行序列比对，使用默认参数(Blossum 62符号对照表，缺口开放罚分12，缺口延伸罚分2)。本发明提供可溶性RSV F多肽和蛋白、和含所述可溶性RSV F多肽和蛋白的免疫原性组合物、以及含编码所述可溶性RSV F多肽和蛋白的核酸(如自复制RNA分子)的组合物。所述RSV F多肽(如胞外域多肽)可为任何需要的形式如单一形式，例如未切割单体、未切割三聚体、切割三聚体或切割三聚体的玫瑰花结。所述RSV F胞外域多肽也可为两种或更多形式，例如处于平衡中的两种或更多形式如未切割单体和未切割三聚体之间的平衡。本发明提供数种优点。例如，免疫原性组合物中存在RSV的单一需要形式，或已知形式之间的动态平衡提供了更易预测的配制、可溶性和稳定性，将所述组合物给予对象时还提供了更易预测的免疫应答。所述RSV F胞外域多肽优选为单一形式，如未切割单体、未切割三聚体、切割三聚体、切割三聚体的玫瑰花结或为这些形式的子集之间的动态平衡(如未切割单体和未切割二聚体之间的平衡)。 在本发明的一个方面，所述RSV F多肽和蛋白为融合前构型。所述融合前构型的表位可更好地引发能识别并中和天然病毒粒子的抗体。在本发明的一个实施方式中，免疫原性组合物包括融合前构型的呼吸道合胞病毒F糖蛋白群体。在本发明的另一方面，免疫原性组合物包括呼吸道合胞病毒F糖蛋白群体，所述糖蛋白与分离的RSV F糖蛋白相比不利于融合后构型。本发明还提供含多肽的免疫原性组合物，所述多肽展示的表位存在于呼吸道合胞病毒F糖蛋白的融合前或中间融合构型，但在所述糖蛋白的融合后构型中缺失。F糖蛋白RSV的F糖蛋白通过病毒包膜和宿主细胞质膜之间的融合指导病毒穿入。其为I型单次跨膜整合蛋白，具有四个一般结构域N末端ER-移位信号序列(SS)、胞外域(ED)、跨膜结构域(TM)和胞质尾(CT)。CT含单一棕榈酰化半胱氨酸残基。RSV分离物之间F蛋白的序列高度保守，但不断进化(7)。与大多数副粘病毒不同，RSV中的F蛋白可介导独立于其他病毒蛋白的进入和多核体形成(其他副粘病毒中除了 F外通常需要HN)。hRSV F的mRNA翻译为称作Ftl的574氨基酸前体蛋白，其在N末端包含信号肽序列，该序列在内质网中由信号肽酶移除。转运高尔基体中细胞蛋白酶(具体为弗林蛋白酶)在两个位置(氨基酸109/110和136/137)切割Ftl，移除短糖基化干扰序列并产生两个亚基，称为F1 (约50kDa ；C末端；残基137-574)和F2 (约20kDa ；N末端；残基1-109)(参见例如图I)。F1在N端含疏水性融合肽以及两个疏水性七肽重复区(HRA和HRB)。HRA靠近所述融合肽，HRB靠近所述跨膜结构域(参见例如图I)。所述F1-F2异源二聚体在病毒粒子中组装为同源三聚体。RSV以单一血清型存在，但具有两个抗原亚组A和B。所述两组的F糖蛋白约90%相同。所述A亚组、所述B亚组或两组的组合或混合可用于本发明。所述A亚组的示例序列为 SEQ ID NO 1(A2 株系；GenBank GI :138251 ；Swiss Prot P03420)，所述 B 亚组为 SEQID NO :2(18537 株系；GI :138250 ；Swiss Prot P13843)。SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 均为574氨基酸序列。A2株系中的信号肽为氨基酸1-21，但18537株系中其为1_22。两个序列中，所述TM结构域来自约氨基酸530-550，但或者报道为525-548。
SEQ ID NO : II MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIE 6061 LSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLN 120121 NAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVS 180181 LSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVN 240241 AGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYV 300301 VQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKV 360361 QSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDOQMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKT 420421 KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDP 480481 LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLS 540541 LIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN 574SEQ ID NO :2I MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIE 6061 LSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTIN 120121 TTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVS 180181 LSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLEITREFSVN 240241 AGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYV 300301 VQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKV 360361 QSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDOQMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKT 420421 KCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDP 480481 LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLS 540541 LIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK 574本发明可使用任何所需的RSV F氨基酸序列，如氨基酸序列SEQ ID NO :1或2，或与SEQ ID NO :1或2有相同性的序列。通常其与SEQ ID NO :1或2有至少75%相同性，如与SEQ ID NO :1或2有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%相同性。所述序列可天然地存在于RSV中。本发明使用全部或部分F蛋白胞外域时，其可包括⑴含SEQ ID NO 1的约氨基酸22-525的多肽。(ii)含SEQ ID NO 2的约氨基酸23-525的多肽。(iii)含与⑴或(ii)有至少75%相同性(如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%相同性)的氨基酸序列的多肽。 (iv)含⑴、(ii)或(iii)的片段的多肽，其中所述片段含至少一种F蛋白表位。所述片段通常至少约100个氨基酸长度，如至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450个氨基酸长度。所述胞外域可为具有或没有所述信号肽的Ftl形式，或可包括彼此结合的两种分离的肽链(如F1亚基和F2亚基)，例如所述亚基可通过二硫桥连接。因此，约氨基酸101-约氨基酸161的全部或部分如氨基酸110-136可在所述胞外域中缺失。因此全部或部分所述胞外域可包括(V)与所述第一多肽链结合的第一肽链和第二肽链，其中所述第一肽链含与SEQID NO :1的约氨基酸22-约氨基酸101或SEQ ID NO 2的约氨基酸23-约氨基酸101有至少75%相同性(如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%相同性)的氨基酸序列，且所述第二肽链含与SEQ ID NO :1的约氨基酸162-约525或SEQ ID NO 2的约氨基酸162-525有至少75%相同性(如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%相同性)的氨基酸序列。(vi)与所述第一多肽链结合的第一肽链和第二肽链，其中所述第一肽链含包括SEQ ID NO 1的约氨基酸22-约氨基酸101或SEQ ID NO 2的约氨基酸23-约氨基酸109的片段的氨基酸序列，且所述第二肽链含SEQ ID NO 1的约氨基酸162-约氨基酸525或SEQ ID NO :2的约氨基酸161-约氨基酸525的片段。一种或两种所述片段包括至少一种F蛋白表位。所述第一肽链中的片段通常为至少20个氨基酸长度，如至少30、至少40、至少 50、至少60、至少70、至少80个氨基酸长度。所述第二肽链中的片段通常为至少100个氨基酸长度，如至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450个氨基酸长度。(vii)通过弗林蛋白酶消化(i)、(ii)、(iii)或(iv)可获得的分子。因此本发明所用的氨基酸序列可天然存在于RSV F蛋白中(如缺失TM和CT的可溶性RSV F蛋白，约为SEQ ID NO : I或2的氨基酸522-574)，和/或其相对天然RSV序列可具有一种或多种(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种)单一氨基酸突变(插入、缺失或替换)。例如，已知突变F蛋白消除其弗林蛋白酶切割序列，从而阻止细胞内加工。在某些实施方式中，所述RSV F蛋白缺失TM和CT (约为SEQ ID NO :1或2的氨基酸522-574)并含相对天然RSV序列的一种或多种(如 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30种)单一氨基酸突变(插入、缺失或替换)。弗林蛋白酶切割、胰蛋白酶切割和融合肽突变RSV F多肽或蛋白可含有防止一个或两个所述弗林蛋白酶切割位置(即SEQ IDNO 1和2的氨基酸109和136)切割的一种或多种突变。这些突变可阻止所述可溶性多肽或蛋白的聚集并因此有助于纯化，如果所述RSV F蛋白在细胞表面表达如由病毒复制子表达(如a病毒复制子颗粒)，或如果所述RSV F蛋白是病毒样颗粒的组分，所述突变可阻止细胞之间的融合。这些突变单独或与本文所述其他突变结合也可稳定所述融合前构型中的蛋白。合适的弗林蛋白酶突变的示例包括SEQ ID NO :1或2氨基酸残基106-109替换为 RARK(SEQ ID NO77)、RARQ(SEQ ID NO:78)、QAQN(SEQ ID NO 79)或 IEGR(SEQ ID NO 80)。或者或此外，SEQ ID NO :1或2的氨基酸残基133-136可替换为RKKK(SEQ ID NO :81)、A A AR、QNQN (SEQ ID NO :82)、QQQR (SEQ ID NO :83)或 IEGR (SEQ ID NO :80)。(A 表示所述氨基酸残基缺失。)如果需要，这些突变可与本文所述其他突变组合，如所述P27区域(SEQ ID NO :1或2的氨基酸110-136)的突变，包括所述p27区域全部或部分的缺失。如果需要，这些弗林蛋白酶切割突变可与本文所述其他突变组合，如胰蛋白酶切割突变和融合肽突变。合适的胰蛋白酶切割突变示例包括SEQ ID NO :1或2的约101位-161位的任何赖氨酸或精氨酸残基的缺失，或任何所述赖氨酸或精氨酸残基被非赖氨酸或精氨酸的氨基酸替换。例如，所述P27区域(SEQ ID NO :1或2的约氨基酸110-136)中的赖氨酸和/或精氨酸残基可被替代或缺失，包括所述P27区域全部或部分的缺失。替代或除了所述弗林蛋白酶切割突变，RSV F多肽或蛋白在所述融合肽区域可包含一种或多种突变(SEQ ID NO :1或2的氨基酸137和153)。例如，此区域可全部或部分
缺失。 在具体实施方式
中，所述RSV F多肽或蛋白如SEQ ID NO USEQ ID NO 2的氨基酸残基100-150的序列，或其可溶性胞外域为(Furmt)TPATNNRARKELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKKKFLGFLLGVGSAIAS (SEQ ID NO 3)(Furdel) TPATNNRARQELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRFLGFLLGVGSAIAS (SEQ IDNO 4)(Furx)TPATNNQAQNELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS(SEQ ID NO:6)(Furx R113Q, K123N, K124N) TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNANNTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS(SEQ ID NO 5)(Furx R113Q, K123Q, K124Q))TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS(SEQ ID NO 92)(Delp21 Furx) TPATNNQAQN---------------------QNQNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ
ID NO 7)(Delp23 Furx) TPATNNQAQN-----------------------QNQNFLGFLLGVGSAIAS (SEQ
ID NO 8)(Delp21 furdel) TPATNNRARQ---------------------QNQQQRFLGFLLGVGSAIAS (SE
Q ID NO 109)(Delp23 furdel) TPATNNRARQ-----------------------QQQRFLGFLLGVGSAIAS (SE
Q ID NO 9)(N 末端弗林蛋白酶)TPATNNRARRELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSQNQNQNFLGFLLGVGSAIAS(SEQ ID NO 10)(C 末端弗林蛋白酶)TPATNNQAQNELPQFMNYTLNNAQQTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIAS(SEQ ID NO 11)(融合肽缺失 I)TPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR---------SAIAS(SEQ
ID NO 12)，(融合肽缺失 2) TPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR------GVGSAIAS (SEQ
ID NO :91)，或(Xa 因子)TPATNNIEGRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKIEGRFLGFLLGVGSAIAS(SEQ IDNO 13);其中符号表示该位置的氨基酸缺失。除了弗林蛋白酶切割和融合肽突变以外或者，可溶性RSV F多肽或蛋白如缺失所述跨膜区和胞质尾的那些可含一种或多种寡聚序列。存在寡聚序列时，优选三聚序列。本领域已知合适的寡聚序列，包括例如酵母GCN4亮氨酸拉链蛋白的卷曲螺旋、T4噬菌体次要纤维蛋白(fibritin)的三聚化序列(“折叠子(foldon) ”)和流感HA的三聚体结构域。这些和其他合适的寡聚序列在本文中更详细地描述。在具体实施方式
中，所述RSV F多肽或蛋白的羧基末端序列起始于480位，其为(GCN)PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGE(SEQ ID NO 14)(HA)PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEK(SEQID NO 15)(理想螺旋)PLVFPSDEFDASISQINEKINQILAFIRKIDELLHNIN(SEQ ID NO :16)(短 foldon)PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEffVLLSTFL(SEQ ID NO: 17);或(长foldon) PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNNKNDDKGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO 18)除了弗林蛋白酶切割突变、融合肽突变和添加的寡聚序列的任何组合以外或者，含跨膜区域的RSV F多肽或蛋白可含有提供蛋白酶切割位置的添加的氨基酸序列。这种类型的RSV F多肽或蛋白可通过在细胞表面表达而生成，并在用合适的蛋白酶从细胞表面切割后以可溶形式回收。通常，提供蛋白酶切割位置的氨基酸序列位于所述跨膜结构域氨基末端(SEQ ID NO :1或2的氨基酸525)的约60个氨基酸、约50个氨基酸、约40个氨基酸、约30个氨基酸、约20个氨基酸、约10个氨基酸内，或基本与之毗邻。本领域熟知许多可被市售蛋白酶切割的合适氨基酸序列。例如，凝血酶切割序列LVPR(SEQ ID N0:75)、Xa因子切割序列IEGR和肠激酶切割序列DDDDK (SEQ ID NO :76)。这些氨基酸序列可导入RSV F多肽。在具体实施方式
中，起始于488位到所述TM区域的所述RSV F多肽或蛋白的序列示于图2。按照本发明使用的免疫原性多肽通常经分离或纯化。因此，其不与通常天然存在(若可以)的分子结合。例如，本发明使用的F蛋白不采用RSV病毒粒的形式(尽管其可为人工病毒粒的形式，如病毒体或VLP)。通常通过在重组宿主系统中表达来制备多肽。尽管可使用任何合适的方法，其(如RSV胞外域)生成通常是通过在合适的重组宿主细胞中表达编码所述胞外域的重组构建体。合适的重组宿主细胞包括例如，昆虫细胞(如埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)、家香蛾(Bombyx mori)、果妮(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera fugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))、哺乳动物细胞(如人、非人灵长类、马、牛、羊、狗、猫和啮齿类(如仓鼠))、禽类细胞(如鸡、鸭、鹅)、细菌(如大肠杆菌(E. coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌属(Streptococcus spp.))、酵母细胞(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白色念珠菌(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)、多形汉森酵母(Hansenual polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica))、四膜虫细胞(如嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila))或其组合。本领域已知许多合适的昆虫细胞和哺乳动物细胞。合适的昆虫细胞包括例如，Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞和High Five细胞(源自亲本粉纹夜蛾BTI-TN-5B1-4细胞系的克隆分离物(英杰公司(Invitrogen))) 合适的哺乳动物细胞包括例如，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾细胞(HEK293细胞，通常由剪切的腺病毒5型DNA转化成)、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞、HeLa 细胞、PERC. 6 细胞(ECACC 保藏号 96022940) ,Hep G2 细胞、MRC-5 (ATCC CCL-171)、WI-38 (ATCC CCL-75)、胎猕猴肺细胞(ATCC CL-160)、Madin-Darby 牛肾(“MDBK”)细胞、Madin-Darby 狗肾(“MDCK”)细胞(如 MDCK (NBL2)、ATCC CCL34;或 MDCK 33016,DSM ACC2219)、幼仓鼠肾(BHK)细胞如BHK21-F、HKCC细胞等。合适的禽类细胞包括例如，鸡胚胎干细胞(如EBX 细胞)、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎生殖细胞、鸭细胞(如，例如在Vaccine27 :4975-4982(2009)和 W02005/042728 中描述的 AGE1. CR 和 AGE1. CR. pIX 细胞系(专业生物基因公司(ProBioGen)))、EB66细胞等。
合适的昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统为本领域技术人员已知，描述于例如Summers 和 Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555(1987)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法以药盒形式购自加利福尼亚州圣迭戈的英杰公司等。禽类细胞表达系统也为本领域技术人员已知，描述于例如美国专利号5，340，740 ；5，656，479 ;5，830，510 ;6，114，168 ;和 6，500，668 ;欧洲专利号 EP 0787180B ;欧洲专利申请号EP03291813. 8 ;W0 03/043415 ;和WO 03/076601。相似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统也为本领域已知，描述于例如Yeast Genetic Engineering (《酵母遗传工程》)(Barr等编著，1989)伦敦，巴特沃思公司(Butterworths)。编码RSV F蛋白胞外域的重组构建体可用常规方法在合适的载体中制备。昆虫或哺乳动物细胞中用于重组蛋白表达的许多合适载体为本领域熟知且常用。合适的载体可含许多组分，包括但不限于一种或多种下述组分复制起点；可选的标记基因；一种或多种表达控制元件如转录控制元件(如启动子、增强子、终止子)，和/或一种或多种翻译信号；和选择的宿主细胞(如哺乳动物起源的或来自异源哺乳动物或非哺乳动物物种)中用于靶向分泌途径的信号序列或前导序列。例如，为了在昆虫细胞中表达，使用合适的杆状病毒表达载体如PFastBac (英杰公司)生产重组杆状病毒颗粒。所述杆状病毒颗粒经扩增，用于感染昆虫细胞以表达重组蛋白。为了在哺乳动物细胞中表达，使用会驱动所述构建体在所需哺乳动物宿主细胞(如中华仓鼠卵细胞)中表达的载体。RSV F蛋白胞外域多肽可用任何合适的方法纯化。例如，本领域已知通过免疫亲和层析纯化RSV F胞外域多肽的方法。Ruiz-Arguello等，J. Gen. Virol. ,85 3677-3687 (2004)。本领域已知纯化所需蛋白的合适方法，包括沉淀和各种类型的色谱如疏水相互作用、离子交换、亲和、螯合和尺寸排阻。可用两种或更多这些或其他合适方法实现合适的纯化方案。如果需要，所述RSV F蛋白胞外域多肽可包括有助于纯化的“标记”，如表位标记或HIS标记。该标记的多肽可通过螯合层析或亲和层析方便地从例如条件培养基中纯化。所述RSV F多肽也可通过在对象细胞中表达其编码核酸而原位生成。例如，通过表达本文所述的自复制RNA。除了所述RSV序列，多肽可包括额外序列。例如，多肽可包括有助于纯化的序列(如聚His序列)。相似地，为了表达的目的，F蛋白的天然前导肽可替换为不同的肽。例如，参考文献6使用蜂毒素前导肽取代该天然肽。
多肽的形式和构型本发明包括含本文公开的RSV F多肽和蛋白的任何形式和构型的免疫原性组合物，包括本文公开的RSV F多肽和蛋白的形式和构型的任何所需组合。所述RSVF多肽可为单体，或所述RSV F蛋白可为含3种单体多肽的三聚体。三聚体可为单分散或例如由于单独三聚体的融合肽之间的相互作用，其可为玫瑰花结的形式。免疫原性组合物可包括多肽，所述多肽为单体、三聚体、单体和三聚体的组合(如动态平衡中)、三聚体的玫瑰花结和上述任何组合。此外，如本文进一步描述，所述RSV F蛋白可为融合后构型、融合前构型或中间构型。所述RSV F蛋白可为融合前构型、融合后构型或中间构型。所述RSV F蛋白的“融合后构型”被认为是天然RSV F的低能量构型，是特征为存在含3HRB和3HRA区域的6螺旋束的三聚体。电子显微镜下所述融合后构型具有特有的“拐杖”或“高尔夫球座”形状。所述RSV F蛋白的“融合前构型”的构型特征是含包括3HRB区域的卷曲螺旋的三聚体。融合前构型中没有暴露所述融合肽，因此融合前构型通常不形成玫瑰花结，且电子显微镜下具有“棒棒糖”或“球和茎”形状。在一些方面，所述RSV F蛋白在所述融合后构型中。例如，所述融合后构型中所述RSV F蛋白可为单分散三聚体的形式，或为包含融合后三聚体的玫瑰花结形式。在一些实施方式中，所述RSV F多肽为单体。在一些实施方式中，所述RSV F多肽为三聚体。在其他方面，所述RSV F蛋白在所述融合前构型中。不希望受任何具体理论的限制，认为RSV F蛋白的融合前构型或中间形式可含与在天然RSV病毒粒上表达的RSV蛋白上相同的表位，并因此提供引发中和抗体的优点。本发明的一些方面使用不利于所述F蛋白的融合后构型的多肽。在从所述融合前构型向所述融合后构型转变中，所述多肽(全部或部分)优选展示所述融合前F蛋白的表位或中间构型的表位。这些多肽在融合前状态可为天然或突变的F蛋白，在中间构型中可为天然或突变的F蛋白，或可为天然或突变的蛋白群体，其中不利于所述融合后构型或其被优先排除。在某些情况下，所述天然或突变的蛋白可与一种或多种额外分子结合，所述分子协助维持上述一种状态中的多肽如优选结合所述融合前构型或中间构型的单克隆抗体。此外，所述多肽可为天然F蛋白衍生物。该衍生物包括含天然F蛋白的一种或多种片段的多肽、含天然F蛋白(或其片段)和异源序列的融合多肽以及含具有一种或多种突变的天然F蛋白序列的多肽。这些(或其他)修饰可能不利于所述融合后构型。不利于所述融合后构型的示例性方法包括稳定所述融合前构型、稳定所述中间构型、使所述融合后构型去稳定或增加引起所述融合后构型的一种或多种步骤的激活屏障。在另一实施方式中，本发明为展示至少一种表位的多肽，所述表位特异于所述融合前构型F蛋白或中间构型F蛋白。特异于所述融合前构型F蛋白或中间构型F蛋白的表位为融合后构型中不存在的表位。优选所述至少一种表位稳定存在，例如所述表位在溶液中稳定存在至少12小时、至少I天、至少2天、至少4天、至少6天、至少I周、至少2周、至 少4周或至少6周。所述多肽在融合前状态、中间状态或状态群体中可为天然或突变的F蛋白，所述状态群体中所述融合后状态含量不足或百分比低于分离的天然F蛋白，或其可为天然F蛋白的衍生物。该衍生物包括含天然F蛋白的一种或多种片段的多肽、含天然F蛋白(或其片段)和异源序列的融合多肽以及含具有一种或多种突变的天然F蛋白序列的多肽。这些(或其他)修饰可能将F蛋白氨基酸序列稳定为其融合前构型、将F蛋白氨基酸序列稳定为中间构型、使F蛋白氨基酸序列的融合后构型不稳定、增加引起F蛋白氨基酸序列的融合后构型转变的能量屏障，或上述两种或更多的组合。所述F蛋白的TM和/或CT结构域 对稳定所述融合前构型很重要(8)。因此这些结构域可在本发明的免疫原中有效保留。由于可溶性免疫原中可能不需要包括跨膜结构域，但TM的功能效应可通过其他方法实现。例如，副流感病毒5的F蛋白的融合前和后表现已被详细研究(6)，该作者通过融合异源三聚结构域与ED的C末端来稳定ED的融合前结构。寡聚化结构域本发明的另一实施方式中，所述组合物可包括含第一结构域和第二结构域的多肽(如重组多肽)，其中(i)所述第一结构域含所述RSV F蛋白(如全部或部分的RSV胞外域)，和(ii)所述第二结构域含异源寡聚化结构域。所述第二结构域允许所述多肽的寡聚化，从而有助于所述第一结构域采用融合前状态或中间状态。所述多肽优选为寡聚体，具体为三聚体。本领域技术人员可获得各种寡聚化结构域。这些氨基酸序列能形成与其他多肽(相同或不同)中的寡聚化结构域(相同或不同)相互作用的结构，从而所述多种多肽可结合(通常为非共价)以形成寡聚体如三聚体。例如，HIV的F蛋白的三聚化(即gpl60)是通过将其融合到天然为稳定三聚体(9)的大肠杆菌天冬氨酸氨甲酰基转移酶(ATCase)的催化亚基上获得。因此ATCase的该亚基可用于本发明。相似地，HIV(IO)和PIV5的F蛋白(6)的三聚化是通过将其胞外域融合到GCNt上获得。因此本发明所用的寡聚化结构域可包括酵母GCN4亮氨酸拉链蛋白的卷曲螺旋(11)。通过使用来自T4噬菌体次要纤维蛋白的三聚化序列(‘折叠子’ )(GSGYIPEAPRDGQ AYVRKDGEffVLLSTFL-SEQ ID NO 19)获得来自A型流感病毒HA蛋白的胞外域三聚化(12)。因此本发明所用的寡聚化结构域可包括该折叠子。天然产生的蛋白寡聚体(异源寡聚体和同源寡聚体)以各种不同方式结合，如通过结合不同单体中的￠-片层、通过结合不同单体中的a-螺旋、通过结合疏水性表面区域等。蛋白寡聚化中涉及的一种常见结构基序为卷曲螺旋结构域。所述卷曲a-螺旋结构基序自身可形成螺旋，且2、3、4或5个a -螺旋可彼此围绕形成左手超螺旋，称为“卷曲螺旋”，尽管已设计人工右手超螺旋(13-19)。所述卷曲螺旋结构域的简单性使其成为设计具有确定寡聚化状态的嵌合蛋白的普遍选择(16)。在卷曲螺旋结构中，所述a -螺旋通过沿着各螺旋一侧形成非极性条的疏水残基相互作用，且该条两边的侧链之间还可有稳定的静电相互作用。在a-螺旋的abcdefg七残基重复序列中，用残基a和d处的疏水侧链和主要位于残基e和g的任何静电相互作用定义所述非极性条。位置a最常见为Leu、Ile或Ala且位置d通常为Leu或Ala。残基e和g通常为Glu或Gln,位置g也主要为Arg和Lys。位置b、c和f常为带电残基，因为这些残基与溶剂接触。然而该常见七残基模式有例外，且所述七残基中有时存在Pro残基。所述例外常具有功能性意义包括例如，使所述寡聚化结构域不稳定以使其重折叠并重排，如发生在所述F蛋白中。
本领域已知数百种卷曲螺旋结构域序列，且任何合适的序列可用作本发明的寡聚化结构域，只要其保留与其他卷曲螺旋结构域寡聚化的能力且其没有破坏所述多肽中其他结构域的功能。优选使用的卷曲螺旋结构域存在于细胞外(20)且天然作为寡聚化结构域。作为使用天然卷曲螺旋结构域的替代，可使用人工卷曲螺旋结构域(21，22)。由于卷曲螺旋结构域的高重复结构，所述结构域特别适于计算机建模，因为各氨基酸残基的主链部分可参数化而不是将残基的各主链部分作为具有其自身变量的单独单元。结构域(b)可包括亮氨酸拉链序列或丙氨酸拉链序列(23)。本发明的多肽中所用的卷曲结构域优选是形成三聚体的结构域，从而本发明的所述多肽也可组装为三聚体。优选的卷曲螺旋结构域取自细菌跨膜蛋白。跨膜蛋白的优选子集为粘附素(即介导与其他细胞或表面粘附的细胞表面蛋白)、具体为非菌毛粘附素(如寡聚卷曲螺旋粘附素，或‘Oca’家族)。本发明使用的具体序列包括参考文献24公开的序列，来自小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)粘附素YadA、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)粘附素 NadA、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhal is)表面蛋白UspA2,和其他粘附素如来自流感嗜血杆菌埃及生物型(Haemophilus influenzaebiogroup aegyptius)的 HadA 粘附素等(参考文献 24 的 SEQ ID NO 28-31 和 42-58)。此 夕卜，所述真核热休克转录因子具有可分别表达的卷曲螺旋三聚化结构域，因此将其用于本发明。具有卷曲螺旋区域的多肽的氨基酸序列中，所述a -螺旋的七残基重复区的性质说明所述卷曲螺旋结构域的界线可以一定精确度确定，但其中卷曲螺旋排列可视为终止的精确残基不能绝对准确地获知。然而，缺乏绝对精确性不是实施本发明的问题，因为常规测试可揭示所述卷曲螺旋是否需要任何具体的可能有疑问的氨基酸残基。即便如此，本发明不需要绝对精确地获知所述界线，因为本发明的唯一基本要求是所述卷曲螺旋结构域以使所述多肽与其他卷曲螺旋结构域寡聚化而不破坏所述多肽中的其他结构域功能的方式行使功能。在左手3螺旋中发现本发明可用的另一类寡聚化结构域，称为胶原螺旋(25)。这些3螺旋形成序列包括基本三肽重复序列1Gly-2Xaa-3Xaa,其中2Xaa常为Pro,且3Xaa常为4-羟基脯氨酸。尽管该基序称为“胶原”螺旋，但在胶原以外的许多蛋白内都有发现。因此，所述寡聚化结构域可为含序列基序1Gly-2Xaa-3Xaa的多重复的序列，所述基序折叠形成螺旋结构，其可与其他多肽链中的相应螺旋结构寡聚化。胶原还提供另一类寡聚化结构域。参考文献26描述了 X型胶原的非胶原结构域I(NCl)中发现的基序，且该基序可用于形成三聚体和更高级的多体而没有3螺旋。所述三聚结合具有高度热稳定性而没有分子间二硫键。因此，所述寡聚化结构域可含NCl序列。其他寡聚化结构域可源自寡聚TM蛋白的跨膜结构域。由于这些通常为亲脂性的，所以位于其TM区域外侧的疏水残基可被带电残基替代以提供可溶的结构域。本领域已知通过蛋白工程改造使跨膜结构域增溶的方法，例如参考文献27。所述方法也用于GCN4，其中所述七残基重复位置“a”和“d”替换为异亮氨酸(11) KQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA(SEQ ID NO :20)。用于所述寡聚化结构域的合适卷曲螺旋序列通常为20-35个氨基酸长度，如23-30个氨基酸残基长度。本发明所用的寡聚化结构域通常可维持寡聚化结构而不需要形成单体间二硫桥，但含二硫键连接单体的寡聚体不排除在本发明以外。或者或此外，为了使用寡聚化结构域以稳定F蛋白为其融合前构型，可使用突变。例如，参考文献28报道了猿病毒5或亨德拉病毒中F蛋白的F2亚基保守区域中的突变可影响所述融合前构型的稳定性。在一些情况中，也可使用低pH以有利于所述融合前构型。HRB结构域三聚体的稳定化
在本发明另一优选方面，所述HRB结构域三聚体稳定化可能不利于所述F蛋白的融合后构型。在所述融合前和可能的中间形式中所述HRB结构域形成3链卷曲螺旋。如以上部分所讨论，由于其简单性，卷曲螺旋已被作为蛋白之间分子间相互作用的模式系统和长程分子内相互作用(即三级折叠相互作用)的模式系统而广泛研究。这些研究有助于指导可用于稳定所述三聚卷曲螺旋形式中HRB结构域的方法。例如，所述七残基重复区的a和/或d位置的一种或多种残基可替换为有利于形成稳定三聚卷曲螺旋的残基如Ile残基。此外，虽然次优选，但可删除e和g位置的不利离子相互作用或可添加e和g位置的有利离子相互作用。用于操作的所述HRB结构域的优选区域为P484-N517之间的七残基重复区。用于革巴向以突变的a和d残基的优选示例为F488、1492、V495、1499、S502、1506、S509、L512和V516。特别优选丝氨酸残基，因为将所述亲水残基替换为疏水残基会稳定所述卷曲螺旋的疏水核心。另一优选的靶标为具有较小疏水残基的苯丙氨酸，其能更好地包装入所述核心如异亮氨酸。HRA结构域三聚体的去稳定化在本发明另一优选方面，去所述HRA结构域三聚体去稳定化可能不利于所述F蛋白的融合后构型。在所述融合后和可能的一种或多种中间形式中所述HRA结构域形成3链卷曲螺旋。例如，所述七残基重复区的a和/或d位置的一种或多种残基可替换为不利于形成稳定三聚卷曲螺旋的残基。此外，虽然次优选，但可删除e和g位置的有利离子相互作用或可添加e和g位置的不利离子相互作用。所选的突变优选对所述融合前构型的HRA结构域的稳定性影响最小，其可基于融合前和融合后形式的PIV5F蛋白的可用晶体结构建模。其他修饰除了上述修饰，还可设计基于所述hRSV F蛋白的分子建模的修饰，所述建模基于融合前和融合后形式的PIV5F蛋白的可用晶体结构。可进行突变以去稳定化所述融合后构型如所述HRA和HRB结构域的6HB折叠或稳定化所述融合前构型如所述融合前构型中的HRA折叠。此外，可提高引起所述融合后构型的转变的能量屏障。虽然本领域技术人员会理解稳定所述起始构型或去稳定所述最终构型可具有提高能量屏障的影响，但可引入自身影响所述转变状态的其他修饰。作为另一个例子，HRB结构域N末端氨基酸(约氨基酸449-482，优选V459-F483)用作使所述HRB结构域从所述F蛋白三聚体的一侧移动到另一侧的“系绳”，从而该HRB结构域可参与所述融合后构型的6HB中。一种或多种这些氨基酸的缺失会影响或完全阻止所述HRB结构域参与所述F蛋白的融合后构型的6HB折叠中(参见图3)。此外，可稳定所述融合前构型中所述系绳和所述F蛋白之间的相互作用以阻止所述系绳离开从而使所述HRB结构域参与所述6HB折叠。可进行的稳定化突变的例子为所述融合前构型中所述系绳和该系绳接触的所述F蛋白部分之间的半胱氨酸桥。另一例子是所述融合前构型中HRA的稳定化(残基T50-Y306)。同样，基于同源F蛋白的晶体结构，可通过用大小相似的疏水残基替换包埋的亲水或离子残基来稳定所述疏水核心。也可在表面或核心内引入半胱氨酸桥。此外，如用溶菌酶突变体的大量晶体结构分析所证明的，所述疏水核心或蛋白相对刚硬，因此引入孔可预见地去稳定化所述溶菌酶突变体。相似地，重包装所述融合前构型中F蛋白的核心以消除任何天然孔可稳定融合前或中间形式的F蛋白，因此不利于所述融合后构型。制备组合物的方法 本发明涉及制备组合物的方法，以及含RSV F蛋白具体为可溶性RSV F胞外域多肽的组合物，包括免疫原性组合物。所述RSV F胞外域多肽优选为单一形式，如未切割单体、未切割三聚体、切割三聚体、切割三聚体的玫瑰花结或为这些形式的子集之间的动态平衡(如未切割单体和未切割三聚体之间的平衡)。本发明提供数种优点。例如，如本文所述，本发明提供生产组合物的方法，所述组合物含主要需要形式的RSV F蛋白，或单一需要形式的RSV F蛋白如未切割单体、未切割三聚体、切割三聚体、切割三聚体的玫瑰花结、这些形式的子集之间的动态平衡(如未切割单体和未切割三聚体之间的平衡)或需要形式的RSV F蛋白混合物。这些组合物类型可用于各种用途，如生产可用于生产疫苗的免疫原性组合物。免疫原性组合物中存在RSV F的单一需要形式，或已知形式之间的动态平衡提供了更易预测的配制、可溶性和稳定性，将所述组合物给予对象时还提供了更易预测的免疫应答。在宿主细胞中通过常规重组表达生产RSV F蛋白胞外域多肽时，该宿主细胞生产期间所述多肽在分泌到培养基之前在约109/110位和约136/137位的弗林蛋白酶切割位置被切割。所述宿主细胞对所述多肽的切割允许RSV F蛋白胞外域多肽重折叠，这导致所述疏水融合肽的暴露。因此，由于存在暴露的融合肽，所述切割的RSV F蛋白胞外域多肽形成玫瑰花结并与源自所述宿主细胞和培养基的脂质和脂蛋白结合。实际上，在昆虫细胞中生成并根据HIS6标记纯化的经切割RSV F胞外域的电子显微镜检查显示所述多肽具有与融合后形式一致的拐杖形状并结合似乎是残留的细胞碎片。因此，玫瑰花结和其他形式以及RSV F蛋白胞外域多肽构型的高纯度制品不易通过宿主细胞中常规重组表达获得。生产切割的RSV F蛋白胞外域多肽的方法在一个方面，本发明是制备含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物的方法。总体上，所述方法涉及提供未切割的RSV F蛋白胞外域多肽且随后切割其以产生F1亚基和F2亚基。如本文所述，未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地纯化并用合适的方法如尺寸排阻色谱法从污染脂质和脂蛋白中分离。不希望受任何具体理论的限制，认为疏水融合肽不在所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽中暴露，因此所述未切割多肽不与脂质和脂蛋白污染物结合。如本文进一步所述，未切割的RSV F蛋白胞外域可进行切割以产生F1和F2M基，其可被纯化为三聚体、三聚体的玫瑰花结、或三聚体与三聚体的玫瑰花结的混合物。未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可用任何合适的方法生产。例如，通过在生产所述RSV F蛋白胞外域多肽时在不含活性弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶的宿主细胞中重组生成。可用各种方法实现该生产方法，如在进行突变以防止弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶表达(有条件或完全地“敲除”)的重组宿主细胞中生产，和降低或防止弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶在所述宿主细胞中表达的各种方法，例如用RNA干扰或其他相似方法，或用所述蛋白酶的抑制剂在宿主细胞中抑制弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶活性。未切割的RSV F蛋白胞外域多肽优选用编码RSV F蛋白胞外域的构建体的重组表达生产，其中所述弗林蛋白酶切割位置的氨基酸序列被改变，从而所述RSVF蛋白胞外域多肽由生成所述未切割多肽的宿主细胞分泌。所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可用任何合适的宿主细胞生产，例如昆虫细胞(如埃及伊蚊、苜蓿银纹夜蛾、家蚕蛾、果蝇、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾)、哺乳动物细胞(如人、非人灵长类、马、牛、羊、狗、猫和啮齿类(如仓鼠))、禽类细胞(如鸡、鸭、鹅)、细菌(如大肠杆菌、枯草杆菌和链球菌属)、酵母细胞(如酿酒酵母、白色念珠菌、麦芽糖假丝酵母、多形汉森酵母、脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、季也蒙毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母和解脂耶氏酵母)、四膜虫细胞(如嗜热四膜虫)或其组合。本领域熟知许多合适的昆虫细胞和哺乳动物细胞。合适的昆虫细胞包括例如，Sf9细胞、Sf21细胞、Tn5细胞、Schneider S2细胞和High Five细胞(源自亲本粉纹夜蛾BTI-TN-5B1-4细胞系的克隆分离物(英杰公司(Invitrogen)))。合适的哺乳动物细胞包括例如，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾细胞(HEK293细胞，通常由剪切的腺病毒5型 DNA转化成)、NIH-3T3细胞、293-T细胞、Vero细胞、HeLa细胞、PERC. 6细胞(ECACC保藏号96022940)、H印 G2 细胞、MRC-5 (ATCC CCL-171)、WI-38 (ATCC CCL-75)、胎猕猴肺细胞细胞(ATCC CL-160)、Madin-Darby 牛肾(“MDBK”)细胞、Madin-Darby 狗肾(“MDCK”)细胞(如MDCK(NBL2)、ATCC CCL34 ;或1 0( 33016,DSM ACC 2219)、幼仓鼠肾(BHK)细胞如BHK21-F、HKCC细胞等。合适的禽类细胞包括例如，鸡胚胎干细胞(如EBx 细胞)、鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎生殖细胞、鸭细胞(如，例如在Vaccine27 :4975-4982(2009)和W02005/042728中描述的AGE1. CR和AGE1. CR. pIX细胞系(专业生物基因公司(ProBioGen) ))、EB66细胞
坐寸o合适的昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统为本领域技术人员已知，描述于例如Summers 和 Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555(1987)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法以药盒形式购自加利福尼亚州圣迭戈的英杰公司等。禽类细胞表达系统也为本领域技术人员已知，描述于例如美国专利号5，340，740 ；5，656，479 ;5，830，510 ;6，114，168 ;和 6，500，668 ;欧洲专利号 EP 0787180B ;欧洲专利申请号EP03291813. 8 ；W0 03/043415 ;和冊03/076601。相似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统也为本领域已知，描述于例如Yeast Genetic Engineering(《酵母遗传工程》)(Barr等编著，1989)伦敦，巴特沃思公司(Butterworths)。通常，改变未切割的RSV F蛋白胞外域的氨基酸序列以防止在约109/110位和约136/137位的弗林蛋白酶切割位置切割，但其含天然产生或引入的蛋白酶切割位置，切割时产生F1亚基和F2亚基。例如，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可具有改变的氨基酸序列以防止在约109/110位和约136/137位的弗林蛋白酶切割位置的切割，但其从约101位到约161位含天然产生或引入的蛋白酶切割位置。本领域普通技术人员可容易地设计并构想会使宿主细胞生产并表达未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的各种具体的氨基酸序列，包括没有在约109/110位和约136/137位的弗林蛋白酶切割位置切割的氨基酸序列。通常，独立替换或缺失约109/110位和约136/137位的弗林蛋白酶切割位置部分或邻近其的一种或多种氨基酸。已知适于阻止RSV F蛋白胞外域多肽切割的一些氨基酸替代和缺失。例如，抑制109/110切割的R108N、R109N、R108N/R109N的替换，抑制136/137切割的K131Q替换或131-134位氨基酸的缺失已在 Gonzalez-Reyes 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,98 :9859-9864(2001)中描述。已描述含氨基酸替换R108N/R109N/K131Q/R133Q/R135Q/R136Q的未切割的RSV F胞外域多肽。Ruiz-Arguello 等，J. Gen. Virol.，85 :3677687 (2004)。如本文详细描述，导致所述 RSV F胞外域多肽从未切割的宿主细胞中分泌的额外RSV F蛋白氨基酸序列含改变的弗林蛋白酶切割位置，如改变约106-109位和约133-136位的氨基酸序列。所述改变的弗林蛋白酶切割位置在约106-109位含至少一种氨基酸替换或缺失，和在约133-136位含至少一种氨基酸替换或缺失。相似地，含蛋白酶切割位置(如天然产生或引入的)的未切割RSV F蛋白胞外域多肽的各种具体氨基酸序列可能存在并可被容易地设计和构想，所述序列切割时产生含F1的第一亚基和含F2的第二亚基。例如，从约101位到约161位的RSVF蛋白的氨基酸序列含胰蛋白酶切割位置，且一种或多种所述胰蛋白酶切割位置可被胰蛋白酶切割以生成F1和F2亚基。如果需要，一种或多种合适的蛋白酶识别位置可被引入所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，例如约101位到约161位之间。所引入的蛋白酶识别位置可用所述合适的蛋白酶切割以产生F1和F2亚基。将蛋白酶识别位置引入未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的 氨基酸序列时，优选所述位置被不切割天然产生的RSV F蛋白胞外域的蛋白酶识别。本发明这方面的方法包括a)提供含蛋白酶切割位置的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，其切割时产生F1和F2亚基，和b)用识别所述蛋白酶切割位置的蛋白酶切割所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。通常，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改变的弗林蛋白酶切割位置，且所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主细胞，该细胞生成在约106-109位和约131-136位的弗林蛋白酶切割位置没有被切割的多肽。所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可纯化到需要的程度。例如，所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可作为基本未加工(如未加工或仅澄清)或者部分或基本纯化的形式的细胞裂解物、细胞匀浆或细胞条件培养基提供。在具体例子中，所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在选自下组的细胞条件培养基中提供昆虫细胞条件培养基、哺乳动物细胞条件培养基、禽类细胞条件培养基、酵母细胞条件培养基、四膜虫细胞条件培养基、和其组合。通常优选纯化所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，例如纯化为至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或基本均质。如本文所述，未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地从脂质和脂蛋白中纯化，而常规生产的RSV F蛋白的切割形式与脂质和脂蛋白污染物共纯化。因此，提供纯化的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽时，本方法可用于容易地生产含切割的RSV F蛋白胞外域而基本不含脂质或脂蛋白的组合物。本领域熟知并常用蛋白酶切割多肽的合适方法。通常，待切割的多肽与足量的蛋白酶在适于切割所述多肽的条件(如pH、多肽和蛋白酶浓度、温度)下结合。许多合适的蛋白酶可市售获得，且已知许多蛋白酶进行多肽切割的合适条件。如果需要，切割的RSV F蛋白胞外域多肽可在蛋白酶切割后纯化。本方法的一个实施例中，提供含完整融合肽的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，如137-154位氨基酸都未替换或缺失的未切割RSV F蛋白胞外域多肽。在一些实施方式中，纯化所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。切割所提供含完整融合肽的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，且切割导致已切割RSV F蛋白胞外域多肽三聚体形成玫瑰花结。如果需要，所述玫瑰花结可用任何合适的方法如尺寸排阻色谱进一步纯化。本方法的另一实施例中，提供含已改变融合肽的未切割RSV F蛋白胞外域多肽，如约137-152氨基酸、约137-153氨基酸、约137-145氨基酸或约137-142氨基酸缺失的未切割RSV F蛋白胞外域多肽。还描述了其他合适的融合肽缺失，如137-146位氨基酸的缺失。Ruiz-Arguello 等，J. Gen. Virol. ,85 :3677-3687 (2004)。 在一些实施方式中，纯化所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。切割所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，且切割导致已切割RSV F蛋白胞外域多肽形成三聚体。如果需要，所述三聚体可用任何合适的方法如尺寸排阻色谱进一步纯化。在本方法的具体实施例中，所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽含至少一种选自furdel和delp23 furdel的多肽(如均质胰蛋白酶可切割的furdel、均质胰蛋白酶可切割的delp23 furdel或胰蛋白酶可切割的furdel和胰蛋白酶可切割的delp23 furdel的混合物)。例如用胰蛋白酶切割所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，且切割导致形成RSV F蛋白胞外域多肽的切割三聚体、切割三聚体的玫瑰花结或切割三聚体和切割三聚体的玫瑰花结的组合。如果需要，所述切割三聚体和/或切割三聚体的玫瑰花结可用任何合适的方法如尺寸排阻色谱进一步纯化。生产未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的方法在另一方面，本发明是生产含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物的方法。总体上，本方法涉及提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，如细胞裂解物、细胞匀浆或细胞条件培养基，然后纯化所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。如本文所述，已发现纯化的未切割RSV F蛋白胞外域多肽单体能自我结合以形成未切割单体，以及存在未切割单体和未切割三聚体的混合物或未切割单体和未切割三聚体之间的平衡。不希望受任何具体理论的限制，认为所述平衡有利于所述单体，但浓缩溶液中所述平衡会移向所述三聚体。本发明这方面的方法包括a)提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，如细胞裂解物、细胞匀浆或细胞条件培养基jPb)从所述生物材料中纯化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽单体、三聚体或单体和三聚体的组合。在一些实施方式中，纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体、或纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚体、或纯化单体和
三聚体。通常，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改变的弗林蛋白酶切割位置，且所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主细胞，该细胞生成约101位-约161位没有被切割(包括106-109位和131-136位的弗林蛋白酶切割位置)的多肽。在更具体的实施方式中，含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料包括至少一种选自下组的多肽furmt、furdel> delp21 furx、delp23 furx、delp21 furdel> delp23 furdel 和可用 Xa 因子切割的Xa因子构建体。在一些实施方式中，所述RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改变的弗林蛋白酶切割位置，且约101位-约161位之间的其他蛋白酶切割位置(如胰蛋白酶切割位置)被改变或缺失以阻止蛋白酶(如胰蛋白酶)切割。例如，已知胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸残基之后切割。在某些优选实施方式中，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改变的弗林蛋白酶切割位置，约101位和约161位之间存在的一种或多种赖氨酸和/或精氨酸残基(如所有赖氨酸和精氨酸残基)缺失或被非赖氨酸或精氨酸的氨基酸替换，所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主细胞，该细胞生成约101位和约161位之间没有切割的多肽，且所述RSVF蛋白胞外域多肽在约101位和约161位之间没有被胰蛋白酶切割。用千分之一体积的胰蛋白酶溶液(牛血浆胰蛋白酶在25mM Tris pH7. 5,300mM NaCl中稀释为lmg/ml浓度；消化反应中的最终质量比胰蛋白酶RSV F胞外域为0. 001 I ;胰蛋白酶以10-15BAEE单位/毫克蛋白使用)在37°C处理lmg/ml RSV F蛋白胞外域多肽溶液(在25mM Tris pH7. 5,300mM NaCl中稀释)I小时的时候，所述RSV F蛋白胞外域多肽优选没有被胰蛋白酶切割。如果需要，所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽(如含改变的弗林蛋白酶切割位置的多肽和含改变的弗林蛋白酶切割位置和改变的胰蛋白酶切割位置的多肽)还可含改变的融合肽，如未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，其中例如约氨基酸137-152缺失、约氨基酸137-154缺失、约氨基酸137-145缺失或约氨基酸137-142缺失。还描述了其他合适的融合肽缺失，如137-146位氨基酸的缺失。Ruiz-Arguello等，J. Gen. Virol. ,85 3677-3687(2004)。在具体实施方式
中，本发明包括a)提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，如细胞裂解物、细胞匀浆或细胞条件培养基，其中所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改变的弗林蛋白酶切割位置，约101位和约161位之间存在的一种或多种赖氨酸和精氨酸残基缺失或被非赖氨酸或精氨酸的氨基酸替换，所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主细胞，该细胞生成约101位和约161位之间没有切割的多肽，且所述RSVF蛋白胞外域多肽在约101位和约161位之间没有被胰蛋白酶切割；和b)从所述生物材料中纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体、三聚体或单体和三聚体的组合。在更具体的实施例中，含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料包括至少一种选自下组的多妝Furx、Furx R113Q K123N K124N、delp21 furx 和 delp23furx。在其他具体实施方式
中，本方法包括a)提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，其中所述融合肽经突变(如至少部分所述融合肽缺失)，如细胞裂解物、细胞匀浆或细胞条件培养基；和b)从所述生物材料中纯化所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可含改变的弗林蛋白酶切割位置，且所述RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主细胞，该细胞生成约101位-约161位没有被切割(包括106-109和131-136位的弗林蛋白酶切割位置上)的多肽。如果需要，具有改变的弗林蛋白酶切割位置的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽还在约101位和约161位之间含改变或缺失的其他蛋白酶位置(如胰蛋白酶切割位置)以防止蛋白酶(如胰蛋白酶)切割。例如，约101位和约161位之间存在的一种或多种赖氨酸和/或精氨酸残基(如所有赖氨酸和精氨酸残基)缺失或被非赖氨酸或精氨酸的氨基酸替换，且所述RSV F蛋白胞外域多肽在约101位和约161位之间没有被胰蛋白酶切割。 所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体、三聚体以及单体和三聚体的组合可纯化到需要的程度。通常优选纯化所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体或三聚体，例如纯化为至少约75 %、至少约80 %、至少约85 %、至少约90 %、至少约95 %或基本均质。如本文所述，未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地用例如尺寸排阻色谱法从脂质和脂蛋白中纯化。因此，本方法可用于容易地生产含切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体、三聚体或单体和三聚体的组合而基本不含脂质和脂蛋白的组合物。在一个实施例中，所述方法包括提供昆虫细胞条件培养基、哺乳动物细胞条件培养基、禽类细胞条件培养基、酵母细胞条件培养基、四膜虫细胞条件培养基或其组合。在一些实施方式中，纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚体。在其他实施方式中，纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体。在其他实施方式中，纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体和三聚体。
生产具有已改变融合肽的切割的RSV F蛋白胞外域多肽的方法在一个方面，本发明是制备含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物的方法，所述多肽含改变的融合肽。宿主细胞中表达不含改变的弗林蛋白酶位置切割位置的RSV F蛋白胞外域多肽时，所述宿主细胞加工所述多肽，部分通过在约109/110位和约136/137位的弗林蛋白酶位置切割所述多肽以产生F1和F2亚基。加工的多肽可分泌到所述培养基中且可作为结合的F1-F2亚基(如二硫化物结合的F1和F2亚基)回收，其可通过聚集暴露的融合肽来形成三聚体的玫瑰花结。含改变的融合肽的RSV F蛋白胞外域多肽可在宿主细胞中生成并作为结合的F1-F2亚基分泌，且优选不聚集为玫瑰花结或与脂质或脂蛋白污染物聚集。不希望受限于任何特定的理论，认为由于所述改变的融合肽不介导聚集，所述多肽不形成玫瑰花结或与脂质和脂蛋白污染物结合。本发明这方面的方法包括a)提供含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，其中所述多肽含改变的融合肽(如至少部分所述融合肽缺失)，如细胞裂解物、细胞匀浆或细胞条件培养基；和幻从所述生物材料中纯化切割的RSV F蛋白胞外域多肽。所述纯化的经切割RSV F蛋白胞外域多肽可纯化为切割三聚体、切割三聚体的玫瑰花结或切割三聚体和切割三聚体的玫瑰花结的混合物。含已改变融合肽的合适的RSV F蛋白胞外域多肽在约109/110和约136/137含有可切割的弗林蛋白酶切割位置，还含有本文所述的改变的融合肽。例如，本方法中可用缺失约137-152氨基酸、缺失约137-153氨基酸、缺失约137-145氨基酸、缺失约137-146氨基酸、缺失约137-142氨基酸的RSV F蛋白胞外域多肽。在具体实施例中，含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料；至少包括所述融合肽缺失I。所述切割的RSV F蛋白胞外域多肽(如切割三聚体或切割三聚体和切割三聚体的玫瑰花结的混合物)可纯化到需要的程度。通常优选纯化所述切割的RSV F蛋白胞外域多肽，例如纯化为至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或基本均质。如本文所述，含已改变融合肽的切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地用例如尺寸排阻色谱法从脂质和脂蛋白中纯化。因此，本方法可用于容易地生产含切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚体、切割三聚体的玫瑰花结或切割三聚体和切割三聚体的玫瑰花结的组合而基本不含脂质和脂蛋白的组合物。生产具有C末端弗林蛋白酶突变的RSV F蛋白胞外域多肽的方法在另一方面，本发明是制备含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物的方法和制备切割的RSV F蛋白胞外域多肽的方法。不希望受限于任何具体理论，认为C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在约109/110位的弗林蛋白酶切割位置而不是约136/137位的弗林蛋白酶切割位置被生产所述蛋白的细胞切割，其作为结合F2亚基的F1亚基被分泌到培养基中。还认为所述疏水融合肽不在C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽中暴露，因此C末端未切割的多肽不与脂质和脂蛋白污染物结合。如本文进一步所述，C末端未切割的RSV F蛋白胞外域还可被切割以产生结合F2亚基的F1亚基，其中氨基末端为110位-约161位。所述F1和F2亚基，可被纯化为三聚体、三聚体的玫瑰花结或三聚体和三聚体的玫瑰花结的混合物。
通常，改变C末端未切割的RSV F蛋白胞外域的氨基酸序列以防止在约136/137位的弗林蛋白酶切割位置的切割，但其含天然产生或引入的蛋白酶切割位置，切割时产生F1亚基和F2亚基，所述F1亚基中氨基末端从110位到约161位。例如，所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可具有改变的氨基酸序列以防止在约136/137位的弗林蛋白酶切割位置的切割，但其从约101位到约161位含一种或多种天然产生或引入的蛋白酶切割位置。在具体实施例中，改变所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列以防止在约136/137位的弗林蛋白酶切割位置的切割，但其在约109/110位含天然产生的弗林蛋白酶切割位置。本领域普通技术人员可容易地设计并构想会使宿主细胞生产并表达C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的各种具体的氨基酸序列，包括没有在约136/137位的弗林蛋白酶切割位置切割的氨基酸序列。通常，独立替换或缺失约136/137位的弗林蛋白酶切割位置部分或邻近其的一种或多种氨基酸。本文描述了防止约136/137位切割的合适的氨基酸替代和缺失。例如，可使用K131Q替代、131-134位的氨基酸缺失或K131Q/R133Q/R135Q/R136Q替代，这些各自抑制136/137上的切割。在某些实施方式中，C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在约133-136位包括至少一种氨基酸替代或缺失。相似地，含蛋白酶切割位置(如天然产生或引入的)的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的各种具体氨基酸序列可能存在并可容易地设计和构想，所述序列切割时产生含F1的第一亚基和含F2的第二亚基。例如，从约101位到约161位的RSV F蛋白的氨基酸序列含胰蛋白酶切割位置，且一种或多种所述胰蛋白酶切割位置可被胰蛋白酶切割以生成F1和F2亚基。如果需要，一种或多种合适的蛋白酶识别位置可引入所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，例如约101位到约161位之间。所引入的蛋白酶识别位置可用所述合适的蛋白酶切割以产生F1和F2亚基。将蛋白酶切割位置引入C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列时，优选所述位置被不切割天然产生的RSV F蛋白胞外域的蛋白酶识别。C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可用任何合适的方法生产。优选的方法是通过编码RSV F蛋白胞外域的构建体的重组表达，其中约136/137位的弗林蛋白酶切割位置的氨基酸序列被改变，从而所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽由生成约136/137位的弗林蛋白酶切割位置没有被切割的多肽的宿主细胞分泌。所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽优选由将其生成为结合F2亚基的F1亚基的宿主细胞分泌，其中F1亚基的氨基末端为132位-约161位，而不是137位。所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可用本文所述任何合适的宿主细胞生成。本发明这方面的一种方法包括a)提供含136/137位弗林蛋白酶切割位置改变的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，且所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽分泌自宿主细胞，该细胞以结合含F1的亚基但136/137位没有被切割的F2片段的形式生产所述多肽，和b)用在约101-161位之间的位置切割RSV F蛋白胞外域的蛋白酶切割所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，从而生产所述组合物。在具体实施方式
中，步骤b)包括用在约101-132位、或约132-161位或约110-132位之间的位置切割RSV F蛋白胞外域的蛋白酶切割所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。或者或此外，在一些实施方式中，所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在136/137位含改变的弗林蛋白酶切割位置，条件为该改变的弗林蛋白酶切割位置不缺失氨基酸131-134.在具体实施例中，含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料；至少包括所述N末端弗林蛋白酶多肽。
所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可纯化到需要的程度。例如，所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可在基本未加工(如未加工或仅澄清)或者部分或基本纯化形式的细胞裂解物、细胞匀浆或细胞条件培养基中提供。在具体例子中，所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在选自下组的细胞条件培养基中提供昆虫细胞条件培养基、哺乳动物细胞条件培养基、禽类细胞条件培养基、酵母细胞条件培养基、四膜虫细胞条件培养基、和其组合。通常优选纯化所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，例如纯化为至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或基本均质。如本文所述，C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地从脂质和脂蛋白中纯化，而常规生产的RSV F蛋白的切割形式与脂质和脂蛋白污染物共纯化。因此，提供纯化的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽时，本方法可用于容易地生产含切割的RSV F蛋白胞外域而基本不含脂质或磷脂的组合物。本领域熟知并常用蛋白酶切割多肽的合适方法。通常，待切割的多肽与足量的蛋白酶在适于切割所述多肽的条件(如pH、多肽和蛋白酶浓度、温度)下结合。许多合适的蛋白酶可市售获得，且已知许多蛋白酶进行切割的合适条件。如果需要，所述RSV F蛋白胞外域多肽可在蛋白酶切割后纯化。本方法的一个实施例中，提供含完整融合肽的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，如137-154位氨基酸都未被替换或缺失的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。本方法的另一实施例中，提供含已改变融合肽的C末端未切割的RSVF蛋白胞外域多肽，如约137-152氨基酸、约137-153氨基酸、约137-145氨基酸或约137-142氨基酸缺失的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。还描述了其他合适的融合肽缺失，如137-146位的氨基酸缺失。Ruiz-Arguello 等，J. Gen. Virol. ,85 :3677-3687(2004)。在一些实施方式中，纯化所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。切割所提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，且切割引起已切割RSV F蛋白胞外域多肽形成三聚体。如果需要，所述三聚体可用任何合适的方法如尺寸排阻色谱进一步纯化。在本方法的具体实施例中，所提供的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽至少含所述N末端弗林蛋白酶多肽(图I)。例如用胰蛋白酶切割所提供的C末端未切割的RSVF蛋白胞外域多肽，且切割引起RSV F蛋白胞外域多肽的切割三聚体、切割三聚体的玫瑰花结或切割三聚体和切割三聚体的玫瑰花结的组合的形成。如果需要，所述切割三聚体和/或切割三聚体的玫瑰花结可用任何合适的方法如尺寸排阻色谱进一步纯化。本发明这方面的另一方法包括a)提供含在136/137位含改变的弗林蛋白酶切割位置的C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料如细胞裂解物、细胞匀浆或细胞条件培养基，且所述可溶性RSV F蛋白胞外域多肽分泌自以结合含F1的亚基但136/137位没有被切割的F2片段的形式生成该多肽的细胞，条件为该改变的弗林蛋白酶切割位置不缺失氨基酸131-134 ;和b)从所述生物材料中纯化所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽，从而生产所述组合物。所述Fl亚基的氨基末端优选为约110位-约132位。所述匕亚基的氨基末端更优选为约110位。所述F1亚基的氨基末端特别优选不在137位。在具体实施例中，含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料；至少包括所述N末端弗林蛋白酶多肽。如果需要，所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽还在约101位和约161位之间含改变或缺失的其他蛋白酶位置(如胰蛋白酶切割位置)以防止蛋白酶(如胰蛋白酶)切割。例如，约101位和约161位之间存在的一种或多种赖氨酸和/或精氨酸残基(如所有赖氨酸和精氨酸残基)缺失或被非赖氨酸或精氨酸的氨基酸替换，且所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在约101位和约161位之间没有被胰蛋白酶切割。所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可含本文所述的完整融合肽或改变的融合肽。所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽如单体、三聚体以及单体和三聚体的组合可纯化到需要的程度。通常优选纯化所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体或三聚体，例如纯化为至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或基本均质。如本文所述，C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽可容易地用例如尺寸排阻色谱法从脂质和脂蛋白中纯化。因此，本方法可用于容易地生产含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽如单体、三聚体或单体和三聚体的组合而基本不含脂质和脂蛋白的组合物。在本发明的具体实施例中，所述C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽至少含所述N末端弗林蛋白酶多肽(图I)。在一个实施例中，所述方法包括提供昆虫细胞条件培养基、哺乳动物细胞条件培养基、禽类细胞条件培养基、酵母细胞条件培养基、四膜虫细胞条件培养基或其组合。在一些实施方式中，纯化C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚体。在其他实施方式中，纯化C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体。在其他实施方式中，纯化C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体和三聚体。自复制RNA本文所述RSV-F多肽可通过在对象细胞中表达编码该多肽的重组核酸来生产。能给予对象以引起RSV-F多肽生产的优选核酸为自复制RNA分子。本发明的自复制RNA分子是基于RNA病毒的基因组RNA，但缺失编码一种或多种结构蛋白的基因。所述自复制RNA分子能经翻译生成所述RNA病毒的非结构蛋白和自复制RNA编码的异源蛋白。所述自复制RNA通常含至少一种或多种选自下组的基因病毒复制酶、病毒蛋白酶、病毒解旋酶和其他非结构性病毒蛋白，还含有5’-和3’-末端顺式激活复制序列和(如果需要)编码所需氨基酸序列(如蛋白、抗原)的异源序列。引导所述异源序列表达的亚基因组启动子可包括在所述自复制RNA中。如果需要，所述异源序列可与所述自复制RNA中的其他编码区域在框内融合和/或可在内部核糖体进入位点(IRES)的控制下。
本发明的自复制RNA分子可设计成使所述自复制RNA分子不能诱导感染性病毒颗粒的生成。这可通过例如省略所述自复制RNA中的一种或多种编码结构蛋白的病毒基因实现，所述蛋白是病毒颗粒生成所必需的。例如，所述自复制RNA分子基于a病毒如辛德毕斯病毒(SIN)、西门利克森林病毒和委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)时，可省略一种或多种编码病毒结构蛋白如衣壳或包膜糖蛋白的基因。如果需要，本发明的自复制RNA分子可设计成诱导减毒或强毒的感染性病毒颗粒的生成，或生成能进行一轮后续感染的病毒颗粒。自复制RNA分子在甚至无任何蛋白下递送到脊椎动物细胞时，能通过其自身(或其自身的反义拷贝)转录引导生成多种子RNA。所述自复制RNA递送到细胞后能直接翻译，且该翻译提供RNA依赖性RNA聚合酶，所述酶然后从该递送RNA中生成转录本。因此所递送RNA引导多种子RNA的生成。这些转录本相对所递送RNA为反义且可自身翻译以提供基因产物的原位表达，或可转录以进一步提供与该递送RNA同义的转录本，其经翻译提供编码的RSV F多肽的原位表达。实现自复制的一种合适系统为使用基于a病毒的RNA复制子。这些+链复制子在递送到细胞后翻译以得到复制酶(或复制酶-逆转录酶)。这些复制酶翻译为自切割产生复制复合物的聚蛋白，所述复合物形成所述+链递送RNA的基因组-链拷贝。这些-链转录本可自我转录以进一步得到所述+链亲本RNA的拷贝和得到编码所述RSV-F多肽的亚基因组转录本。因此所述亚基因组转录本的翻译引起所述感染细胞原位表达RSV-F多肽。合适的a病毒复制子可使用来自辛德毕斯病毒、西门利克森林病毒、东部马脑炎病毒、委 内瑞拉马脑炎病毒等的复制酶。因此优选的自复制RNA分子编码⑴可从所述自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶和(ii)RSV-F多肽。所述聚合酶可为a病毒复制酶例如包括a病毒蛋白nsP40尽管除了所述非结构复制酶聚蛋白，天然a病毒基因组还编码结构病毒体蛋白，但本发明中基于a病毒的自复制RNA分子优选不编码a病毒结构蛋白。因此所述自复制RNA可引导细胞中基因组RNA拷贝的自我生成，但不引导含RNA的a病毒病毒体的生成。不能生成这些病毒体说明所述自复制RNA分子不像野生型a病毒，其自身不能以感染形式永存。野生型病毒永存必需的a病毒结构蛋白在本发明的自复制RNA中缺失，且他们的位置被编码所需基因产物的基因占据，从而所述亚基因组转录本编码所需要的基因产物而不是所述结构a病毒病毒体蛋白。因此本发明有用的自复制RNA分子可具有两个开放阅读框。第一(5')开放阅读框编码复制酶；第二(3')开放阅读框编码RSV-F多肽。在一些实施方式中，所述RNA可具有额外的(下游)开放阅读框如编码其他需要的基因产物。自复制RNA分子可具有与所述编码的复制酶相容的5'序列。在一个方面，所述自复制RNA分子源自或基于a病毒。在其他方面，所述自复制RNA分子源自或基于非a病毒的病毒，优选正链RNA病毒，更优选小RNA病毒、黄病毒、风疹病毒、瘟病毒、丙型肝炎病毒、萼状病毒或冠状病毒。合适的野生型a病毒序列已知且可从序列保藏所如马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)获得。合适的a病毒的代表示例包括奥拉病毒(ATCC VR-368)、贝巴鲁病毒(ATCC VR-600, ATCC VR-1240)、犰狳病毒(ATCC VR-922)、基孔肯雅病毒(ATCCVR_64、ATCC VR-1241)、东方马脑脊髓炎病毒(Eastern equine encephalomyelitis virus)(ATCC VR-65、ATCC VR-1242)、摩根堡病毒(ATCC VR-924)、格塔病毒(ATCC VR-369、ATCCVR-1243)、克泽拉格齐病毒(ATCC VR-927)、马亚罗(Mayaro) (ATCC VR-66)、马亚罗病毒(ATCC VR-1277)、米德尔堡病毒(Middleburg) (ATCC VR-370)、穆坎博病毒(ATCC VR-580、ATCC VR-1244)、恩杜姆病毒(Ndumu) (ATCC VR-371)、皮春纳病毒(ATCC VR-372、ATCCVR-1245)、罗斯河病毒(ATCC VR-373、ATCC VR-1246)、西门利克森林病毒(ATCC VR-67、ATCC VR-1247)、辛德比斯病毒(ATCC VR-68、ATCC VR-1248)、托纳特(ATCC VR-925)、特里尼蒂病毒(ATCC VR-469)、乌纳病毒(ATCC VR-374)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(ATCCVR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249、ATCC VR-532)、西马脑脊髓炎病毒(ATCC VR-70, ATCC VR-125U ATCC VR-622, ATCC VR-1252)、沃达罗河病毒(ATCC VR-926)和 Y-62-33(ATCC VR-375)。所述自复制RNA可与递送系统关联。所述自复制RNA可和或不 和佐剂一起递送。RNA递送系统本发明的自复制RNA适于以各种形式递送，如裸露RNA递送或与有助于进入细胞的脂质、聚合物或其他化合物结合。本发明的自复制RNA分子可用任何合适的技术如通过直接注射、微注射、电穿孔、脂质转染、生物裂解(biolystics)等引入祀细胞或对象。所述自复制RNA分子还可通过受体介导的胞吞作用导入细胞。参见例如美国专利第6,090,619号；Wu 和 Wu，J. Biol. Chem.，263 :14621(1988);和 Curiel 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88 :8850 (1991)。例如，美国专利第6，083，741号公开了通过将核酸连接聚阳离子组分(如具有3-100个赖氨酸残基的聚L赖氨酸)来导入外源核酸到哺乳动物细胞，所述聚阳离子组分自身偶联整联蛋白受体结合组分(如具有序列Arg-Gly-Asp的环肽)。本发明的自复制RNA分子可通过两亲物递送入细胞。参见例如，美国专利号6，071，890。通常，核酸分子可形成具有阳离子两亲物的复合物。与该复合物接触的哺乳动物能容易地将其吸收。所述自复制RNA可作为裸露RNA递送(如仅作为RNA水溶液)，但为了增强进入细胞以及随后的细胞间效应，所述自复制RNA优选与递送系统如微粒或乳液递送系统组合给予。本领域技术人员熟知大量递送系统。所述递送系统包括例如基于脂质体的递送(Debs 和 Zhu (1993) WO 93/24640 ;Mannino 和 Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7)682-691 ；Rose 美国专利号 5，279，833 ；Brigham(1991)W0 91/06309 ;和 Feigner 等(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :7413-7414)，以及病毒载体的应用(如腺病毒(参见例如Berns 等(1995)Ann. NY Acad. Sci. 772 :95-104 ；Ali 等(1994)Gene Ther.I :367-384 ；和Haddada 等(1995)Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199(Pt 3) :297-306 for review)> 乳头瘤病毒、逆转录病毒(参见例如 Buchscher 等(1992) J. Virol. 66(5)2731-2739 Johann等(1992) J. Virol. 66(5) :1635-1640(1992) ;Sommerfelt 等，(1990) Virol. 176 :58-59 ；Wilson 等(1989) J. Virol. 63 :2374-2378 ；Miller 等，J. Virol. 65 :2220-2224 (1991)；Wong-Staal 等，PCT/US94/05700,和 Rosenburg 和 Fauci (1993), FundamentalImmunology (《基础免疫学》)，第三版Paul (编辑)纽约雷文出版社有限公司(Raven Press,Ltd.)和其参考文献，和Yu等，Gene Therapy (《基因治疗》)(1994)同上)、和腺伴随病毒载体(参见 West 等(1987) Virology 160 :38-47 ；Carter ^ (1989)美国专利号 4，797，368 ；Carter 等 WO 93/24641 (1993) ；Kotin(1994)Human Gene Therapy (《人类基因治疗》)5:793-801 ；Muzyczka(1994) J. Clin. Invst. 94 :1351 和 Samulski (同上)的 an overview ofAAV vectors (《AAV 载体概述》)；还参见 Lebkowski,美国专利号 5，173，414 ;Tratschin等(1985)Mol. Cell. Biol. 5(11) :3251-3260 ;Tratschin，等(1984)Mol. Cell. Biol.,
4:2072-2081 ；Hermonat 和 Muzyczka(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81 :6466-6470 ；McLaughlin 等(1988)和 Samulski 等(1989) J. Virol. ,63 :03822-3828)等。三种特别有用的递送系统是⑴脂质体(ii)非毒性和可生物降解聚合物微粒(iii)阳离子亚微米水包油乳液。脂质体 水环境下各种两亲性脂质能形成双分子层以包埋含RNA的水核心形成脂质体。这些脂质可具有阴离子、阳离子或两性离子亲水头基。从阴离子磷脂形成脂质体可追溯到上世纪六十年代，而形成阳离子脂质体的脂质从上世纪九十年代已开始研究。一些磷脂为阴离子型而其他为两性离子型。合适类型的磷脂包括但不限于磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和表20所列的一些有用的磷脂。有用的阳离子脂质包括但不限于二油酰-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1，2-二硬脂氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、I，2- 二油稀氧基-N,N 二甲基_3_氛基丙烧(DODMA) >1,2- 二亚油氧基-N,N- 二甲基_3_氛基丙烷(DLinDMA)、1，2-二亚麻氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)。两性脂质包括但不限于酰基两性脂质和醚基两性脂质。有用的两性脂质示例为DPPC、D0PC和十二烷基磷酸胆碱。所述脂质可为饱和或不饱和。脂质体可从单一脂质或脂质混合物形成。混合物可包括(i)阴离子脂质混合物(ii)阳离子脂质混合物(iii)两性脂质混合物(iv)阴离子脂质和阳离子脂质混合物(V)阴离子脂质和两性脂质混合物(Vi)两性脂质和阳离子脂质混合物或(Vii)阴离子脂质、阳离子脂质和两性脂质混合物。相似地，混合物可包括饱和和不饱和脂质。例如，混合物可包括DSPC(两性、饱和)、DlinDMA(阳离子型、不饱和)和/或DMPG(阴离子型、饱和)。使用脂质混合物时，不是混合物中的所有组成脂质需要为两亲性，例如一种或多种两亲性脂质可与胆固醇混合。脂质的亲水部分可PEG化(即通过聚乙二醇共价连接修饰)。这些修饰可增加稳定性并阻止所述脂质体的非特异性吸收。例如，脂质可用如Heyes等.(2005) J ControlledRelease 107 :276-287中公开的技术偶联PEG。实施例中使用DSPC、DlinDMA、PEG-DMPG和胆固醇的混合物。本发明的单独部分为含DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的脂质体。该脂质体优选包埋RNA，如例如编码免疫原的自复制RNA。脂质体通常分为3组多室脂囊(MLV);小单室脂囊(SUV);和大单室脂囊(LUV)。MLV的各脂囊中具有多种双分子层，形成许多分离的水性隔室。SUV和LUV具有包埋水核心的单一双分子层；SUV通常直径彡50nm，LUV直径> 50nm。本发明所用的脂质体理想上为直径范围50-220nm的LUV。对于含不同直径LUV群体的组合物(i)至少数量上有80%的直径应为20-220nm，(ii)所述群体的平均直径(Zav，强度)理想上为40_200nm，和/或(iii)所述直径的多分散性指数应< 0. 2。本领域已知制备合适的脂质体的技术，例如参见Liposomes :Methods andProtocols (《脂质体方法和实验方案》)，卷一 ！Pharmaceutical Nanocarriers Methods and Protocols (《药物纳米载体方法和实验方案》)(Weissig编著)·哈马那(Humana)出版，2009. ISBN 160327359X ；Liposome Technology(《脂质体技术》)，卷 I、II 和 III (Gregoriadis 编著)·英富曼医疗保健公司(Informa Healthcare), 2006 ;和Functional Polymer Colloids and Microparticles (《功能性聚合物胶质和微粒》)，卷4 (Microspheres,microcapsules & liposomes (微球、微囊和脂质体))·(Arshady 和 Guyot编著).辞塔斯图书公司(Citus Books)，2002。一种有用的方法涉及混合(i)所述脂质的乙醇溶液(ii)所述核酸的水溶液和(iii)缓冲液，随后混合、平衡、稀释和纯化(Heyes等·(2005) J Controlled Release 107:276-87·)。RNA优选包埋在所述脂质体中，且因此所述脂质体形成围绕含RNA水性核心的外层。发现所述包埋可保护RNA不受RNA酶消化。所述脂质体可包括一些外部的RNA(如所述脂质体的表面)，但至少包埋一半的RNA(理想上为全部)。聚合微粒许多聚合物可形成微粒以包埋或吸收RNA。基本使用非毒性聚合物表明受体可安全的接受所述颗粒，而使用可生物降解聚合物表明所述颗粒可在递送后代谢以避免长期留存。有用的聚合物还可进行灭菌，以辅助制备药物级别制剂。合适的非毒性和可生物降解的聚合物包括但不限于 聚(α-羟酸入聚羟基丁酸、聚内酯(包括聚己内酯)、聚二卩恶烷酮、聚戊内酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚氰基丙烯酸酯、酪氨酸源的聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮或聚酯酰胺和其组合。在一些实施方式中，所述微粒形成自聚U-羟酸)如聚(丙交酯)(“PLA”)、丙交酯和乙交酯的共聚物如聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(“？1^”)、和0，1^-丙交酯和己内酯的共聚物。有用的PLG聚合物包括那些丙交酯/乙交酯摩尔比范围为例如20 80-80 20如 25 75,40 60,45 55,55 45,60 40,75 25。有用的 PLG 聚合物包括那些分子量为例如 5，000-200，OOODa,如 10，000-100，000,20, 000-70，000,40, 000-50，OOODa0所述微粒直径理想上为0. 02 μ m-8 μ m。对于含直径不同的微粒群的组合物，至少数量上80 %的直径应为0. 03-7 μ m。本领域熟知制备合适的微粒的技术,例如参见Functional Polymer Colloidsand Microparticles (《功能性聚合物胶质和微粒》)，卷 4 (Microspheres, microcapsules& liposomes (微球、微囊和脂质体)).(Arshady和Guyot编著).辞塔斯图书公司(CitusBooks), 2002 ；Polymers in Drug Delivery (《药物递送中的聚合物》)·(Uchegbu 和Schatzlein 编著)· CRC 出版社，2006.(具体第 7 章)和 Microparticulate Systems forthe Delivery of Proteins and Vaccines (《递送蛋白和疫苗的微粒系统》)·(Cohen和Bernstein编著).CRC出版社，1996。为了有助于RNA的吸收，微粒可包括阳离子表面活性剂和 / 或脂质，如 O，Hagan 等· (2001) J Virology75 :9037-9043 ;和 Singh 等· (2003)Pharmaceutical Research 20 :247-251中所公开。制作聚合微粒的替代方法是通过模塑和固化如W02009/132206中所公开。本发明的微粒可具有40_100mV的ζ电势。RNA可被所述微粒吸收，且该吸收通过在所述微粒中纳入阳离子材料(如阳离子脂质)来促进。
水包油阳离子乳液已知水包油乳液能辅助流感疫苗如FLUAD 产品中的MF59 佐剂和PREPANDRIX 产品中的AS03佐剂。按照本发明的RNA递送能利用水包油乳液，只要该乳液包括一种或多种阳离子分子。例如，阳离子脂质可包括在所述乳液中，以提供带负电RNA能结合的带正电液滴表面。所述乳液包含一种或多种油。合适的油包括来自例如动物(如鱼)或植物来源的油。所述油理想上是可生物降解(可代谢)和生物相容的。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。可以使用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳液的脂肪和油可代谢并因而可以使用。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支 链油，其总称为萜类。也可采用鲨烯的饱和类似物鲨烷。包括鲨烯和鲨烷在内的鱼油，易于从商业来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。其他有用的油为生育酚，特别是和角鲨烯结合。当乳液的油相包含生育酚时，可采用α、β、Υ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一种，但优选α -生育酚。可同时采用D_ α _生育酚和DL-α-生育酚。优选的α生育酚是DL-α生育酚。可使用包括角鲨烯和生育酚(如DL- α -生育酚)的油组合。乳液优选包含角鲨烯，其是一种支链不饱和萜类鲨鱼肝油(C3tlH5tl ;[ (CH3)2C[=CHCH2CH2C (CH3)J2 = CHCH2-J2 ;2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22- 二十四碳己烯；CAS RN 7683-64-9)。所述乳液中的油可包括油例如角鲨烯和至少一种其他油的组合。所述乳液的水性组分可为淡水(如w. f. I.)或可包括其他组分如溶质。例如，其可包括盐以形成缓冲液，例如柠檬酸或磷酸盐如钠盐。常用缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸缓冲剂。优选缓冲的水相，且缓冲液的浓度一般是5-20mM。所述乳液也包括阳离子脂质。优选此脂质为表面活性剂从而其有助于所述乳液的形成和稳定。有用的阳离子脂质通常含生理条件下带正电的氮原子如叔胺或季胺。所述氮可在两亲性表面活性剂的亲水头基里。有用的阳离子脂质包括但不限于1，2_ 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、3' -[N-(Ni，N' -二甲基氨基乙基)_氨甲酰基]胆固醇(DC胆固醇)、二甲基双十八烷基-铵(DDA如溴化物)、1，2-二肉豆蘧酰-3-三甲基-铵丙烷(DMTAP)、二棕榈酰(C16:0)三甲基铵丙烷(DPTAP)、二硬脂酰三甲基铵丙烷(DSTAP)。其他有用的阳离子脂质是苯扎氯铵(BAK)、氯化苄乙铵、溴棕三甲铵(其含十四烷基三甲基溴化铵和可能少量的十二烷基三甲基溴化铵和十六烷基三甲基溴化铵)、十六烷基氯化吡啶锚(CPC)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)、N，N'，N'-聚氧乙烯(10)-N-牛油-I，3-二氨基丙烷、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、混合的烷基-三甲基-溴化铵、苄基二甲基十二烷基氯化铵、苄基二甲基十六烷基氯化铵、苄基三甲基甲醇铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵、二甲基十八烷基溴化铵(DDAB)、甲基氯化苄乙铵、氯化十烃季铵、甲基混合的二烧基氯化铵、甲基二羊基氯化铵)、N, N- 二甲基-N_[2 (2-甲基-4-(1,1,3,3四甲基丁基)_苯氧基]-乙氧基)乙基]_苯甲烧_氯化铵(DEBDA)、二烧基二甲基铵盐、[1-(2,
3-二油烯基氧基)-丙基]-N,N,N, 二甲基氯化铵、I, 2-二酸基-3-( 二甲基铵)丙烧(酸基=二肉豆蘧酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、1，2_ 二酰基_3( 二甲基铵)丙烷(酰基=二肉豆蘧酰、二棕榈酰、二硬脂酰、二油酰)、1，2_ 二油酰-3-(4'-三甲基-铵)丁酰-sn-甘油、1，2_ 二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、(4'-三甲基铵)丁酸胆固醇)、N-烷基吡啶盐(如溴化十六烷基吡啶和氯化十六烷基吡啶)、N-烷基哌啶盐、双阳离子波拉型电解质(C12Me6 ;C12BU6)、二烷基甘油基磷酸胆碱、溶血卵磷脂、L-α 二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇半琥珀酸胆碱酯、脂聚胺，包括但不限于双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(DOGS)、二棕榈酰磷脂酰乙醇-酰胺基精胺(DPPES)、脂聚-L (或D)-赖氨酸(LPLL、LPDL)、聚(L (或D)-赖氨酸偶联N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、具有侧接氨基的双十二烷基谷氨酸酯((TGluPhCnN)、具有侧接氨基的双十四烷基谷氨酸酯(C14GIuCnN+)、胆固醇阳离子衍生物，包括但不限于胆固醇基-3 β -氧琥珀酰胺基乙烯基三甲基铵盐、胆固醇基-3 β -氧琥珀酰胺基乙烯基-二甲基铵、胆固醇基-3 β -羧基酰氨基乙烯基三甲基铵盐、和胆固醇基-3 β -羧基酰氨基乙烯基二甲基铵。其它有用的阳离子脂质在美国2008/0085870和美国2008/0057080中描述，其通过引用纳入本文。 阳离子脂质优选可生物降解(可代谢)和生物相容的。除了所述油和阳离子脂质，乳液可包括非离子型表面活性剂和/或两性表面活性齐U。所述表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80;以商品名DOWF ΑΧ 出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton) Χ-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30);聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是聚山梨酯80 (吐温80 ;聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85 (去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X100。所述乳液中可包括这些表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物或吐温80/曲通-X100混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适用。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合物可包括HLB值为10-20的表面活性剂(如聚山梨酯80，HLB为15. O)和HLB值为1-10的表面活性剂(如去水山梨糖醇三油酸酯，HLB为I. 8)。最终乳液中油的含量(体积％ )优选为2-20%，如5-15%、6-14%、7_13%、8-12 %。约4-6 %或约9-11 %的角鲨烯含量特别有用。最终乳液中角鲨烯的含量(重量％ )优选在O. 001%和8%之间。例如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如聚山梨酯80)0. 2-4%，具体为O. 4-0. 6%,O. 45-0. 55%、约O. 5%或
I.5-2%U. 8-2. 2%Λ. 9-2. I %、约 2%、或 O. 85-0. 95%、或约 I 去水山梨糖醇酯(如去水山梨糖醇三油酸酯)O. 02-2 %，具体约O. 5 %或约I %;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通x-100)O. 001-0. I %，具体为0.005-0.02% ;聚氧乙烯酯(如月桂醇聚醚9)0. 1-8%,优选O. 1-10%且具体为O. 1-1 %或约O. 5%0油和表面活性剂的绝对含量和其比例可在较广范围内变化而仍能形成乳液。技术人员可容易地改变组分的相对比例以获得需要的乳液，但油和表面活性剂常用4 :1-5:1的重量比(油过量)。确保乳液的免疫刺激活性的重要参数，特别是在大型动物中，是油滴尺寸(直径)。最有效的乳液液滴尺寸为亚微米范围。所述液滴 尺寸适于为50-750nm。最常用的平均液滴尺寸小于250nm如小于200nm、小于150nm。平均液滴尺寸常用80_180nm。理想地，至少80% (数量)的乳液油滴直径小于250nm，且优选至少90%。测量乳液中平均液滴尺寸和尺寸分布的仪器可市售获得。这些通常使用动态光散射和/或单颗粒光学感应的技术如获自颗粒尺寸系统公司(Particle Sizing Systems)的Accusizer 和Nicomp 系列仪器(美国圣塔色色拉)，或马文仪器公司(Malvern Instruments)的Zetasizer 仪器(英国)，或厚利巴公司(Horiba)的颗粒尺寸分布分析仪(Particle Size DistributionAnalyzer instruments)(日本京都)。理想地，液滴尺寸分布(数量)仅有一个最大值而不是两个最大值，即围绕平均值(模式)分布有单一液滴群。优选的乳液的多分散性< O. 4如O. 3、0. 2或更小。含亚微米液滴和窄尺寸分布的合适乳液可通过使用微流化获得。该技术通过几何学固定的通道以高压和高速推动输入流组分来降低油滴平均尺寸。这些流接触通道壁、室壁和彼此。造成的剪切力、冲击力和空化力使液滴尺寸变小。可重复微流化步骤直至得到的乳液含所需平均液滴尺寸和分布。作为微流化的替代，加热法可用于引起相转化。这些方法还可提供颗粒尺寸分布紧密的亚微米乳液。优选的乳液可过滤灭菌，即其液滴可穿过220nm滤器。除了提供灭菌，这个过程还去除所述乳液中的任何大液滴。在某些实施方式中，所述乳液中的阳离子脂质是D0TAP。所述阳离子水包油乳液可含约O. 5mg/ml-约25mg/ml的D0TAP。例如，所述阳离子水包油乳液包含的DOTAP可为约
0.5mg/ml_ 约 25mg/ml、约 O. 6mg/ml_ 约 25mg/ml、约 O. 7mg/ml_ 约 25mg/ml、约 O. 8mg/ml_ 约25mg/ml、约 O. 9mg/ml_ 约 25mg/ml、约 I. Omg/ml-约 25mg/ml、约 I. lmg/ml-约 25mg/ml、约
1.2mg/ml_ 约 25mg/ml、约 I. 3mg/ml_ 约 25mg/ml、约 I. 4mg/ml_ 约 25mg/ml、约 I. 5mg/ml_ 约25mg/ml、约 I. 6mg/ml_ 约 25mg/ml、约 I. 7mg/ml_ 约 25mg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约 24mg/ml、约
0.5mg/ml_ 约 22mg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约 20mg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约 18mg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约15mg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约 12mg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约 I Omg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约 5mg/ml、约 O. 5mg/ml-约 2mg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约 I. 9mg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约 I. 8mg/ml、约 O. 5mg/ml-约 I. 7mg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约 I. 6mg/ml、约 O. 6mg/ml_ 约 I. 6mg/ml、约 O. 7mg/ml_ 约
1.6mg/ml、约 O. 8mg/ml_ 约 I. 6mg/ml、约 O. 5mg/ml、约 O. 6mg/ml、约 O. 7mg/ml、约 O. 8mg/ml、约 O. 9mg/ml、约 I. Omg/ml、约 I. lmg/ml、约 I. 2mg/ml、约 I. 3mg/ml、约 I. 4mg/ml、约 I. 5mg/ml、约 I. 6mg/ml、约 12mg/ml、约 18mg/ml、约 20mg/ml、约 21. 8mg/ml、约 24mg/ml 等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约0. 8mg/ml-约I. 6mg/ml DOTAPjn0. 8mg/ml> I. 2mg/ml> I. 4mg/ml 或 I. 6mg/ml。
在某些实施方式中，所述阳离子脂质为DC胆固醇。所述阳离子水包油乳液可含约O. lmg/ml-约5mg/ml的DC胆固醇。例如,所述阳离子水包油乳液包含的DC胆固醇可为约O. lmg/ml-约 5mg/ml、约 O. 2mg/ml_ 约 5mg/ml、约 O. 3mg/ml_ 约 5mg/ml、约 O. 4mg/ml_ 约5mg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约 5mg/ml、约 O. 62mg/ml_ 约 5mg/ml、约 lmg/ml-约 5mg/ml、约 I. 5mg/ml-约 5mg/ml、约 2mg/ml_ 约 5mg/ml、约 2. 46mg/ml-约 5mg/ml、约 3mg/ml_ 约 5mg/ml、约 3. 5mg/ml-约 5mg/ml、约 4mg/ml_ 约 5mg/ml、约 4. 5mg/ml_ 约 5mg/ml、约 O. lmg/ml-约4. 92mg/ml、约 O. lmg/ml-约 4. 5mg/ml、约 O. lmg/ml-约 4mg/ml、约 O. lmg/ml-约 3. 5mg/ml、约 O. lmg/ml-约 3mg/ml、约 O. lmg/ml-约 2. 46mg/ml、约 O. lmg/ml-约 2mg/ml、约 O. Img/ml-约 I. 5mg/ml、约 O . lmg/ml-约 lmg/ml、约 O. lmg/ml-约 O. 62mg/ml、约 O. 15mg/ml、约O. 3mg/ml、约 O. 6mg/ml、约 O. 62mg/ml、约 O. 9mg/ml、约 I. 2mg/ml、约 2. 46mg/ml、约 4. 92mg/ml等。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约O. 62mg/ml-约4. 92mg/mlDC 胆固醇，如 2. 46mg/ml。在某些实施方式中，所述阳离子脂质为DDA。所述阳离子水包油乳液可含约O. lmg/ml-约5mg/ml的DDA。例如,所述阳离子水包油乳液包含的DDA可为约O. lmg/ml-约5mg/ml、约 O. lmg/ml-约 4. 5mg/ml、约 O. lmg/ml-约 4mg/ml、约 O. lmg/ml-约 3. 5mg/ml、约 O. lmg/ml-约 3mg/ml、约 O. lmg/ml-约 2. 5mg/ml、约 O. lmg/ml-约 2mg/ml、约 O. Img/ml-约 I. 5mg/ml、约 O. lmg/ml-约 I. 45mg/ml、约 O. 2mg/ml_ 约 5mg/ml、约 O. 3mg/ml_ 约 5mg/ml、约 O. 4mg/ml-约 5mg/ml、约 O. 5mg/ml_ 约 5mg/ml、约 O. 6mg/ml_ 约 5mg/ml、约 O. 73mg/ml-约 5mg/ml、约 O. 8mg/ml_ 约 5mg/ml、约 O. 9mg/ml_ 约 5mg/ml、约 I. Omg/ml-约 5mg/ml、约 I. 2mg/ml-约 5mg/ml、约 I. 45mg/ml_ 约 5mg/ml、约 2mg/ml_ 约 5mg/ml、约 2. 5mg/ml_ 约5mg/ml、约 3mg/ml-约 5mg/ml、约 3. 5mg/ml_ 约 5mg/ml、约 4mg/ml_ 约 5mg/ml、约 4. 5mg/ml-约5mg/ml、约I. 2mg/ml、约I. 45mg/ml等。或者,所述阳离子水包油乳液包含约20mg/ml、约 21mg/ml、约 21. 5mg/ml、约 21. 6mg/ml、约 25mg/ml DDA。在一个示例性实施方式中，所述阳离子水包油乳液包含约O. 73mg/ml-约I. 45mg/ml DDA,如I. 45mg/ml。导管或类似设备可用于将本发明的自复制RNA分子以裸露RNA或与递送系统组合递送到靶器官或组织。合适的导管在例如美国专利号4，186，745 ;5，397，307 ;5，547，472 ；5，674，192 ;和6，129，705中公开，其都通过引用纳入本文。本发明包括使用合适的递送系统如包埋或吸收有自复制RNA的脂质体、聚合微粒或亚微米乳液微粒来递送编码RSV-F多肽的自复制RNA分子，以例如单独或结合其他大分子激发免疫应答。本发明包括吸收和/或包埋有自复制RNA分子的脂质体、微粒和亚微米乳液、及其组合。如实施例中进一步证明，与脂质体和亚微米乳液微粒结合的自复制RNA分子可有效地递送到所述宿主细胞，且可引起针对所述自复制RNA编码的蛋白的免疫应答。免疫原性组合物本发明提供免疫原性组合物。所述免疫原性组合物可包括单一活性免疫原性剂或数种免疫原性剂。例如，所述免疫原性组合物可包括单一形式(如单体、三聚体或玫瑰花结)或两种或更多形式(如单体和三聚体的混合物或单体和三聚体之间的动态平衡)的RSV F多肽。所述免疫组合物可包括编码RSV-F多肽的自复制RNA，且优选还包括合适的递送系统如脂质体、多聚微粒、水包油乳液、及其组合。
本发明免疫原性组合物也可包含一种或多种免疫调节剂。一种或多种所述免疫调节剂优选包括一种或多种佐剂，例如两种、三种、四种或更多佐剂。佐剂可包括THl佐剂和/或TH2佐剂，详述见下。在另一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含多肽，所述多肽展示RSV-F糖蛋白融合前或中间融合构型中存在的表位，但不展示所述糖蛋白的融合后构型。在另一个实施方式中，本发明的免疫原性组合物包含第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽含完整或部分RSV F蛋白，且所述第二多肽含异源寡聚结构域。所述第一多肽可含RSV F蛋白胞外域。所述第二多肽可为来自流感血凝素的三聚结构域，来自 SARS刺突的三聚结构域，来自HIV gp41、NadA、改良的GCN4、或ATCase的三聚结构域。在一个方面，本发明是包含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物，其生成是如本文所述通过提供未切割的RSV F蛋白胞外域多肽或C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽并切割它们以产生F1和F2亚基。在另一个方面，本发明是包含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚体和/或单体的组合物，其生成是如本文所述通过提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，并从所述生物材料中纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体、未切割的三聚体或未切割的单体和未切割的三聚体的组合(如混合物或动态平衡)。在一些实施方式中，所述RSV F蛋白胞外域多肽在约106-109位和约133-136位含改变的弗林蛋白酶切割位置，且如果需要还可含改变的融合肽。在其他实施方式中，所述RSV F蛋白胞外域在约106-109位和约133-136位含改变的弗林蛋白酶切割位置，在约101位和约161位之间含改变的胰蛋白酶切割位置，且如果需要还可含改变的融合肽。在另一个方面，本发明是包含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚体和/或单体的组合物，其生成是如本文所述通过提供含C末端未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，并从所述生物材料中纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体、未切割的三聚体或未切割的单体和未切割的三聚体的组合(如混合物或动态平衡)。在另一个方面，本发明是包含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物，其生成是如本文所述通过提供含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，所述多肽含改变的融合肽(如至少部分所述融合肽缺失)，并从所述生物材料中纯化切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚体。在另一个方面，本发明是包含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物，其生成是如本文所述通过提供含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的生物材料，所述多肽含改变的融合肽(如至少部分所述融合肽缺失)，并从所述生物材料中纯化未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体。本发明的组合物优选适于给予哺乳动物对象如人，且包括一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂包括佐剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献29。组合物通常是水性形式。当所述组合物是免疫原性组合物并给予哺乳动物如人时，其会引发免疫应答。所述免疫原性组合物可用于制备用于免疫哺乳动物的疫苗制剂。所述免疫原性组合物可包括单一活性免疫原性剂或数种免疫原性剂。例如,所述RSV F蛋白胞外域多肽可为单一形式(如未切割单体、切割单体、未切割三聚体、切割三聚体或切割三聚体的玫瑰花结)或两种或更多形式(如未切割单体和未切割三聚体的混合物或未切割单体和未切割三聚体之间的动态平衡)。此外，所述组合物可包含RSV F蛋白胞外域多肽及一种或多种其他RSV蛋白(如G蛋白和/或M蛋白)和/或其可结合来自其他病原体的免疫原。该组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本无(即小于5yg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞。更优选无汞的免疫原性组合物。特别优选不含防腐剂的免疫原性组合物。为了控制张度，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可为
l-20mg/ml。可以存在其它盐，包括氯化钾、磷酸二氢钾、二水合磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙
坐寸ο 组合物的渗透压通常为200m0sm/kg-400m0sm/kg,优选为240-360m0sm/kg,更优选为 290-310m0sm/kg。组合物可含有一种或多种缓冲剂。常用缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(具体是有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂一般是5-20mM。组合物的pH通常为5. 0-8. 1，更常为6. 0-8. O,例如6. 5-7. 5，或者7. 0-7. 8。因此，本发明方法可包括在包装前调整散装疫苗pH的步骤。该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有< 1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量< O. IEU0该组合物优选不含谷蛋白。人疫苗的给药剂量体积一般为约O. 5ml,但可将一半剂量(即约O. 25ml)给予儿童。佐剂本发明的组合物含RSV-F多肽或编码RSV-F多肽的核酸，其还可包含一种或多种佐剂，例如2种、3种、4种或更多佐剂，所述佐剂可用于提高接受所述组合物的患者体内引发的免疫应答(体液和/或细胞)。所述佐剂可包括THl佐剂和/或TH2佐剂。可以用于本发明组合物的佐剂包括但不限于 含矿物质的组合物。本发明中适合用作佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如钙盐和铝盐(或其混合物)。本发明包括无机盐，例如氢氧化物(如羟基氧化物)、磷酸盐(如羟磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等,或不同无机化合物的混合物,这些化合物可采用任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形等)，优选具有吸附性。钙盐包括磷酸钙(如参考文献38公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒(39)。铝盐佐剂详述于下。 油乳液组合物(详述见下)。适用作本发明佐剂的油乳液组合物包含角鲨烯-水乳液，如MF59 (5%角鲨烯、O. 5%吐温80和O. 5%司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。 细胞因子诱导剂(详述见下)。适用于本发明的细胞因子诱导剂包括toll样受体7(TLR7)激动剂(如WO 2009/111337中公开的苯并萘啶化合物)。 皂苷(参考文献74第22章)是在许多植物种类的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的留醇糖苷和三職糖苷的异质群。已广泛研究了作为佐剂的来自阜树(Quillaiasaponaria)Molina树皮的阜苷。阜苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥阜草(Saponaria officianalis)(阜根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以SHMULON(TM)出售。已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括037、0317、0318、0321、0!^、0!1-8和职-(。所述皂苷优选QS21。生产QS21的方法在参考文献40中公开。皂苷制剂也可以包含留醇，如胆固醇(41)。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒(参考文献74的第23章)。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献41-43中进一步描述了 ISC0M。41-43.任选地，所述ISCOM可以不含另外的去污剂(44)。关于开发基于皂苷的佐剂的综述可以参见参考文献45和46 脂肪佐剂(详见下)包括水包油乳液、源自肠细菌脂多糖的改良的天然脂质As、磷脂化合物(如合成磷脂二聚体，E6020)等。 细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌不耐热肠毒素"L T"、霍乱毒素"CT"或百日咳毒素"PT")及其脱毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72的突变毒素(47)。参考文献48中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献49中描述了将其用作胃肠道外佐剂。 生物粘附剂和粘膜粘附剂，如酯化透明质酸微球(50)或壳聚糖及其衍生物(51)。 由可生物降解和无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直径约100nm-150ym，更优选约200nm-30 μ m,或约500nm_10 μ m的颗粒),任选处理以具有带负电表面(如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。 脂质体(参考文献74的第13和14章)。适用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献52-54所述。· ·聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂(55)。该类制剂还包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇的组合(56)，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种另外的非离子表面活性剂如辛苯糖醇的组合(57)。优选的聚氧乙烯醚选自下组聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。 胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-Al-D-异谷氨酸-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺("DTP-DPP"或"TheramideTM// )和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(I' -2' -二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)。 由第一种革兰氏阴性菌制备的外膜蛋白蛋白质体制剂与衍生自第二种革兰氏阴性菌脂多糖制剂的组合，其中外膜蛋白蛋白质体和脂多糖制剂形成稳定的非共价连接佐剂复合物。这类复合物包括"IVX-908"，它是由脑膜炎奈瑟球菌外膜和脂多糖组成的复合物。 聚氧镦(polyoxidonium)聚合物(58,59)或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。籲甲基肌苷5,-单磷酸酯("MMP" )(60)。 多聚羟化吡咯双烷类化合物(61)，如下式化合物
权利要求
1.一种含一种或多种呼吸道合胞病毒F(RSV F)多肽的免疫原性组合物，其中氨基酸100-150 用氨基酸序列 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ IDNO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 ；SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ IDNO: 13、SEQ ID NO:91 或 SEQ ID NO :92 替代。
2.如权利要求I所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述RSVF的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID NO : 12替代。
3.如权利要求I所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述RSVF的氨基酸100-150用氨基酸序列 SEQ ID NO:9、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO 7 ；SEQ ID NO:8、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 1USEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO :92 替代。
4.如权利要求I所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述氨基酸100-150用氨基酸序 列 SEQ ID NO 9 替代。
5.如权利要求I或2所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述RSVF为单体、三聚体或单体和三聚体组合的形式。
6.如权利要求3或4所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述RSVF为单体、三聚体，玫瑰花结或其任何组合的形式。
7.如权利要求1-6中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述RSVF多肽是含所述RSV-F胞外域的可溶性多肽。
8.如权利要求1-6中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述RSVF含SEQ IDNO :1 或 SEQ ID NO 2 的氨基酸 23-99 和 151-524。
9.一种含选自下组的多肽的免疫原性组合物SEQ ID NO 49, SEQ ID NO :68、SEQ IDNO :71、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQID NO :33、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO 51、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :57、SEQ IDNO :58、SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQID NO :64、SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO85,SEQ ID NO86,SEQ ID NO87,SEQ ID NO 88,SEQ ID NO89,SEQ ID NO:93、省略信号肽和/或HIS标记的任何上述序列、及其组合。
10.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述多肽为SEQIDNO 68或省略所述信号肽和任选所述HIS标记的SEQ ID NO :68。
11.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述多肽选自下组SEQIDNO :49、SEQ ID NO 71和其中省略所述信号肽和任选所述HIS标记的任何上述序列。
12.如权利要求1-11所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包含佐剂。
13.如权利要求12所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述佐剂选自下组铝盐、水包角鲨烯乳液、苯并萘啶化合物、磷脂化合物、小分子免疫增强剂和任何上述的组合。
14.一种重组呼吸道合胞病毒F多肽(RSV F)，其中氨基酸100-150用氨基酸序列SEQID N0:9、SEQ ID NO 12, SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ IDNO 7 ；SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :91 或 SEQID NO 92 替代。
15.如权利要求14所述的重组RSVF，其特征在于，所述RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID NO 12替代。
16.如权利要求15所述的重组RSVF，其特征在于，所述RSV F的氨基酸100-150用氨基酸序列 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO 7 ；SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :13 或 SEQ ID NO :92 替代。
17.如权利要求14所述的重组RSVF，其特征在于，所述氨基酸100-150用氨基酸序列SEQ ID NO 9 替代。
18.如权利要求14或15所述的重组RSVF，其特征在于，所述RSV F为单体、三聚体或单体和三聚体组合的形式。
19.如权利要求16或17所述的重组RSVF，其特征在于，所述RSV F为单体、三聚体、三聚体的玫瑰花结或其组合的形式。
20.一种选自下组的重组多肽SEQ ID NO 49, SEQ ID NO :68、SEQ ID NO 7U SEQ IDNO 25, SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33、SEQID NO 35, SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO45,SEQ ID NO46,SEQ ID NO 47,SEQ ID NO48,SEQ ID NO50,SEQ ID NO:51、SEQ ID NO 52, SEQ ID NO :53、SEQ ID NO :54、SEQ ID NO :55、SEQ ID NO :57、SEQ IDNO 58, SEQ ID NO :59、SEQ ID NO :60、SEQ ID NO :61、SEQ ID NO :62、SEQ ID NO :63、SEQID NO 64, SEQ ID NO :65、SEQ ID NO :66、SEQ ID NO :67、SEQ ID NO :69、SEQ ID NO :70、SEQ ID NO85,SEQ ID NO86,SEQ ID NO87,SEQ ID NO 88,SEQ ID NO89,SEQ ID NO:93、省略信号肽和/或HIS标记的任何上述序列、及其组合。
21.如权利要求14-20中任一项所述的重组多肽，其特征在于，所述重组多肽还包括异源寡聚化结构域、表位或信号肽。
22.如权利要求21所述的重组多肽，其特征在于，所述异源寡聚化结构域选自下组来自流感血凝素，来自SARS刺突，或来自HIV gp41、NadA、改良的GCN4、或天冬氨酸转氨甲酰酶的三聚结构域。
23.—种编码如权利要求14-21中任一项所述多肽的分离的核酸。
24.如权利要求23所述的分离的核酸，其特征在于，所述核酸是自复制RNA分子。
25.—种含如权利要求24所述的自复制RNA分子的免疫原性组合物。
26.如权利要求25所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物还包含递送系统。
27.一种在对象中引起针对RSV F的免疫应答的方法，所述方法包括将如权利要求I -14中任一项所述的免疫原性组合物给予对象。
28.—种在对象中引起针对RSV F的免疫应答的方法，所述方法包括将如权利要求25所述的免疫原性组合物给予对象。
29.—种生产含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物的方法，所述方法包括 a)提供含蛋白酶切割位置且切割时产生F1和F2亚基的未切割的RSVF蛋白胞外域多肽，所述未切割的可溶性RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列在106-109位和133-136位含改变的弗林蛋白酶切割位置，且所述未切割的可溶性RSV F蛋白胞外域多肽获自以未切割形式生成所述多肽的细胞；和 b)用切割所述蛋白酶切割位置的蛋白酶切割所提供的可溶性RSVF蛋白胞外域多肽，从而产生含切割的可溶性RSV F蛋白胞外域多肽的组合物。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中提供的未切割的RSVF蛋白胞外域多肽在约101位-约161位的一个或多个位置被切割。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述提供的未切割的RSVF蛋白胞外域多肽在约106位-约142位的一个或多个位置被切割。
32.如权利要求29-32中任一项所述的方法，其特征在于，在a)中纯化提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽。
33.如权利要求29-32中任一项所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽含完整融合肽。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中的切割导致形成三聚体的玫瑰花结。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤c)纯化所述三聚体的玫瑰花结。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述三聚体的玫瑰花结的纯化包括尺寸排阻色谱。
37.如权利要求29-32中任一项所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽含改变的融合肽。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述未切割的RSVF蛋白胞外域多肽中至少部分所述融合肽缺失。
39.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述融合肽中缺失氨基酸137-153、氨基酸137-146、氨基酸137-145或氨基酸137-142。
40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中的切割导致形成三聚体。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤c)纯化所述三聚体。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述三聚体的纯化包括尺寸排阻色谱。
43.如权利要求29-42中任一项所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、酵母细胞、四膜虫细胞或其组合中表达。
44.如权利要求29-43中任一项所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的未切割的RSV F蛋白胞外域多肽在细胞条件培养基中提供。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述细胞条件培养基中选自下组昆虫细胞条件培养基、哺乳动物细胞条件培养基和其组合。
46.如权利要求29-36和41中任一项所述的方法，其特征在于，所述三聚体的玫瑰花结包括至少一种选自Furdel和Delp23 fur del多肽的F1和F2片段。
47.如权利要求29-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述切割的RSVF蛋白胞外域多肽基本不含脂质和脂蛋白。
48.一种含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物，所述组合物用如权利要求29-47中任一项所述的方法生产。
49.如权利要求48所述的组合物，其特征在于，所述组合物是免疫原性组合物。
50.一种生产含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体、三聚体或单体和三聚体组合的组合物的方法，所述方法包括 a)提供含未切割的RSVF蛋白胞外域多肽的生物材料，所述未切割的可溶性RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列在106-109位和133-136位含改变的弗林蛋白酶切割位置，且所述未切割的可溶性RSV F蛋白胞外域多肽分泌自以未切割形式生成所述多肽的细胞；和 b)从所述生物材料中纯化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽单体或三聚体，从而生成所述组合物。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述生物材料选自下组昆虫细胞条件培养基或细胞裂解物、哺乳动物细胞条件培养基或细胞裂解物、禽类细胞条件培养基或细胞裂解物、酵母细胞条件培养基或细胞裂解物、四膜虫细胞条件培养基或细胞裂解物和其组口 o
52.如权利要求50或51所述的方法，其特征在于，在b)中纯化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽三聚体。
53.如权利要求50或51所述的方法，其特征在于，在b)中纯化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽单体。
54.如权利要求50所述的方法，其特征在于，b)中的纯化包括尺寸排阻色谱。
55.如权利要求50-54中任一项所述的方法，其特征在于，所述未切割的RSVF蛋白胞外域多肽还含改变的融合肽。
56.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述可溶性未切割的RSVF蛋白胞外域多妝含至少一种选自下组的多妝furmt、furdel、Delp21 furx、Delp23 furx、Delp21furdel、Delp23 furdel、和 Xa 因子构建体。
57.如权利要求50-56中任一项所述的方法，其特征在于，所述包括未切割RSVF蛋白胞外域多肽的组合物基本不含脂质和脂蛋白。
58.一种含可溶性未切割RSV F蛋白胞外域多肽单体或三聚体的组合物，所述组合物用如权利要求50-57中任一项所述的方法生产。
59.如权利要求58所述的组合物，其特征在于，所述组合物是免疫原性组合物。
60.一种生产含未切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体、三聚体或单体和三聚体组合的组合物的方法，所述方法包括 a)提供含未切割的RSVF蛋白胞外域多肽的生物材料，其中所述未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的氨基酸序列含改变的弗林蛋白酶切割位置，约101位-约161位之间存在的赖氨酸和精氨酸残基缺失或由非赖氨酸或精氨酸的氨基酸替换，所述RSV F蛋白胞外域多肽获自生成约101位-约161位之间没有切割的所述多肽的宿主细胞，且所述RSV F蛋白胞外域多肽在约101位-约161位之间没有被切割；和 b)从所述生物材料中纯化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽单体、三聚体或单体和三聚体的组合。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述生物材料选自下组昆虫细胞条件培养基或细胞裂解物、哺乳动物细胞条件培养基或细胞裂解物、禽类细胞条件培养基或细胞裂解物、酵母细胞条件培养基或细胞裂解物、四膜虫细胞条件培养基或细胞裂解物和其组口 o
62.如权利要求60或61所述的方法，其特征在于，在b)中纯化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽三聚体。
63.如权利要求60或61所述的方法，其特征在于，在b)纯化中未切割的RSVF蛋白胞外域多肽单体。
64.如权利要求60或61所述的方法，其特征在于，在b)中纯化未切割的RSVF蛋白胞外域多肽单体和未切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚体。
65.如权利要求60-64中任一项所述的方法，其特征在于，b)中的纯化包括尺寸排阻色P曰。
66.如权利要求60-64中任一项所述的方法，其特征在于，所述未切割的RSVF蛋白胞外域多肽还含改变的融合肽。
67.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述未切割的RSVF蛋白胞外域多肽含至少一种选自下组的多妝Furx、Furx R113Q K123N K124N、Delp21 furx 和 Delp23 furx。
68.如权利要求60-67中任一项所述的方法，其特征在于，所述包括未切割的RSVF蛋白胞外域多肽的组合物基本不含脂质和脂蛋白。
69.一种含可溶性未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物，所述组合物用如权利要求60-68中任一项所述的方法生产。
70.如权利要求69所述的组合物，其特征在于，所述组合物是免疫原性组合物。
71.—种生产含切割的RSV F蛋白胞外域多肽单体、三聚体或单体和三聚体组合的组合物的方法，所述方法包括 a)提供含切割的RSVF蛋白胞外域多肽的生物材料，所述多肽含改变的融合肽；和 b)从所述生物材料中纯化切割的RSVF蛋白胞外域多肽。
72.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述RSVF蛋白胞外域多肽含缺失约137-152氨基酸、缺失约137-153氨基酸、缺失约137-145氨基酸、缺失约137-146氨基酸、或缺失约137-142氨基酸的氨基酸序列。
73.如权利要求71或72所述的方法，其特征在于，所述生物材料选自下组昆虫细胞条件培养基或细胞裂解物、哺乳动物细胞条件培养基或细胞裂解物、禽类细胞条件培养基或细胞裂解物、酵母细胞条件培养基或细胞裂解物、四膜虫细胞条件培养基或细胞裂解物和其组合。
74.如权利要求71-73中任一项所述的方法，其特征在于，在b)中纯化切割的RSVF蛋白胞外域多肽三聚体。
75.如权利要求71-73中任一项所述的方法，其特征在于，在b)中纯化切割的RSVF蛋白胞外域多肽单体。
76.如权利要求71-73中任一项所述的方法，其特征在于，在b)中纯化切割的RSVF蛋白胞外域多肽单体和切割的RSV F蛋白胞外域多肽三聚体。
77.如权利要求71-73中任一项所述的方法，其特征在于，b)中的纯化包括尺寸排阻色P曰。
78.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述未切割的RSVF蛋白胞外域多肽至少含所述融合肽缺失多肽。
79.如权利要求71-78中任一项所述的方法，其特征在于，所述包括未切割的RSVF蛋白胞外域多肽的组合物基本不含脂质和脂蛋白。
80.一种含可溶性未切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物，所述组合物用如权利要求71-79中任一项所述的方法生产。
81.如权利要求80所述的组合物，其特征在于，所述组合物是免疫原性组合物。
82.—种生产含RSV F蛋白胞外域多肽的组合物的方法，所述方法包括 a)提供在133-136位含改变的弗林蛋白酶切割位置的RSVF蛋白胞外域多肽，且所述可溶性RSV F蛋白胞外域多肽分泌自以结合含F1亚基但136/137位没有被切割的F2片段的形式生成所述多肽的细胞；和 b)用在101位-161位之间的位置切割RSVF蛋白胞外域的蛋白酶切割所述提供的RSVF蛋白胞外域多肽，从而产生所述组合物。
83.如权利要求82所述的方法，其特征在于，在a)中纯化所提供的RSVF蛋白胞外域多肽。
84.如权利要求82或83所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的RSVF蛋白胞外域多肽在昆虫细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、酵母细胞、四膜虫细胞或其组合中表达。
85.如权利要求82-84中任一项所述的方法，其特征在于，所述a)中提供的RSVF蛋白胞外域多肽在细胞条件培养基、细胞提取物或其组合中提供。
86.如权利要求85所述的方法，其特征在于，所述RSVF蛋白胞外域多肽在选自下组的细胞条件培养基中提供昆虫细胞条件培养基、哺乳动物细胞条件培养基、禽类细胞条件培养基、酵母细胞条件培养基、四膜虫细胞条件培养基和其组合。
87.如权利要求82-86中任一项所述的方法，其特征在于，所述RSVF蛋白胞外域多肽至少含所述C末端弗林蛋白酶多肽。
88.如权利要求82-87中任一项所述的方法，其特征在于，所述b)中生成的切割的RSVF蛋白胞外域多肽基本不含脂质和脂蛋白。
89.—种含切割的RSV F蛋白胞外域多肽的组合物，所述组合物用如权利要求82-88中任一项所述的方法生产。
90.如权利要求89所述的组合物，其特征在于，所述组合物是免疫原性组合物。
91.一种生产含RSV F蛋白胞外域多肽的组合物的方法，所述方法包括 a)提供含RSVF蛋白胞外域多肽的生物材料，所述多肽在133-136位含改变的弗林蛋白酶切割位置，且所述可溶性RSV F蛋白胞外域多肽分泌自以结合含F1亚基但136/137位没有被切割的F2片段的形式生成所述多肽的细胞，条件是所述改变的弗林蛋白酶切割位置不缺失氨基酸131-134 ;和 b)从所述生物材料中纯化所述RSVF蛋白胞外域多肽，从而生成所述组合物。
92.如权利要求91所述的方法，其特征在于，所述生物材料选自下组昆虫细胞条件培养基或细胞裂解物、哺乳动物细胞条件培养基或细胞裂解物、禽类细胞条件培养基或细胞裂解物、酵母细胞条件培养基或细胞裂解物、四膜虫细胞条件培养基或细胞裂解物和其组口 o
93.如权利要求91或92所述的方法，其特征在于，在b)中纯化RSVF蛋白胞外域多肽单体、三聚体或单体和三聚体的组合。
94.如权利要求93所述的方法，其特征在于，b)中的纯化包括尺寸排阻色谱。
95.如权利要求91-94中任一项所述的方法，其特征在于，所述RSVF蛋白胞外域多肽至少含所述C末端弗林蛋白酶多肽。
96.如权利要求91-95中任一项所述的方法，其特征在于，所述包括RSVF蛋白胞外域多肽的组合物基本不含脂质和脂蛋白。
97.一种含RSV F蛋白胞外域多肽的组合物，所述组合物用如权利要求92-96中任一项所述的方法生产。
98.如权利要求97所述的组合物，其特征在于，所述组合物是免疫原性组合物。
全文摘要
本发明涉及含RSV F蛋白的免疫原性组合物、制备含RSV F蛋白胞外域多肽的组合物的方法，和某些遗传改造的RSV F蛋白和编码该遗传改造的RSV F蛋白的核酸。用所述方法制备的组合物可在主要或单一所需形式和构型中包含RSV F蛋白胞外域多肽。本发明还涉及诱导对RSV F的免疫应答的方法。
文档编号A61K39/155GK102639147SQ201080040594
公开日2012年8月15日 申请日期2010年7月15日 优先权日2009年7月15日
发明者K·斯旺森, P·R·道米策 申请人:诺华有限公司