一种程序性坏死诱导系统的建立方法与流程

本发明属于基因技术领域，涉及一种程序性坏死诱导系统的建立方法。

背景技术：

肿瘤坏死因子tnf-α，是多效性的细胞因子，它参与多个细胞响应，包括细胞存活，细胞增殖以及细胞死亡。由tnf-α诱导的细胞死亡需要tnf-α与定位于细胞膜上的tnfr1结合，tnfr1活化后在细胞内招募一系列蛋白形成不同的复合体。当tnf-α与tnfr1结合后可诱导自身及其下游蛋白死亡结构域和其他分子的聚集而形成包含tnf受体相关死亡结构域(tradd)、rip1、tnfr相关因子2(traf2)、胞内凋亡蛋白抑制因子1(ciap1)、ciap2的复合体。这些蛋白质分子会根据不同的刺激物或者微环境的改变做出相应的响应，引发不同的信号通路的激活，并最终决定细胞是存活、凋亡还是坏死性凋亡。研究表明smac/diablo是一种能诱导凋亡的线粒体蛋白，在由tnf-α诱导的凋亡信号的刺激下，smac/diablo与凋亡抑制蛋白结合解除凋亡抑制蛋白的抑制效应并促进凋亡。smacmimetics作为smac/diablo的类似物能诱导某些特定的肿瘤细胞系发生凋亡，并且这种死亡能被caspase抑制剂z-vad完全地抑制。

早期的研究中发现用smacmimetic和z-vad处理th-29细胞，caspase抑制剂z-vad并不能抑制细胞的死亡，反而进一步加剧了细胞的死亡，并且这种细胞死亡依赖于tnf-α的存在，具有一定的坏死样形态学特征，它是一种不同于凋亡和坏死的新的细胞死亡方式。随着研究的进行，这种新的细胞死亡方式被定义为程序性坏死即：一种与坏死具有相似的形态学特征，但其细胞死亡方式为可调控的非caspase依赖性的程序性细胞死亡，这一过程在生理病理过程具有重要作用。近期的研究表明，在程序性坏死信号通路中有两种新的蛋白激酶ripk3和mlkl发挥着至关重要的的作用，在细胞程序性坏死启动后，rip3通过磷酸化mlkl激酶结构域的苏氨酸和丝氨酸而使其活化并形成复合体necrosome，磷酸化的mlkl由单体状态向寡聚体状态转化，寡聚化的mlkl结合磷酸肌醇和心肌磷脂，使整个necrosome复合体从细胞质转移到细胞膜或细胞器膜上，并在这些膜结构上形成通透性孔道，破坏膜的完整性，引发细胞坏死。

然而由于目前缺少快速特异诱导细胞发生程序性坏死的方法，对于这一死亡方式的研究的开展较为困难。通过tnf-α、smacmimetic和z-vad(t+s+z)三种药物处理细胞诱导细胞发生程序性坏死已经成为了一种经典途径。然而这种诱导方式的不利因素有很多。首先，t+s+z作用于ht-29细胞最早需要6h才能引起细胞死亡，有时需要12h甚至更长的诱导时间才能取得理想的效果。并且t+s+z诱导系统具有一定的局限性，这一方法仅在少数细胞中可以较高效率的诱导细胞发生程序性坏死，如ht-29细胞或者鼠的细胞，而对多数人源肿瘤细胞诱导效率很低。其次，实验中所用的细胞不同，需要的诱导时间也不同，往往需要进一步实验确定合适的诱导时间，不可控因素很大。再次，药物诱导时间过长影响细胞的状态，细胞不均一状态下得到的实验结果也不可靠。并且t+s+z诱导方式不能特异的引起细胞发生程序性坏死，只有caspase受到抑制或者caspase相关基因被敲除，tnf-α诱导的细胞死亡方式才能由凋亡转向坏死。这就需要实验者实验前进行预实验有针对性的选择合适的caspase抑制剂，才能特异地诱导细胞发生程序性坏死。

为了解决t+s+z诱导体系的不足之处，我们选择的是建立可诱导的程序性坏死体系，将程序性坏死相关基因ripk3与fk506结合蛋白结构域(fkbp)进行融合表达，通过“tet-on”系统加入多西环素人为地调控ripk3过表达，只添加二聚物就能引发ripk3活化，其效率更高、可控性更好、特异性更强，解决了t+s+z诱导方式的不利因素。首先，我们选择的细胞是人的常见的肿瘤细胞hela细胞和a549细胞，更具创新之意。并且只需要向培养基中添加四环素类似物多西环素doxycycline和二聚物idimer就能诱导细胞发生坏死，加入药物后最早0.5h就能引起细胞的死亡，并且在hela细胞中我们仅仅加入多西环素一种药物就能引起细胞的敏感性反应。其次，我们构建的是包含“tet-on”系统的载体，通过慢病毒包装体系得到的稳定的细胞系，即使细胞不同，只需要控制加入培养基中多西环素和二聚物的量，就可以高效地调控ripk3的表达量和二聚物的诱导时间。再次，加入的多西环素能直接诱导程序性坏死信号通路中相关蛋白ripk3过表达，加入的二聚物能使ripk3二聚化并发生寡聚化反应特异性地激活程序性坏死信号通路，这种诱导方式不需要抑制caspase的活性，更不需要考虑其上游的信号通路，比t+s+z诱导体系更加简单高效，特异性更强。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种程序性坏死诱导系统的建立方法，解决了目前细胞程序性坏死诱导方法效果差的问题。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1：将ripk3-2×fkbp目的基因片段连入含有“tet-on”系统的慢病毒载体，构建可诱导表达的系统，通过四环素或其类似物能调节目的基因的表达；

步骤2：经测序正确的载体与慢病毒包装载体共转染至293t细胞，生产病毒，收集病毒液感染hela细胞和a549细胞，通过嘌呤霉素筛选得到稳定的细胞系；

步骤3：通过向培养基中加入多西环素诱导稳定细胞表达ripk3-2×fkbp蛋白，然后再加入二聚物诱导ripk3二聚化；

步骤4：通过免疫印迹实验以及相关的实验技术手段分析实验结果。

本发明的优势是通过dox和idimer诱导细胞发生程序性坏死，其灵敏度、效率更高，特异性更强，能够快速诱导细胞发生坏死。

附图说明

图1ripk3-2×fkbp表达依赖于dox示意图；

图2dox诱导ripk3-2×fkbp表达的剂量依赖关系图；

图3dox不同时间点ripk3-2×fkbp表达量的变化；

图4dox与idimer诱导细胞死亡示意图；

图5caspase8抑制剂不能抑制dox与idimer诱导的细胞死亡示意图；

图6dox与idimer诱导mlkl蛋白磷酸化示意图；

图7dox与idimer可以快速诱导mlkl蛋白磷酸化；

图8dox和dimer诱导体系效率更高特异性更强。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明通过慢病毒包装体系嘌呤霉素筛选的方式，我们构建了可以诱导表达ripk3-2×fkbp的a549和hela细胞稳定细胞系，在细胞培养基中加入不同浓度的多西环素doxycycline(以下简称“dox”)诱导ripk3-2×fkbp蛋白的表达，然后进行免疫印迹实验，图1是ripk3-2×fkbp表达依赖于dox示意图；结果表明在a549和hela细胞中，ripk3-2×fkbp的表达量在dox的浓度为1μg/ml时就很高了，而对照中没有加入dox的细胞中并没有检测到ripk3-2×fkbp的表达。同时，在hela中1μg/mldox诱导效果甚至比4μg/ml和10μg/mldox还要好。这些结果表明加入的dox浓度为1μg/ml时，就有很强的诱导效果。如图2，dox诱导ripk3-2×fkbp表达的剂量依赖关系。

我们进一步对dox的浓度梯度进行摸索，稀释至0.001ng/ml，结果表明当dox浓度为100ng/ml时，ripk3-2×fkbp开始有表达，与dox诱导浓度为10μg/ml时ripk3-2×fkbp的表达量相比，1μg/mldox诱导的ripk3-2×fkbp表达量更高，这也与之前的结果是一致的。如图3所示dox不同时间点ripk3-2×fkbp表达量的变化。

接着我们又对时间梯度进行了摸索，鉴于之前dox浓度为1μg/ml时，就有很强的诱导效果。我们向能诱导表达ripk3-2×fkbp的hela细胞系中加入1μg/mldox进行诱导，并在不同的时间点检测ripk3-2×fkbp的表达，发现dox诱导后4hripk3-2×fkbp开始表达，并且随dox诱导时间的延长ripk3-2×fkbp的表达量逐渐升高。而用无四环素的血清培养的细胞中未检测到ripk3-2×fkbp的表达。图4为dox与idimer诱导细胞死亡示意图。图5为caspase8抑制剂不能抑制dox与idimer诱导的细胞死亡示意图。

向hela细胞中加入dox诱导12h后，再加入idimer，并在idimer加入后的0h，1h，2h，3h观察细胞的形态。我们发现与对照组加了dmso的细胞相比，加了dox与idimer的细胞发生了明显的死亡。如图所示，idimer加入后的1h细胞开始发生死亡，2h、3h其死亡程度进一步加剧，这就表明dox与idimer能诱导细胞发生死亡。当向培养基中加入caspase8抑制剂时，如图6所示，我们发现caspase抑制剂并不能抑制dox与idimer诱导的细胞死亡，反而进一步加剧了细胞的死亡。

dox与idimer能诱导细胞死亡，并且我们发现caspase抑制剂并不能抑制这种细胞死亡方式。这初步表明我们成功地诱导了细胞发生程序性坏死。为了进一步证实细胞发的是程序性坏死，我们对hela细胞进行药物处理，分析p-mlkl的表达水平。结果显示与对照相比，hela细胞中mlkl能被磷酸化，同时dox和idimer诱导体系能在hela细胞中高效工作。如图7所示，dox与idimer可以快速诱导mlkl蛋白磷酸化，图8所示dox和dimer诱导体系效率更高特异性更强。

接下来，我们用dox和idimer对细胞进行处理，并在不同的时间点检测p-mlkl表达水平。通过免疫印迹实验分析我们发现，hela细胞中只需要加入dox诱导12h，使ripk3-2×fkbp过表达就足以引起细胞发生程序性坏死，相比于对照dmso处理的细胞其p-mlkl水平明显升高。这些结果表明dox和idimer能快速诱导mlkl蛋白磷酸化。而用t+s+z诱导hela细胞发生程序性坏死时，其效果并不理想。甚至在诱导后6h都未检测到p-mlkl。相反，dox和dimer诱导体系则能更快的诱导hela细胞发生程序性坏死，甚至是只需要添加一种药物dox就足以诱导细胞发生程序性坏死，这就表明dox和dimer诱导体系更加快速，其效率更高，特异性也更强。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。