技术领域:
本发明属于微生物基因工程领域,具体涉及一种非典型角环素类化合物nenestatina的生物合成基因簇及其应用。
背景技术:
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nenestatina属于非典型角环素类化合物,由小单孢菌(m.echinospora)scsio04089产生。近年来蓬勃发展起来的组合生物合成技术,为改造nenestatina的生产菌scsio04089带来了新的机遇。在学习自然界非典型角环素类化合物生物合成机理的基础上,采用组合生物合成技术对化合物的生物合成基因、调控基因进行体内敲除、突变、置换和重组等操作,不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物,而且还可以提高天然产物的产量,或定向积累所需要的天然产物,为天然产物的发现和药物开发提供化合物和生物活性多样化。迄今为止,有关非典型角环素类化合物nenestatina的生物合成基因簇、氧化酶nes27等生物合成关键酶的生物催化机理及应用方面的研究,国内外尚未研究清楚。
技术实现要素:
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本发明的目的是提供一种非典型角环素类化合物nenestatina的生物合成基因簇及其应用。
本发明是以南海北部深海沉积物来源小单孢菌(m.echinospora)scsio04089中非典型角环素类化合物nenestatina为目标分子,在筛选到生物合成基因簇的基础上,综合运用分子生物学、微生物学、合成生物学、生物化学以及有机化学相结合的技术,阐述nenestatina的生物合成机制,为利用组合生物合成方法修饰改造nenestatina类化合物提供依据,为药物筛选提供化合物实体。
本发明的第一个目的是提供非典型角环素类化合物nenestatina的生物合成基因簇,来源于南海北部深海沉积物小单孢菌(m.echinospora)scsio04089,该生物合成基因簇的核苷酸序列如seqidno.1的第3153-68576位的碱基序列所示,包含60个基因,具体为:
1)nes1位于基因簇核苷酸序列3153-3635个碱基处,长度为483bp,编码未知功能蛋白,160个氨基酸。
2)nes2位于基因簇核苷酸序列3788-4618个碱基处,长度为831bp,编码abc转运蛋白,276个氨基酸。
3)nes3位于基因簇核苷酸序列4615-5574个碱基处,长度为960bp,编码abc转运蛋白,319个氨基酸。
4)nes4位于基因簇核苷酸序列5670-6095个碱基处,长度为426bp,编码醛酮变位酶/博来霉素抗性蛋白/双加氧酶,141个氨基酸。
5)nes5位于基因簇核苷酸序列6215-6991个碱基处,长度为777bp,编码推测的蛋白,258个氨基酸。
6)nes6位于基因簇核苷酸序列7114-7926个碱基处,长度为813bp,编码sarp家族调控蛋白,270个氨基酸。
7)nes7位于基因簇核苷酸序列9201-10049个碱基处,长度为849bp,编码arac家族的转录调控因子,282个氨基酸。
8)nes8位于基因簇核苷酸序列10479-11873个碱基处,长度为1395bp,编码arac家族的转录调控因子,464个氨基酸。
9)nes9位于基因簇核苷酸序列11953-12618个碱基处,长度为666bp,编码ndp-己糖2,3脱水酶,221个氨基酸。
10)nes10位于基因簇核苷酸序列12655-13101个碱基处,长度为447bp,编码羧酸粘康酸内酯脱羧酶,148个氨基酸。
11)nes11位于基因簇核苷酸序列13171-14025个碱基处,长度为855bp,编码谷氨酰基水解酶/氨基转移酶,284个氨基酸。
12)nes12位于基因簇核苷酸序列14542-16191个碱基处,长度为1650bp,编码fad依赖的单加氧酶,549个氨基酸。
13)nes13位于基因簇核苷酸序列16329-17798个碱基处,长度为1470bp,编码原卟啉氧化酶,489个氨基酸。
14)nes14位于基因簇核苷酸序列17907-18959个碱基处,长度为1053bp,编码核酸酶,350个氨基酸。
15)nes15位于基因簇核苷酸序列19096-20577个碱基处,长度为1482bp,编码fad依赖的单加氧酶,493个氨基酸。
16)nes16位于基因簇核苷酸序列20574-22034个碱基处,长度为1461bp,编码fad依赖的单加氧酶,486个氨基酸。
17)nes17位于基因簇核苷酸序列22272-23000个碱基处,长度为729bp,编码短链脱氢酶/还原酶,242个氨基酸。
18)nes18位于基因簇核苷酸序列23075-23920个碱基处,长度为846bp,编码nmra家族蛋白,281个氨基酸。
19)nes19位于基因簇核苷酸序列23983-24600个碱基处,长度为618bp,编码dsba氧化还原酶,205个氨基酸。
20)nes20位于基因簇核苷酸序列24663-24992个碱基处,长度为330bp,编码聚酮合成酶/环化酶,109个氨基酸。
21)nes21位于基因簇核苷酸序列25036-25821个碱基处,长度为786bp,编码聚酮合成,酮基还原酶,261个氨基酸。
22)nes22位于基因簇核苷酸序列26017-27054个碱基处,长度为1038bp,编码氧甲基转移酶,345个氨基酸。
23)nes23位于基因簇核苷酸序列27109-28620个碱基处,长度为1512bp,编码fad依赖的单加氧酶,503个氨基酸。
24)nes24位于基因簇核苷酸序列28647-29606个碱基处,长度为960bp,编码聚酮合成,酮基还原酶,319个氨基酸。
25)nes25位于基因簇核苷酸序列29603-31039个碱基处,长度为1437bp,编码fad依赖的单加氧酶,478个氨基酸。
26)nes26位于基因簇核苷酸序列31026-32504个碱基处,长度为1479bp,编码fad依赖的单加氧酶,492个氨基酸。
27)nes27位于基因簇核苷酸序列32561-33304个碱基处,长度为744bp,编码蒽酮氧化酶,247个氨基酸。
28)nes28位于基因簇核苷酸序列33373-35256个碱基处,长度为1884bp,编码未知功能蛋白,627个氨基酸。
29)nes29位于基因簇核苷酸序列35237-35593个碱基处,长度为357bp,编码4fe-4s铁氧还蛋白,118个氨基酸。
30)nes30位于基因簇核苷酸序列35668-36462个碱基处,长度为795bp,编码未知功能蛋白,264个氨基酸。
31)nes31位于基因簇核苷酸序列36499-37992个碱基处,长度为1494bp,编码谷氨酰胺合成酶,497个氨基酸。
32)nes32位于基因簇核苷酸序列37995-39413个碱基处,长度为1419bp,编码酰胺酶,472个氨基酸。
33)nes33位于基因簇核苷酸序列39624-40910个碱基处,长度为1287bp,编码腺苷酸琥珀酸裂合酶,428个氨基酸。
34)nes34位于基因簇核苷酸序列40894-41295个碱基处,长度为402bp,编码n-乙酰基转移酶,133个氨基酸。
35)nes35位于基因簇核苷酸序列41406-43172个碱基处,长度为1767bp,编码abc转运蛋白,588个氨基酸。
36)nes36位于基因簇核苷酸序列43575-43904个碱基处,长度为330bp,编码rieske型非血红素铁加氧酶,109个氨基酸。
37)nes37位于基因簇核苷酸序列44148-44558个碱基处,长度为411bp,编码醛酮变位酶,136个氨基酸。
38)nes38位于基因簇核苷酸序列44642-45442个碱基处,长度为801bp,编码醛酮变位酶,266个氨基酸。
39)nes39位于基因簇核苷酸序列45500-47050个碱基处,长度为1551bp,编码分泌肽酶,516个氨基酸。
40)nes40位于基因簇核苷酸序列47571-48692个碱基处,长度为1122bp,编码糖基转移酶,373个氨基酸。
41)nes41位于基因簇核苷酸序列48689-49708个碱基处,长度为1020bp,编码氧甲基转移酶(糖合成),339个氨基酸。
42)nes42位于基因簇核苷酸序列50074-51006个碱基处,长度为933bp,编码氮甲基转移酶(糖合成),310个氨基酸。
43)nes43位于基因簇核苷酸序列51054-52055个碱基处,长度为1002bp,编码nad依赖的差向异构酶/脱水酶(糖合成),333个氨基酸。
44)nes44位于基因簇核苷酸序列52042-52767个碱基处,长度为726bp,编码甲基转移酶(糖合成),241个氨基酸。
45)nes45位于基因簇核苷酸序列52764-53873个碱基处,长度为1110bp,编码氨基转移酶(糖合成),369个氨基酸。
46)nes46位于基因簇核苷酸序列53897-54508个碱基处,长度为612bp,编码ndp-4酮-6-脱氧己糖3,5-差向异构酶(糖合成),203个氨基酸。
47)nes47位于基因簇核苷酸序列54685-55680个碱基处,长度为996bp,编码ndp-己糖-3-酮基还原酶(糖合成),331个氨基酸。
48)nes48位于基因簇核苷酸序列55735-56451个碱基处,长度为717bp,编码推测的蛋白,238个氨基酸。
49)nes49位于基因簇核苷酸序列56544-57596个碱基处,长度为1053bp,编码糖基转移酶,350个氨基酸。
50)nes50位于基因簇核苷酸序列57789-59009个碱基处,长度为1221bp,编码脱氧糖氨基转移酶(糖合成),406个氨基酸。
51)nes51位于基因簇核苷酸序列59205-60278个碱基处,长度为1074bp,编码dtdp-葡萄糖4,6脱水酶(糖合成),357个氨基酸。
52)nes52位于基因簇核苷酸序列60275-61546个碱基处,长度为1272bp,编码聚酮合成酶,423个氨基酸。
53)nes53位于基因簇核苷酸序列61543-62841个碱基处,长度为1299bp,编码聚酮链长因子,442个氨基酸。
54)nes54位于基因簇核苷酸序列62829-63083个碱基处,长度为255bp,编码酰基转运蛋白,84个氨基酸。
55)nes55位于基因簇核苷酸序列63065-64102个碱基处,长度为1038bp,编码酰基转移酶,345个氨基酸。
56)nes56位于基因簇核苷酸序列64219-65196个碱基处,长度为978bp,编码酰基转移酶,325个氨基酸。
57)nes57位于基因簇核苷酸序列65225-65554个碱基处,长度为330bp,编码酰基载体蛋白,109个氨基酸。
58)nes58位于基因簇核苷酸序列65681-66136个碱基处,长度为456bp,编码转录调控因子,151个氨基酸。
59)nes59位于基因簇核苷酸序列66215-67639个碱基处,长度为1425bp,编码丙酰coa羧化酶β亚基,474个氨基酸。
60)nes60位于基因簇核苷酸序列67704-68576个碱基处,长度为873bp,编码dtdp-1-葡萄糖合成酶,290个氨基酸。
seqidno.1所示序列的第3153-68576位核苷酸序列的互补序列可根据dna碱基互补原则随时得到,且第3153-68576位的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(pcr)或用合适的限制性内切酶酶切相应dna或dna重组技术获得。本发明提供了构建至少包含部分seqidno.1所示序列的第3153-68576位中dna片段的重组dna载体途径。
本发明还提供了nenestatina生物合成基因被中断或其他基因改造的途径,至少其中之一的基因包含有seqidno.1的第3153-68576位中的核苷酸序列。
本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列,可使用pcr探针法等技术,从其他生物体重筛选获得nenestatina生物合成基因簇同源基因。
本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列,可用于m.echinosporascsio04089基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列,也包含m.echinosporascsio04089基因组中邻近区域未克隆dna。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的dna片段,可以被体内外突变等修饰,包括插入、置换、缺失、易错聚合酶链式反应、位点特异性突变、不同序列重组、定向进化等。
包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆,可以通过合适表达系统在外源宿主中表达生产相应酶或者提高生物活性化合物产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、假单胞菌、芽孢杆菌、酵母及动植物等。
本发明提供的氨基酸序列可以用于分离所需蛋白并可用于抗体制备。
包含本发明所提供的氨基酸序列或者至少部分序列的多肽,可能在去除或者替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至新的生物活性,或提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。
包含本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达及揭示它们在宿主代谢中的功能。
包含本发明所提供核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过dna重组技术构建重组载体,以获得新型生物合成途径,也可以通过插入、置换、缺失或失活,进而获得其他基于生物合成途径的新结构化合物。
本发明的第二个目的是提供非典型角环素类化合物nenestatina的生物合成基因簇在制备非典型角环素类化合物nenestatina或其类似物中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种蒽醌氧化酶基因nes27,其特征在于,其核苷酸序列如seqidno.1的第32561-33304位的碱基序列所示。
本发明的第四个目的是提供上述蒽醌氧化酶基因nes27编码的蒽醌氧化酶nes27。
本发明的第五个目的是提供蒽醌氧化酶nes27在催化式1所示的化合物ethyl-dehydrorabelomycin形成式2所示的化合物ethyl-kinobscurinone中的应用
本发明的第六个目的是提供一种缺失上述蒽醌氧化酶基因nes27的基因工程菌。
所述的基因工程菌优选为小单孢菌(micromonosporaechinospora)scsio04089。
本发明的第七个目的是提供缺失上述的蒽醌氧化酶基因nes27的基因工程菌在制备式1所示的化合物ethyl-dehydrorabelomycin中的应用
总之本发明所提供的包括nenestatina生物合成相关的所有基因和蛋白信息,可以帮助人们理解角环素类天然产物的生物合成机制,为进一步遗传改造提供材料和理论基础。本发明所提供的基因和蛋白质可以用来寻找和发现可用于医药、卫生或农业的nenestatina类化合物、基因或蛋白。
本发明的小单孢菌(micromonosporaechinospora)scsio04089于2017年1月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc),地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,其保藏编号为gdmccno:60142。
附图说明:
图1是nenestatina和ethyl-dehydrorabelomycin的化学结构式。
图2是nenestatina产生菌株小单孢菌(m.echinospora)scsio04089最适发酵培养基的摸索;培养基n4为最适培养基,其中1表示化合物nenestatina。
图3是nenestatina生物合成基因簇示意图。包括了重叠覆盖nenestatina生物合成基因簇的阳性克隆子pcsg4102、pcsg4103和pcsg4104。其中,nes1、nes5、nes9~11、nes19、nes30、nes39和nes59为functionunknown,nes2~4、nes14、nes35~38为transportandresistance,nes6、nes7和nes58为regulation,nes8、nes13、nes41~48、nes50、nes51和nes60为sugarbiosynthesis,nes12、nes15~17和nes20~27为tailoringofpolyketidescaffold,nes18为dimerization,nes28、nes29、nes31~34为diazogroupbiosynthesis,nes40和nes49为glycosyltransferases,nes52~57为typeiipolyketidesynthaseandstarterunitbiosunthesis,orf(-1)和orf(+1)为unrelatedgenes。
图4是nenestatina生物合成基因簇的鉴定。(a)nes52-54基因缺失示意图;(b)nes52-54基因缺失pcr验证图,泳道m为dl2000dnamarker,泳道1模板为野生菌株m.echinosporascsio04089,泳道2模板为nes52-54基因缺失突变株nes001;(c)hplc检测野生菌株m.echinosporascsio04089((i)wildstrain)和突变株nes001((ii)δnes52-54),其中1表示化合物nenestatina。
图5是蒽醌氧化酶nes27基因缺失突变株的鉴定。(a)nes27基因缺失示意图;(b)nes27基因缺失pcr验证图,泳道m为dl2000dnamarker,泳道1模板为突变株nes002,泳道2模板为野生菌株m.echinosporascsio04089;(c)hplc检测野生菌株m.echinosporascsio04089((i)wildstrain)和突变株nes002((ii)δnes27),其中1表示化合物nenestatina,2表示化合物ethyl-dehydrorabelomycin。
图6是推测的nenestatina的生物合成途径。
图7是nenestatina质谱图。
图8是nenestatina在dmso-d6中nmr谱图。a为nenestatina的h谱;b为nenestatina的c谱;c为nenestatina的dept135谱;d为nenestatina的hsqc谱;e为nenestatina的cosy谱;f为nenestatina的hmbc谱。
图9是nenestatina在cd3od中nmr谱图。a为nenestatina的h谱;b为nenestatina的c谱;c为nenestatina的dept135谱;d为nenestatina的hsqc谱;e为nenestatina的cosy谱;f为nenestatina的hmbc谱。
图10是ethyl’-dehydrorabelomycin质谱图。
图11是ethyl’-dehydrorabelomycinnmr谱图。a为ethyl’-dehydrorabelomycin的h谱;b为ethyl’-dehydrorabelomycin的c谱;c为ethyl’-dehydrorabelomycin的dept135谱;d为ethyl’-dehydrorabelomycin的hsqc谱;e为ethyl’-dehydrorabelomycin的cosy谱;f为ethyl’-dehydrorabelomycin的hmbc谱。
具体实施方式:
以下实施例是对本发明的进一步说明,而不是对本发明保护范围的限制。
1.nenestatina产生菌株m.echinosporascsio04089最适发酵培养基优化
菌株m.echinosporascsio04089分离自中国南海北部深海沉积物中,为充分挖掘该菌株次级代谢产物产生能力,通过8种培养基筛选最适培养基,培养基组成分别为:(1)n4培养基:淀粉15g,鱼蛋白胨8g,细菌学蛋白胨5g,甘油6ml,caco32g,kbr0.2g,海盐10g,加水定容至1l,ph7.0;(2)am6-1培养基:可溶性淀粉20g,甘油10g,甘氨酸0.1g,丙氨酸0.1g,苏氨酸0.1g;异亮氨酸0.1g,酵母粉5g,caco35g,海盐30g,加水定容至1l,ph7.0;(3)am6-4培养基:甘油10g,蛋白胨5g,甘氨酸0.1g,丙氨酸0.1g,caco35g,海盐30g,加水定容至1l,ph7.0;(4)ra培养基:葡萄糖10g,可溶性淀粉20g,麦芽提取粉10g,玉米粉5g,海盐30g,微量元素(每升微量元素含有feso4·h2o0.1g,mncl2·4h2o0.1g和znso4·7h2o0.1g,余量为水)100μl,加水定容至1l,ph7.2-7.4;(5)isp2培养基:葡萄糖4g,麦芽提取粉10g,酵母粉5g,海盐30g,加水定容至1l,ph7.2-7.4;(6)isp4培养基:淀粉10g,(nh4)2so42g,k2hpo41g,caco31g,mgso4·7h2o1g,微量元素(每升微量元素含有feso4·h2o0.1g,mncl2·4h2o0.1g,znso4·7h2o0.1g,余量为水)100μl,海盐30g,加水定容至1l,ph7.2-7.4;(7)yms培养基:酵母粉4g,麦芽提取物10g,可溶性淀粉5g、氯化钴50mg,海盐30g,加水定容至1l,ph7.2-7.4;(8)am2ab培养基:可溶性淀粉5g、葡萄糖20g、酵母粉2g、蛋白胨2g、黄豆粉5g、mgso4·7h2o0.5g、k2hpo40.5g、氯化钠4g、海盐30g、碳酸钙2g,加水定容至1l,ph7.2-7.4。28℃,200r/min振荡培养7天的发酵粗提物hplc检测显示n4培养基有明显的次级代谢产物产生(图2)。
2.化合物nenestatina的分离鉴定
将菌种m.echinosporascsio04089接种至isp4平板培养基上,28℃培养7天,接种于一级种子培养基(a1培养基:淀粉10克,酵母提取粉4克,细菌学蛋白胨2克,海盐30克,加水定容至1l,ph7.0)中(50ml培养基/250ml三角瓶),28℃,200r/min振荡培养3天作为一级发酵种子,吸取该一级种子液2ml接种到二级种子培养基(a1培养基)中(50ml培养基/250ml三角瓶),28℃,200r/min振荡培养2天作为二级发酵种子,将生长良好的二级种子液以20%(v/v)的接种量接入发酵培养基(n4培养基:淀粉15克,鱼蛋白胨8克,细菌学蛋白胨5克,甘油6毫升,碳酸钙2克,溴化钾0.2克,海盐10克,加水定容至1升,ph7.0)中(200ml培养基/1000ml三角瓶),28℃,200r/min培养7~10天。
发酵结束,离心收集发酵液,上清液过大孔树脂吸附3次,后用丙酮洗脱3次,旋转蒸发回收丙酮,水相用丁酮萃取,旋转蒸发丁酮萃取液得到发酵液浸膏;菌丝体用丙酮浸泡,旋转蒸发回收丙酮,水相用丁酮萃取,旋转蒸发丁酮萃取液得到菌丝体浸膏,合并得粗浸膏。粗浸膏首先使用正向硅胶(100-200目,100g)梯度洗脱(chcl3/meoh/h2o,95/5/0.5,90/10/1,v/v,每次600ml)得到2个组分(fr.1-fr2),其中组分fr2经过odscolumn(50μm,ymc*gelods-a-hg,30g)在agelacheetahtmmp200mplc工作站上进行洗脱(ch3oh/h2o,体积分数为10%-100%)进行1.5小时的梯度洗脱,获得5个亚馏分(fr.2.1tofr.2.5),其中组分fr2.2经过反向高压制备得到nenestatina[制备条件:phenomenexodscolumn(250mm×10.0mmi.d.,5μm;phenomenexphenomenexodscolumn(250mm×10.0mmi.d.,5μm;phenomenex,流动相a,0.1%formicacidinwater;流动相b,90%ch3cninwater;在流动相b为55%的条件下等度洗脱;流速为2.5ml/min,保留时间为13min时得到nenestatina)。
3.nenestatina的生物合成基因簇的克隆与功能预测
nenestatina为非典型角环素类化合物,通过对菌株m.echinosporascsio04089进行全基因组扫描和注释,分析到65kb的nenestatina生物合成基因簇,共包含60个开放阅读框(openreadingframes,orfs),详细基因注释如表1所示。
表1nenestatina生物合成基因簇中基因功能预测
依据分析到的基因簇序列设计特异引物(表2),从构建的菌株m.echinosporascsio04089基因组文库中筛选出包含有目的片段的阳性克隆,阳性克隆子经末端测序及限制性内切酶酶切分析,最终确定3个cosmids,即pcsg4102,pcsg4103,pcsg4104可重叠覆盖nenestatina的生物合成基因簇(图3)。
表2本发明中使用的引物
4.nenestatina的生物合成基因簇的确定
为进一步确定所克隆的nenestatina生物合成基因簇的正确性,构建了菌株m.echinosporascsio04089的遗传操作系统,并选取其中的聚酮链延伸基因nes52-54进行缺失,构建突变株nes001,突变过程示意图和突变株pcr验证如图4(a)和4(b)所示,hplc显示突变株nes001丧失了产生nenestatina的能力(图4(c),(ii)),实验结果进一步证明克隆到的nenestatina的生物合成基因簇的正确性。
5.基因nes27功能验证及代谢中间体分离鉴定
选取生物合成基因簇中的蒽醌氧化酶基因nes27进行中断缺失,构建双交换突变株,突变过程示意图和突变株pcr验证如图5(a)和5(b)所示。构建的δnes27突变株nes002丧失了产生nenestatina的能力(图5(c),(ii)),而累积一个新的代谢中间产物,经发酵分离纯化,质谱、nmr解析确定了单体化合物的结构式。命名为ethyl-dehydrorabelomycin(图1),基因nes27的缺失结果进一步证明克隆到的nenestatina的生物合成基因簇的正确性。
6.nenestatina的生物合成机制推导
根据生物信息学分析,推导了nenestatina的生物合成机制。聚酮链的起始单元为丙酰-coa,由甲基丙二酰coa通过nes55-nes57脱羧生成,随后通过nes52-nes54添加9个延伸单元(丙二酰coa)生成全长聚酮链,在经过酮基还原(nes21)、环化作用(nes20和nes24)和氧化作用生成ethyl-dehydrorabelomycin,经过nes27氧化开环、闭环生成ethyl-kinobscurinone,在重氮形成酶nes28、nes29和nes31-nes34等6个酶的作用下添加重氮基团生成化合物ethyl-prekinamycin,随后经过羟化,环氧,环氧打开,脱去重氮基团和糖基化等生物合成步骤,生成终产物nenestatina,同时推导了稀有糖基4-o-甲基-angolosamine的合成途径。推导的合成途径如图6所示。
以下进一步提供实施实例,这些实施实例有助于理解本发明,仅用作说明而不限制本发明的应用范围。
实施例1:nenestatina生产菌m.echinosporascsio04089基因组dna的提取
将新鲜m.echinosporascsio04089的菌丝体按照5%的接种量接种于50ml的tsb培养基(配方:大豆蛋白胨5g,胰蛋白胨15g,蔗糖100g,葡萄糖2.5g,k2hpo42.5g,海盐30g,加水定容至1l,ph7.0)中,28℃~30℃,振荡培养3-4d,4000rpm离心10min收集菌丝体。菌丝体用ste溶液(75mmnacl,25mmedta,20mmtris-cl,余量为水,ph=8.0)洗涤两次,向洗涤后的菌丝体中加入30mlste溶液和终浓度3mg/ml的溶菌酶,涡旋均匀,37℃温浴3h,加入至终浓度0.1-0.2mg/ml的蛋白酶k,混匀,37℃温浴10min,加入至终浓度1%-2%的sds,混匀,放入55℃水浴约1h,期间颠倒数次。加入等体积酚-氯仿-异戊醇(v/v/v=25:24:1),混合均匀,置于冰上冷却30min。12000rpm,4℃离心10min,用剪过的大口径枪头小心吸取上清到新的离心管中,用同样的方法反复处理3次,用等体积的氯仿洗涤两次,12000rpm,4℃离心10min。用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管,加入1/10体积3mol/lnaac(ph=5.2),混匀后再加入等体积的异丙醇,混匀后冰上放置,沉淀dna。小心地用玻璃棒将dna纤维团转移至新的离心管中,用70%乙醇洗涤两次,将液体倾出,在37℃下略微烘干,加5mlte(10mmtris-hcl,1mmedta,余量为水,ph8.0)溶解,并加入3-5u的rna酶,由此得到m.echinosporascsio04089基因组dna。
实施例2:nenestatina生产菌m.echinosporascsio04089全基因组文库的构建
首先通过一系列的稀释实验确定限制性核酸内切酶sau3ai的用量,在20μl体系中,含有17μl的基因组dna,2μl的10×反应缓冲液和1μl不同稀释度的sau3ai,其终止反应为4μl0.5mol/ledta和合适的上样缓冲液。通过摸索确定了0.025-0.05u的酶活单位比较合适。在此基础上通过大量部分酶切得到略大于40kb的基因组dna片段,用去磷酸化酶进行去磷酸化处理。
用于构建文库的载体supercosi质粒先用限制性核酸内切酶xbai从两个cos序列中间切开,然后进行去磷酸化处理,再从多克隆位点处用限制性核酸内切酶bamhi切开,获得两个臂。处理后的载体与之前制备的部分酶切的约40kb的基因组dna片段连接过夜,连接体系为10μl,含有1.25μg制备的基因组dna和0.5μg处理后的supercosi质粒,1μl的10×buffer,0.3u的连接酶。连接产物在65℃处理15min,使其失活。从-80℃冰箱中取出一管包装混合物(50μl)置于冰上,将包装混合物在指间迅速融化,小心吸取一半包装混合物(25μl)至一个新的离心管中,加入10μl热处理后的连接产物,其余包装混合物于-80℃保存。小心混匀,30℃温浴90min,加入另外一半包装混合物(25μl),30℃温浴90min。加入500μl噬菌体稀释缓冲液(100mmol/lnacl,10mmol/lmgcl2,10mmol/ltris-hcl,余量为水,ph=8.3),再加入25μl氯仿,轻轻混匀,于4℃保存。
将冻存于-80℃的菌株e.colile392mp(stratagene)涂布在lb培养基上复苏。包装反应前一天,挑取单克隆接种于lb培养基中(添加0.2%麦芽糖和10mmmgso4)37℃振荡培养过夜,包装反应当天,取5ml过夜培养的菌液加入到50ml新鲜的lb培养基中(添加0.2%麦芽糖和10mmmgso4),37℃,200rpm振荡至培养物od600达到0.8-1时,4℃保存备用。取100μl如上处理的宿主菌液和100μl适度稀释的包装液轻轻混匀,于37℃温浴15min,涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的lb平板上,37℃培养过夜。将长出来的单个克隆子,用无菌牙签点种于含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的lb的96孔板上,37℃培养过夜,加入终浓度为20%的甘油,混合均匀,置于-80℃保存,由此得到micromonosporaechinosporascsio04089全基因组文库。
实施例3:从菌株m.echinosporascsio04089基因组文库中筛选覆盖nenestatina生物合成基因簇的阳性克隆子
将菌株m.echinosporascsio04089基因组dna送中国科学院北京基因组研究所进行全基因组扫描和注释,根据扫描和注释的结果,通过生物信息学分析,初步确定nenestatina生物合成基因簇位于contig15和contig61上,contigs之间的缺口通过pcr填充连接。设计特异性引物4089s1-f/r,4089s3-f/r,4089s5-f/r(表2)筛选m.echinosporascsio04089全基因组文库,获得的阳性克隆子通过限制性核酸内切酶酶切及末端测序确定3个克隆子pcsg4102,pcsg4103和pcsg4104可重叠覆盖nenestatina生物合成基因簇,并经测序,其核苷酸序列如seqidno.1的第3153-68576位的碱基序列所示。(图3)。
实施例4:nenestatina生产菌m.echinosporascsio04089遗传操作系统的建立,以敲除蒽酮氧化酶基因nes27为例:
利用pcr-targeting的方法获得体外敲除突变株,根据获得的nenestatina生物合成基因簇序列,设计nes27基因的敲除引物nes27-tarf/r(表2),随后将构建好的敲除质粒转入接合转移的供体菌中,筛选阳性突变株。具体步骤如下:(1)将cosmid质粒pcsg4103(其核苷酸序列如seqidno.1第25405-59361位碱基所示)转入大肠杆菌e.colibw25113/pij790中获得e.colibw25113/pij790/pcsg4103重组菌株,用10mmol/l的l-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达,并将其制备为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶ecori和hindiii酶切质粒pij773,回收约1.4kb含有接合转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的dna片段,以此作为pcr模板,用引物nes27-tarf/r(表2)通过pcr扩增出1.4kb的pcr产物;50μl的pcr反应体系:高保真dna聚合酶3u,10×buffer5μl,dntps0.5mmol/l,dmso2.5μl,引物各0.5μmol/l,dna模板约1ng,加水补至50μl。pcr反应条件为:预变性95℃,5min;扩增循环为94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸90s,32个循环;最后72℃延伸10min。将1.4kb的pcr产物回收纯化待用。(3)将回收后的1.4kbpcr产物电转入步骤(1)中制备的感受态细胞使其发生重组,涂布于lb筛选平板(含100μg/ml氨苄青霉素,50μg/ml卡那霉素,50μg/ml阿泊拉霉素)上,37℃过夜培养。从平板上挑出阳性单克隆,使用验证引物nes27-testf/r(表2)验证,抽提经pcr验证的质粒,命名为pcsg4117,该质粒中的nes27基因的部分片段被接合转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质粒pcsg4117转化到e.coliet12567/puz8002中,构建成e.coliet12567/puz8002/pcsg4117重组菌株,作为接合转移的供体菌。
菌株m.echinosporascsio04089在atcc172培养基(酵母粉4g,葡萄糖4g,麦芽提取粉5g,feso4·7h2o1mg,mncl21mg,znso4·7h2o1mg,海盐30g,加水定容至1l,ph7.0)平板中划线培养7天,长出的孢子用无菌棉签收集于含3%海盐的tsb培养基中(大豆蛋白胨5g,胰蛋白胨15g,蔗糖100g,葡萄糖2.5g,k2hpo42.5g,海盐30g,加水定容至1l,ph7.0),涡旋振荡,分散孢子。过滤分离菌丝体和孢子,孢子悬浮于5ml含3%海盐的tsb培养基中,50℃热激10min,然后于28℃萌发4h,作为接合转移的受体菌。供体菌e.coliet12567/puz8002/pcsg4117在50ml含50μg/ml卡那霉素,25μg/ml氯霉素和50μg/ml阿泊拉霉素的lb液体培养基中于37℃振荡培养4h至od600值约为0.6时,4000rpm离心10min收集菌体,用lb清洗菌体3遍,悬浮于300μllb培养基中,作为接合转移的供体菌。取上述受体菌400μl和供体菌100μl混合均匀,涂布于含有90mmmgso4不含任何抗生素的isp4固体培养基上,吹干后,于28℃培养18h,然后将平板取出,用含有抗生素的水覆盖平板,其终浓度为15μg/ml阿泊拉霉素和20μg/ml甲氧苄氨嘧啶,吹干后,置于28℃培养箱中,培养5d后观察。
当接合转移平板上长出菌落后,用无菌牙签将其转接到含有35μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml甲氧苄氨嘧啶的atcc172号培养基(淀粉20g,葡萄糖10g,酵母提取物5g,aobox酪蛋白5g,caco319g,海盐10g,加水定容至1l,ph7.0),28℃培养3d后,抽取各个突变株的基因组dna,利用检测引物nes27-testf/r通过pcr检测克隆,如图5(b)所示,阳性结果表示获得nes27敲除双交换突变菌株δnes27,突变株命名为nes002。
实施例5:nenestatina及其中间体的生物发酵与检测
将菌株m.echinosporascsio04089或突变株nes002在atcc172培养基平板上(淀粉20g,葡萄糖10g,酵母提取物5g,aobox酪蛋白5g,caco319g,海盐10g,加水定容至1l,ph7.0)活化后,刮取适量孢子接种到含50mln4培养基(淀粉15g,鱼蛋白胨8g,细菌学蛋白胨5g,甘油6ml,caco32g,kbr0.2g,海盐10g,加水定容至1l,ph7.0)的250ml三角烧瓶中,于28℃,200rpm,培养5d后,加入等体积丁酮,超声破碎细胞10min,静置分层,吸取上层丁酮萃取液,旋转蒸发仪蒸干。粗提物使用二甲基亚砜溶解,进行hplc检测,分析条件为:菲罗门lunac18(5μm,150×4.6mm)反相柱,流动相a相为10%乙腈水溶液(含0.1%甲酸),流动相b相为90%乙腈水溶液;流速为1ml/min。检测波长为265nm和480nm。hplc程序:0-18min,5%bto70%b(线性梯度),19-25min100%b,27-30min100%bto5%b,32min5%b。
从图5可以看出,δnes27突变株nes002丧失了产生nenestatina的能力(图5(c),(i)和(ii)),而累积一个新的代谢中间产物,经发酵分离纯化,质谱、nmr解析确定了单体化合物的结构式(图1),该化合物命名为ethyl-dehydrorabelomycin。
实施例6:nenestatina及其中间体的分离鉴定
从atcc172号培养基(淀粉20g,葡萄糖10g,酵母提取物5g,aobox酪蛋白5g,caco319g,海盐10g,加水定容至1l,ph7.0)平板上刮取适量m.echinosporascsio04089的孢子于a1液体培养基中(淀粉10g,酵母提取物4g,细菌学蛋白胨2g,海盐10g,加水定容至1l,ph7.0),于28℃,200rpm摇床中培养3-4天,待其菌体生长良好作为种子;以10%(v/v)的接种量将种子接入n4培养基中(淀粉15g,鱼蛋白胨8g,细菌学蛋白胨5g,甘油6ml,caco32g,kbr0.2g,海盐10g,加水定容至1l,ph7.0),添加5%(m/v)的大孔树脂于28℃,200rpm摇床中培养4天左右,取样检测。
将发酵液用筛子过滤分离大孔树脂和菌液,树脂用丙酮洗脱,并用旋转蒸发仪浓缩,获得含水浓缩物,再将菌液以4000rpm离心10min,分离发酵液上清与菌体沉淀,菌液上清取样hplc检测后没有目标产物,舍弃上清。菌体用丙酮浸泡,超声处理后离心,取液体用旋转蒸发仪浓缩,处理三次后将所得水相并入含水浓缩物。将含水浓缩物用丁酮萃取三次,旋转蒸发丁酮萃取液得到粗浸膏(6g)。粗浸膏首先使用正向硅胶(100-200目,100g)梯度洗脱(chcl3/meoh/h2o,95/5/0.5,90/10/1,v/v,每次600ml)得到2个组分(fr.1-fr.2),其中组分fr.2经过odscolumn(50μm,ymc*gelods-a-hg,30g)在agelacheetahtmmp200mplc工作站上进行洗脱(ch3oh/h2o,体积分数为10%-100%)进行1.5小时的梯度洗脱,获得5个亚馏分(fr.2.1tofr.2.5),其中组分fr2.2经过反向高压制备得到nenestatina[制备条件:phenomenexodscolumn(250mm×10.0mmi.d.,5μm;phenomenexphenomenexodscolumn(250mm×10.0mmi.d.,5μm;phenomenex,流动相a,0.1%formicacidinwater;流动相b,90%ch3cninwater;在流动相b为55%的条件下等度洗脱;流速为2.5ml/min,保留时间为13min时得到nenestatina),质谱(图7)及nmr(图8和图9)确定其结构(图1)。
将突变株nes002接种至atcc172固体培养基(淀粉20g,葡萄糖10g,酵母提取物5g,aobox酪蛋白5g,caco319g,海盐10g,加水定容至1l,ph7.0)上,28℃培养7d,接种于a1种子培养基(淀粉10g,酵母提取物4g,细菌学蛋白胨2g,海盐10g,加水定容至1l,ph7.0)中(50ml培养基/250ml三角瓶),28℃,200r/min振荡培养3d作为发酵培养的种子,将生长良好的种子以10%(v/v)的接种量接入10l添加5%(m/v)大孔树脂的n4培养基(淀粉15g,鱼蛋白胨8g,细菌学蛋白胨5g,甘油6ml,caco32g,kbr0.2g,海盐10g,加水定容至1l,ph7.0;)中(200ml培养基/1000ml三角瓶),28℃,200r/min培养7d后。离心收集大孔树脂后,用丙酮洗脱,旋转蒸发回收丙酮,水相用丁酮萃取,旋转蒸发丁酮萃取液得到6g粗浸膏。粗浸膏用氯仿溶解拌样上硅胶柱(100-200目),石油醚︰氯仿梯度洗脱(95/5,90/10,v/v,每个比例600ml),每200ml洗脱收集作为一个馏分,顺序收集了六个馏分,顺序命名为fr.1-fr.6,结合hplc分析,fr.4上sephadexlh20柱,收集馏分,结合hplc分析,合并馏分为l1、l2、l3、l4。l3用hplc制备50%的ch3cn︰h2o(ch3cn︰h2o为50︰50)作为流动相等度洗脱(柱子:phenomenexodscolumn(250mm×10.0mmi.d.,5μm;phenomenex),流速为2.5ml/min),制备得到化合物ethyl-dehydrorabelomycin(42mg)(保留时间为23.6min)。质谱(图10)及nmr(图11)确定其结构。
序列表
<110>中国科学院南海海洋研究所
<120>一种非典型角环素类化合物nenestatina的生物合成基因簇及其应用
<160>1
<210>1
<211>700000
<212>dna
<213>小单孢菌(micromonosporaechinospora)scsio04089
<400>1
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