本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种基于crispr-cas9系统的小麦基因组编辑载体及其应用。
背景技术：
：：自上世纪80年代末，基于人工核酸内切酶的基因修饰技术开始发展，目前主要包括：第一代人工核酸内切酶锌指核酸酶(zfn)技术、第二代人工核酸内切酶转录激活子样效应物核酸酶(talen)技术、第三代人工核酸内切酶crispr-cas9核酸酶技术。zfn技术特异识别能力差，容易出现脱靶现象，引起其他目的基因突变和染色体畸变。此外，zfn的设计筛选耗时费力，成本高，因此限制了其更加广泛的应用。talen相对zfn技术脱靶几率小，细胞毒性小，一度得到广泛的应用。作为新兴的基因编辑技术，crispr-cas9具有无可比拟的优点:1.靶向精确性更高。rna靶向序列和基因组序列必须完全匹配，cas9才会对dna进行剪切。2.可实现对靶基因多个位点同时敲除。3.实验周期短，效率高。4.靶点多，无物种限制。小麦是由a、b、d三套基因组组成的异源六倍体，基因的平均拷贝数为2.8个，其中接近一半的基因(46％)有3-4个拷贝，12％的基因有1-2个拷贝，42％的基因拷贝数≥5个，因此迫切需要在小麦中建立重组酶介导的基因叠加转基因操作系统，实现dna叠加/删除，并利用该系统，在小麦中开发具有自主知识产权的目标株系。与传统的基因组编辑技术zfn和talen相比，利用crispr-cas9定点突变，成本更低，更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，对小麦基因功能的研究具有重要意义。中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞实验室从事植物基因组定点编辑技术研究，已在二穗短柄草、水稻等植物物种中建立了talen核酸酶介导的基因定点突变技术体系。2014年该实验室利用crispr-cas9系统实现tamlo-a在面包小麦原生质体和转基因植株中的定点突变。crispr-cas9基因编辑系统的载体均含有两个表达框——sgrna表达框和cas9表达框，cas9表达框表达的cas9基因编码一种核酸酶，sgrna表达框表达的带有靶序列的sgrna，引导cas9核酸酶在基因组上靶序列的位置对dna双链进行剪切。cas9基因和sgrna的表达水平以及sgrna的序列结构，都会影响基因编辑效率。本发明基于以上技术背景，通过比较crispr-cas9系统的转化载体，采用不同cas9启动子、不同sgrna启动子和不同sgrna序列结构时的基因编辑效率，获得了在小麦中编辑效率更高的crispr-cas9转化载体。此优化载体显著提高了小麦作物利用crispr-cas9进行基因编辑的效率，克服了小麦等作物中crispr-cas9载体转化后突变率低、获得crispr-cas9转基因突变株系难的问题，节约了转化时间，减少了转化成本，对crispr-cas9基因编辑系统在作物中的推广应用奠定了更好的基础。技术实现要素：本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。本发明提供了一种基因编辑效率更高的crispr-cas9基因编辑系统，可以广泛的应用于不同的作物，所述作物包括但不限于玉米、小麦、油菜、水稻、高粱、大豆、大麦和谷子等。为了提高作物中的基因编辑效率，本发明对crispr-cas9系统中的sgrna序列结构进行了改造和优化，改造后的sgrna结构命名为sgrna4tmc+5，其核苷酸序列如seqidno:20所示。实验发现，sgrna结构为sgrna4tmc+5(seqidno:20)结构的crrispr/cas9系统在转入小麦植株后，其基因编辑效率优于传统的sgrna结构和trna–grna结构。在本发明所提供的crispr-cas9基因编辑载体中，sgrna4tmc+5结构前还连有一个启动子，所述启动子包括但不限于tau3p、osu3p、tau6和osu6bp等启动子,优先为tau3启动子。上述crispr-cas9基因编辑系统还包含一个cas9基因，所述cas9基因的核苷酸序列如seqidno:5所示。更具体的，所述cas9基因的前面可操作性连接有一个启动子驱动其表达，所述启动子包括但不限于ubi和2*35s启动子，优选为ubi启动子。本发明还提供了一种植物基因的crispr-cas9编辑方法，所述方法中sgrna结构为sgrna4tmc+5，其核苷酸序列如seqidno:20所示。本发明所提供的crispr-cas9基因编辑方法中，sgrna4tmc+5结构前还连有一个启动子，所述启动子包括但不限于tau3p、osu3p、tau6和osu6bp等启动子,优先为tau3启动子。具体的，crispr-cas9基因编辑方法还包含一个cas9基因，所述cas9基因的核苷酸序列如seqidno:5所示。更具体的，所述cas9基因的前面可操作性连接有一个启动子驱动其表达，所述启动子包括但不限于ubi和2*35s启动子，优选为ubi启动子。本发明所提供的crispr-cas9基因编辑载体和方法，可以应用于对不同植物的基因组dna进行编辑，所述编辑包括但不限于通过该系统使得植物基因组dna出现碱基缺失或插入；还包括可以应用于条件性基因敲除、基因敲入、基因替换、点突变等领域。本发明还提供了一种获得小麦抗白粉病突变体的方法，所述方法采用crispr-cas9基因编辑方法，其特征在于所述基因编辑系统的靶标序列如seqidno:2所示。本发明所提供的获得小麦抗白粉病突变体的方法，其中所述的crispr-cas9基因编辑方法中的sgrna结构为sgrna4tmc+5结构，所述sgrna4tmc+5结构的核苷酸序列如seqidno:20所示。相比于现有技术，本发明所提供的crispr-cas9基因编辑方法和载体的优点是：显著提高麦crispr-cas9的编辑效率，克服小麦crispr-cas9载体转化后突变率低、获得crispr-cas9转基因突变株系难的问题，节约了转化时间，减少了转化成本。附图说明图1为p286和p294载体结构示意图。tamlo-a为小麦tamlo-a基因上的靶序列，sgrna为singleguiderna编码序列，amp为载体氨苄青霉素抗性位点。图2为p286和p294载体基因编辑效率比较结果图。plasmid为质粒示意，draii为限制性内切酶，“+/-”分别为加入/未加入draⅱ内切酶，mutationrate为突变效率。图3为p342、p338、p295和p341载体结构示意图。l475小麦基因组上的靶序列，sgrna为singleguiderna编码序列，amp为载体氨苄青霉素抗性位点。图4为p342、p338、p295和p341载体基因编辑效率比较结果图。plasmid为质粒示意，bani为限制性内切酶，“+/-”分别为加入/未加入bani内切酶，mutationrate为突变效率。图5为p345和p349载体结构示意图。l475小麦基因组上的靶序列，sgrna为singleguiderna编码序列，sgrna4tmc+5为优化的singleguiderna编码序列，trna为trnagly编码序列，amp为载体氨苄青霉素抗性位点。图6为p342，p345和p349载体基因编辑效率比较结果图。plasmid为质粒示意，bani为限制性内切酶，“+/-”分别为加入/未加入bani内切酶，mutationrate为突变效率。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。本发明中若无特别说明，原料均可市购获得，方法为本领域的常规方法。实施例一：选择用于驱动cas9基因的启动子本实验以小麦白粉病基因tamlo-a基因上的一段核苷酸序列作为靶序列，通过比较不同启动子驱动cas9基因表达时crispr-cas9系统载体的基因编辑效率，优化crispr-cas9系统的载体。1.载体说明p286载体和p294载体均包含两个表达框——sgrna表达框和cas9表达框，其差别在于cas9表达框的启动子不同，p286载体采用2*35s启动子驱动cas9基因的表达，p294载体采用ubi启动子驱动cas9基因的表达。具体地讲：p286载体包括tau6p::tamlo-a-sgrna表达框和2*35s::cas9表达框。tau6p::tamlo-a-sgrna表达框元件包括tau6p启动子(seqidno:1)、tamlo-a基因上的靶序列(seqidno:2)和sgrnascaffold(seqidno:3)；tau6p启动子来源于小麦cb037，tamlo-a基因上的靶序列和sgrnascaffold为根据文章公布序列人工合成片段。2*35s::cas9表达框包括2*35s启动子(seqidno:4)、cas9片段(seqidno:5)和camv终止子(seqidno:6)；2*35s启动子和camv终止子分别来源于质粒pgigi和plgz2，cas9为根据文章公布序列人工合成片段(yanpengwang,xicheng,qiweishan,yizhang,jinxingliu,caixiagao&jin-longqiu.simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.nat.biotech.2014,32:947-951)。p286载体结构见图1a。p294载体包括tau6p::tamlo-a-sgrna和ubi::cas9两个表达框。tau6p::tamlo-a-sgrna表达框如前所述，ubi::cas9表达框包括ubi启动子(seqidno:7)、cas9基因(seqidno:5)和camv终止子(seqidno:6)，ubi启动子来源于小麦基因枪常规转化载体pahc20。p294载体结构见图1b。2.不同载体的基因编辑效率比较利用peg法将p286、p294、gfp质粒转化小麦叶片原生质体，gfp质粒作为原生质体转化的阳性对照和基因编辑的阴性对照。24℃培养48小时后，收集原生质体。利用pcr/re(polymerasechainreaction/restrictiondigestion)方法对不同质粒的基因编辑效率进行检测和比较。首先，提取原生质体的基因组dna，扩增tamlo-a片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增目的条带单一。扩增引物如下：p1：5’-tggcgctggtcttcgccgtcatgatcatcgtc-3’(seqidno:8)p2：5’-tacgatgagcgccaccttgcccgggaa-3’(seqidno:9)然后，利用限制性内切酶draii(靶序列中包含的限制性酶切位点)对pcr产物进行酶切，并电泳检测。结果如图2所示：作为基因编辑阴性对照的gfp样品，其pcr产物被完全酶切开，而转化p286和p294质粒的pcr产物不能被完全切开。通过imagej软件计算未切开dna片段占酶切总dna量的百分比，即该样品的突变效率。经计算，p286样品的突变率为2.6％，p294样品的突变率为7.6％，p294样品突变效率高于p286样品，因此在小麦crispr-cas9转化系统中，ubi-cas9编辑效率优于2*35scas9。说明在针对小麦的crispr-cas9基因编辑系统中，用ubi启动子驱动cas9表达，可以提高crispr-cas9基因编辑系统的编辑效率。实施例二选择用于驱动sgrna表达的启动子为了进一步提高小麦crispr-cas9的编辑效率，我们在小麦原生质体体系中比较了不同snorna启动子驱动sgrna表达时，crispr-cas9载体对小麦基因组序列的编辑效率。目前植物中常用于驱动sgrna表达的snorna启动子有tau3p(seqidno:10)、osu3p(seqidno:11)、tau6(seqidno:1)和osu6bp(seqidno:12)，也是本实验重点比较的几个启动子。1.载体说明p342载体(图3a)、p338载体(图3b)、p295载体(图3c)和p341载体(图3d)均包含两个表达框——sgrna表达框和cas9表达框。cas9表达框均包括ubi启动子(seqidno:7)、cas9片段(seqidno:5)和camv终止子(seqidno:6)，靶序列均为小麦基因组序列l475(seqidno:13)，其差别在于驱动sgrna表达的启动子不同。p343载体用的是tau3启动子(seqidno:10)，来源于中国春小麦；p339载体用的是osu3启动子(seqidno:11)，来源于水稻中花11；p340载体用的是tau6启动子(seqidno:1)，来源于小麦cb037；p333载体用的是osu6b启动子(seqidno:12)，来源于日本晴水稻。2.不同载体的基因编辑效率比较利用peg法将p342、p338、p295、p341和gfp质粒转化小麦叶片原生质体，gfp质粒作为原生质体转化的阳性对照和基因编辑的阴性对照。24℃培养48小时后，收集原生质体。利用pcr/re(polymerasechainreaction/restrictiondigestion)方法对不同质粒的基因编辑效率进行检测和比较，具体步骤如下：首先，提取原生质体的基因组dna，扩增包含靶序列l475的dna片段。由于小麦是由a、b、d三套基因组组成的异源六倍体，三套基因组均包含靶序列l475(seqidno.13)，因此需要分别扩增三套基因组中包含靶序列l475的dna片段——l475a、l475b和l475d。扩增引物如下：p3：5’-ttcggggttttgcatgtcagctagtacggag-3’(seqidno:14)p4：5’-gtggacacgaaccgctgc-3’(seqidno:15)p5：5’-gacgctgtgatgatcaatggtgccgtg-3’(seqidno:16)p6：5’-agcgcgtccgtgaagtgctcctggttc-3’(seqidno:17)p7：5’-gacgctgtgatgaccaatggtgccatac-3’(seqidno:18)p8：5’-cgacgtgtcggccagcgca-3’(seqidno:19)其中p3和p4用于l475a的扩增，p5和p6用于l475b的扩增，p7和p8用于l475d的扩增。经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增目的条带均单一。然后，利用限制性内切酶bani(靶序列中包含的限制性酶切位点)对pcr产物进行酶切，并电泳检测。结果如图4所示：作为基因编辑阴性对照的gfp样品，其pcr产物被完全酶切开，而转化p342、p338、p295和p341质粒的pcr产物不能被完全切开。通过imagej软件计算未切开dna片段占酶切总dna量的百分比，即该样品的突变效率。经计算，l475a的突变率依次为10.4％、4.5％、0.2％、4.6％；l475b的突变率依次为11.3％、4.2％、0、3.0％；l475d的突变率依次为9.1％、3.0％、0.3％、3.6％。说明在针对小麦的crispr-cas9基因编辑系统中，用tau3启动子驱动sgrna的表达，可以进一步提高crispr-cas9基因编辑系统的编辑效率。实施例三sgrna不同序列结构的筛选在水稻crrispr-cas9基因编辑系统的研究中，利用trna转录系统表达sgrna，可以提高sgrna的表达了，从而提高crrispr-cas9的基因编辑效率；而在人类细胞的研究中发现，crispr-cas9系统采用不同sgrna序列结构时的基因编辑效率差别非常大。在小麦中，还没有关于sgrna表达方式及其序列结构对基因编辑效率影响的研究和报道。为了进一步优化小麦crispr-cas9系统的载体，提高对小麦基因组序列的编辑效率，我们以小麦基因组序列l475作为靶序列(seqidno:13),对含有不同sgrna序列结构的crispr-cas9载体的基因编辑效率进行了比较。1.载体说明p342载体(图3a)、p345载体(图5a)和p349载体(图5b)和p341载体(图3d)均包含两个表达框——sgrna表达框和cas9表达框。cas9表达框均包括ubi启动子(seqidno:7)、cas9片段(seqidno:5)和camv终止子(seqidno:6)，靶序列均为小麦基因组序列l475(seqidno.13)，驱动sgrna表达的启动子均为tau3启动子，其区别在于sgrna的序列结构不同。p342载体中的sgrna为目前最常用的sgrna序列(seqidno：3)；p345载体中的sgrna为sgrna4tmc+5(seqidno:20，人工合成)；p349载体中的sgrna前面加了trna(seqidno:21，来源于中国春小麦),靶序列位于trna和sgrna之间。2.不同载体的基因编辑效率比较利用peg法将p342、p345、p349和gfp质粒转化小麦叶片原生质体，gfp质粒作为原生质体转化的阳性对照和基因编辑的阴性对照。24℃培养48小时后，收集原生质体。利用pcr/re(polymerasechainreaction/restrictiondigestion)方法对不同质粒的基因编辑效率进行检测和比较，具体步骤如下：首先，提取原生质体的基因组dna，扩增包含靶序列l475的dna片段。由于小麦是由a、b、d三套基因组组成的异源六倍体，三套基因组均包含靶序列l475，因此需要分别扩增三套基因组中包含靶序列l475的dna片段——l475a、l475b和l475d。扩增引物同实施例二，经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增目的条带均单一。然后，利用限制性内切酶bani(靶序列中包含的限制性酶切位点)对pcr产物进行酶切，并电泳检测。结果如图6所示：作为基因编辑阴性对照的gfp样品，其pcr产物被完全酶切开，而转化p342、p345和p349质粒的pcr产物不能被完全切开。通过imagej软件计算未切开dna片段占酶切总dna量的百分比，即该样品的突变效率。经计算，l475a的突变率依次为12.1％、31.8％、8.2％；l475b的突变率依次为11.6％、22.8％、7.8％；l475d的突变率依次为7.7％、19.7％、4.9％。说明在针对小麦的crispr-cas9基因编辑系统中，sgrna为sgrna4tmc+5序列时(seqidno：20)，可以显著提高crispr-cas9系统的编辑效率。综上所述，本发明系统地比较了驱动cas9基因表达的启动子、驱动sgrna表达的启动子和sgrna的序列结构对小麦基因编辑效率的影响，结果表明利用ubi启动子优于2*35s启动子，tau3启动子优于osu3启动子、tau6启动子和osu6b启动子，sgrna4tmc+5优于传统的sgrna和trna-grna结构。综合上述结果，最终获得小麦crrispr-cas9的优化载体tau3p::sgrna4tmc+5-ubi::cas9-puc19。此优化载体将显著提高麦crispr-cas9的编辑效率，克服小麦crispr-cas9转化突变率低、获得crispr-cas9转基因突变株系难的问题，节约转化时间，减少转化成本。sequencelisting<110>未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司<120>一种基于crispr-cas9系统的基因编辑载体及其应用<130><160>21<170>patentinversion3.3<210>1<211>360<212>dna<213>小麦（triticumaestivuml）<400>1gaccaagcccgttattctgacagttctggtgctcaacacatttatatttatcaaggagca60cattgttactcactgctaggagggaatcgaactaggaatattgatcagaggaactacgag120agagctgaagataactgccctctagctctcactgatctgggcgcatagtgagatgcagcc180cacgtgagttcagcaacggtctagcgctgggcttttaggcccgcatgatcgggctttgtc240gggtggtcgacgtgttcacgattggggagagcaacgcagcagttcctcttagtttagtcc300cacctcgcctgtccagcagagttctgaccggtttataaactcgcttgctgcatcagactt360<210>2<211>20<212>dna<213>小麦（triticumaestivuml）<400>2ggagattgggtcctgcgtga20<210>3<211>112<212>dna<213>人工合成（artificialsynthesis）<400>3gctcgcaggtgaacacaacacctgcacacgttttagagctagaaatagcaagttaaaata60aggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt112<210>4<211>766<212>dna<213>人工合成（artificialsynthesis）<400>4cctactccaaaaatgtcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttc60aacaaagggtaatttcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttca120tcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaa180aggctatcattcaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacga240ggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtg300acatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccacccctactccaaaaatgtcaaag360atacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttcaacaaagggtaatttcgggaa420acctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaagg480aaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcattcaagatgcct540ctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaag600acgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgacatctccactgacgtaaggg660atgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttc720atttggagaggacagcccaagcttccaccatggcgtgcaggtcgac766<210>5<211>4206<212>dna<213>人工合成<400>5atggcccctaagaagaagagaaaggtcggtattcacggcgttcctgcggcgatggacaag60aagtatagtattggtctggacattgggacgaattccgttggctgggccgtgatcaccgat120gagtacaaggtcccttccaagaagtttaaggttctggggaacaccgatcggcacagcatc180aagaagaatctcattggagccctcctgttcgactcaggcgagaccgccgaagcaacaagg24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