专利名称：疱疹病毒骨架用于病毒疫苗和以其为基础的疫苗的制作方法
疱疹病毒骨架用于病毒疫苗和以其为基础的疫苗本申请主张2009年7月观日提交的美国临时申请号61/271，938的优先权，其全部内容被并入本文以作参考。本申请全文引用了某些出版物。在权利要求书之前可以发现这些出版物的完整出处。这些出版物全部内容以引用方式被并入，以便更全面的说明与本发明相关的现有技术水平。在此揭露的本工作是在美国国家卫生研究院(the National Institutes of Health)的发出的支助号AI-024021的支助下完成，美国政府享有本发明的一些权利。
背景技术：
从历史上来看，病毒疫苗要么是灭活的病毒或者活减毒活病毒，但是这些类型的疫苗对追踪某些病毒例如疱疹病毒或HIV不可行。当前对包括病毒载体如单纯性疱疹病毒-I (Herpes Simplex Virus-I, HSV-I)的新型病毒疫苗研究正在进行中。单纯性疱疹病毒需要HSV-I蛋白ICPO的表达，以允许来自病毒基因组的基因的有效表达，更重要的是提高病毒滴度(titer)，从而提高疫苗的产量。然而，ICPO的表达也干扰先天免疫(innate immunity)，一种与理想疫苗载体不兼容的性质。ICPO的一个功能是游离细胞的细胞核结构域10 (nuclear domain 10,ND10)复合物，以及泛素化早幼粒细胞(promyelocytic，PML)蛋白导致其降解。PML是细胞的守护者 (gatekeeper)之一，其对干扰素诱导负责。在此揭露了一种采用单纯性疱疹病毒基因组作为骨架，但是用ICPO被替代的重组病毒。该重组病毒复制达到相对高的滴度，并对于干扰素敏感。因此，该载体仅仅保留了 ICPO的在疫苗发展期所需的性质。发明概述一种重组脱氧核糖核酸，该重组脱氧核糖核酸包含一段(种)整合的异源 (heterologous)DNA^rt的入Jpi屯个生;)(human herpes simplex virus, HSV)月兑fi 核糖核酸(DNA)，其中该异源DNA编码一种包含环-指(RING-finger)域的多肽。一种包含编码一种带有环-指结构域的多肽的异源DNA的重组人单纯性疱疹病毒 (HSV)，该异源DNA (a)被插入进该HSV基因组的一个非必要区域(non-essential region) 中，以及(b)在引入该重组HSV的宿主细胞中被表达。一种疫苗其包含(1) 一种药学可接受载体和( 一种包含人单纯性疱疹病毒 (HSV)基因组的重组脱氧核糖核酸的重组病毒，，该人单纯性疱疹病毒(HSV)基因组(a)具有一段编码包含一种环-指结构域多肽的整合的异源DNA以及(b)具有一段或多段整合的异源DNA，其中每段DNA编码一种糖蛋白。一种使受试者抗水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus, VZV)感染的免疫方法，该方法包含给予受试者一定量即时(instant)疫苗，以有效引起受试者对该水痘带状疱疹病毒的免疫应答，从而使受试者免疫。一种制备用于预防一种病毒感染的组合物的方法，该方法包括将即时重组病毒与一种活疫苗稳定剂结合，从而制备该组合物。附图简要说明图 1 JCPO 和 0RF61p 的氨基酸序列比对(Alignment) (SEQ ID NOs :1 (ICPO) 和2 (0RF61))。ICPO和0RF61p的氨基酸序列(NCBI蛋白质数据库中的编号分别为 NP_044601. 1 和 NP_040183. 1)是采用 Gonnet 矩阵(Gonnet Matrix)来排列的，其空位开放罚分(Open Gap Penalty)为10.0以及其空位延展罚分(Extend Gap Penalty)为0· 1。 C3HC4环指(RING finger)共同序列的半胱氨酸(Cys)和组氨酸(His)基团用d来标记。在 ICPO 的 C-末端的 NDlO 的靶域(NDlOtargeting domain) (18)也被标记了。ICPO 和 0RF61p 的NLS区域用下划线标注(52,63). USP7的相互作用位点(interaction site)用黑色框标记，相互作用所必需的氨基酸用箭头来示出(19)。用于编码E3泛素连接酶(ubiquitin ligase)活性(30)的两个区域也被标注了。图2 :PML和SplOO在ICPO和0RF61p表达细胞中的重新分布。生长在玻璃盖玻片 (coverslips)上的MeWo细胞被模拟处理(A和D)或者用表达ICPO (B和E)或0RF61p (C和 F)的质粒构建物转化。转化后48小时，细胞被固化，病毒蛋白和PML(A-C)或SplOO(D-F) 的定位通过间接免疫荧光显微镜法来监测。采用赫斯特染剂赫斯特染剂(赫斯特染剂)对细胞核进行着色。图像用IOOx物镜捕获，并通过体积去褶积法(volume deconvolution) 分析。图 3 =PML 和 SplOO 在 ICPO 或 0RF61p 表达细胞中的丰度(Abundance)。MeWo 细胞被模拟处理或用Adempty、AdICPO或Ad0RF61在感染复数(MOI) 5处感染。感染后48小时(Forty-eight hpi)，总细胞溶菌液(Iysates)采用 SDS-PAGE 分析。PML、SplOO, ICP0, 0RF61p和微管蛋白的水平通过western蛋白印迹法(western blotting)分析。PML和 SplOO的不同种类用星号来表示出。图 4 :0RF61p 靶向 NDlOs 并不导致 PML 的降解。(A) ICP0、0RF61p 和 0RF61p 翻译融合到ICPO的C-末端的示意图。B)MeWo细胞被模拟处理或用表达ICP0、0RF61p或0RF61p 融合蛋白的构建物转化。感染后48小时，总细胞溶菌液采用SDS-PAGE分析。ICP0、0RF61p 和微管蛋白的水平通过western蛋白印迹法分析。(C-E)生长在玻璃盖玻片上的MeWo细胞被模拟处理(C)或者用表达0RF61p融合蛋白(D和E)的质粒构建物转化。48小时后，细胞被固化，0RF61p和PML的定位通过间接免疫荧光显微镜法来监测。采用赫斯特染剂赫斯特染剂对细胞核进行着色。图像用IOOx物镜捕获，并通过体积去褶积法分析。图5 在单纯性疱疹病毒(HSV)和水痘带状疱疹病毒(VZV)感染期间PML的定位。生长在玻璃盖玻片上的MeWo细胞用HSV在感染复数MOI为1处(A)或用无细胞 (cell-free) VZV在MOI大约0.01处进行感染(B-D)。HSV感染的细胞在感染后6小时被固化，VZV感染的细胞在感染后24小时被固化；ICPO (A)、0RF61p(B)、0RF62p (C)、gE (D)和 PML(A-D)的存在通过间接免疫荧光显微镜法来监测。采用赫斯特染剂对细胞核进行着色。 图像用IOOx的物镜捕获，并通过体积去褶积法分析。图6 在HSV和VZV感染期间SplOO的定位。生长在玻璃盖玻片上的MeWo细胞用 HSV在MOI为1处(A)或用无细胞VZV在MOI大约0. 01处进行感染(B和C)。HSV感染的细胞在感染后6小时被固化，VZV感染的细胞在感染后M小时被固化；ICPO (A)、0RF62p⑶、 gE(C)和SplOO (A-C)的存在通过间接免疫荧光显微镜法来监测。采用赫斯特染剂赫斯特染剂对细胞核进行着色。图像用IOOx物镜捕获，并通过体积去褶积法分析。图7 :PML, SplOO和Daxx在HSV和VZV感染期间的丰度。(A)MeWo细胞用HSV在 MOI为5处或用无细胞VZV在MOI大约0. 01处进行感染。在感染后的指定时间，PML、Sp 100、 Daxx、ICP0、0RF61p和微管蛋白的水平通过western蛋白印迹法分析。(B)MeWo细胞被模拟处理或用包含1000或2000U/ml的干扰素α的媒介培养。处理后48小时，总细胞溶菌液用于监测 PML、SplOO, Daxx, STAT1、磷酸化 STATU STAT2 和磷酸化 STAT2。图 8 :PML、SplOO 和 Daxx 对于 VZV 复制的影响.(A)来自 sicontrol，siPML, siSplOO和siDaxx细胞的总细胞溶菌液通过western蛋白印迹法分析其PML、SplOO, Daxx 和微管蛋白水平。(B)sicontrol、siPML、siSplOO和siDaxx细胞用VZV的系列稀释物感染。 感染后5天，单层(monolayers)被固化，着色，菌斑被计数，并对照在sicontrol细胞中形成的数目。误差线(error bars)表明五个独立实验的标准偏差，每个实验都操作两遍。(C) sicontrol、siPML、siSpl00和siDaxx细胞用无细胞VZV在MOI大约0. 01处进行感染。在感染后的指定时间，细胞溶菌液通过western蛋白印迹法分析其中的0RM9p、0RF63p和微管蛋白。用ImageJ来量化带强度(Band intensities)并以微管蛋白归一化。(D) sicontrol、 siPML、siSpl00和siDaxx细胞用无细胞VZV在MOI大约0. 01处进行感染。在感染后的指定时间，细胞被收集并通过滴定来测定在新鲜的MeWo单层的感染中心的数目。感染后4天， 单层被固化，着色，菌斑被计数以计算感染中心的滴度。D图是一个代表实验，其显示每个细胞系的生长曲线。每个数据点代表两个样品的平均值。E图显示这四个独立实验的时间点的平均值，以及误差线代表标准偏差。图 9 在 sicontrol、siPML、siSplOO 和 siDaxx 细胞上的感染病灶(infected foci)的形态学。Sicontrol、siPML、siSplOO和siDaxx细胞用无细胞VZV在MOI的大约 0. 01处进行感染。在感染后2和3小时，细胞被固化，0RF63P和gE的定位通过免疫荧光显微镜法进行。采用赫斯特染剂赫斯特染剂对细胞核进行着色。图像用IOx物镜捕获。
图10 表达水痘带状疱疹病毒0RF61p的单纯性疱疹病毒的结构。㈧ICPO位点 (locus)的示意图。(B)由dll403或HSV-0RF61感染细胞制备的pCPC-061和Hirt DNA被扩增，使用本文后述结果II的原料和方法(Materials and Methods of results II)中具体说明的引物集合(primer sets)。(C)MeWo细胞被模拟处理或者是用野生型的HSV-I、 dll403或HSV-0RF61在MOI为5处进行感染。在感染后8小时，细胞被收集，并采用在原料和方法中描述的抗体进行western蛋白印迹法分析以监测ICP0、ICP4、0RF61p和微管蛋白的丰度。图11 表达水痘带状疱疹病毒0RF61p的单纯性疱疹病毒的生长分析。(A)用野生型的HSV-I、dll403或HSV-0RF61的系列稀释物来感染Vero或L7细胞。感染后3天，单层被固化，着色，菌斑被计数。相对菌斑形成效率(Relative plaquing efficiency)为X 100。误差线表明来自四个独立实验的标准偏差，其中每个实验操作两遍。(B)MeWo细胞用野生型的HSV-I、dll403或HSV-0RF61在MOI为0. 1处进行感染。感染后2小时、12小时、 24小时和48小时，收集感染细胞，将其进行3轮的融化(freeze-thaw)；在L7细胞上滴定后计算收率。图12 病毒特有蛋白(virus-specified proteins)表达的时间进程。MeWo细胞在MOI为0. 2处用野生型的(HSV-I)、ICPO-(dl 1403)和HSV-0RF61来进行感染。在指定的时间收集感染细胞，并western蛋白印迹法检测ICP4、ICP27、ICPO和0RF61p的合成和丰度。所有泳道(lanes)都被用抗-微管蛋白抗体进行着色以证明每一泳道承载了等量的细胞蛋白。图13 在用一种表达水痘带状疱疹病毒0RF61p的单纯性疱疹病毒感染期间的 PML和SplOO的命运(fate)和条件。(A)MeWo细胞或者用模拟处理，或者用野生型HSV-I、 dll403或HSV-0RF61在MOI为10处进行感染。感染后2小时和4小时，细胞被收集，并用 western蛋白印迹法监测PML、Spl00、ICP0、0RF61p和微管蛋白的丰度。(B)空白(Empty)、 siPML和SiSplOO细胞用野生型的HSV-I、dl 1403或HSV-0RF61的系列稀释物进行感染。感染后3天，单层被固化和着色，菌斑被计数并对照在空白细胞中形成的数目。误差线表明来自3个独立实验的标准偏差，每个独立实验被进行两遍。图14 一种表达水痘带状疱疹病毒0RF61p的单纯性疱疹病毒对于干扰素α的敏感性。经过模拟处理或用干扰素α处理过夜的MeW0，Ver0或U20S细胞用野生型的HSV-I、 dll403或HSV-0RF61的系列稀释物感染。感染后3天，单层被固化，着色，菌斑被计数。每种病毒在每个细胞系上的相对菌斑形成效率被计算为模拟处理的细胞中的滴度/在干扰素α处理的细胞中的滴度Χ100。图15 =VZV基因组的代表性示意图，标明编码糖蛋白的开放阅读框(ORFs)。发明的详细描述HSV的非限制性例子包括Glasgow病毒菌株7 (Glasgow strain 7)；人疱疹病毒 1 (Human herpesvirus 1，HSV_1)HF VR-260 ；人疱疹病毒 1 (Human herpesvirus 1，HSV_1) MaclntyreVR-539 ；人疱疹病毒 1 (Human herpesvirus 1, HSV-I) KOS VR-1493 ；人疱疹 ^ 2 (Human herpesvirus 2, HSV-2)G VR-734 -,X'M^M^ 2 (Human herpesvirus 2, HSV-2)MS VR-MO ;如存放在马纳萨斯的美国模式培养物集存库(theATCC at Manassas, VA 20108, USA.)的人疱疹病重组毒GHSV-UL46 VR-1544 VZV的非限制性例子包括Jones 菌株(Jones strain) ；Oka VZV病毒(Oka strain of VZV)，如存放在马纳萨斯的美国模式培养物集存库(the ATCC at Manassas, VA 20108, USA.)的 VR-795。在此所述的有关核酸或病毒的“重组”是指一个分子或病毒个体，其具有两个独立的原始来源并组合在一起成为单个形式的核酸或病毒。例如，重组脱氧核糖核酸可以是由一个单纯性疱疹病毒基因组和一个来自水痘带状疱疹病毒的基因组合得到一个单一的DNA 分子。例如，重组病毒是一种病毒，其具有一种包含了一个外来的或异源的编码序列/基因的核酸。在一个实施例中，这两种不同的过程是不同的物种。在此所述的关于例如异源脱氧核糖核酸中的“异源(Heterologous)”是指其DNA 衍生自一个不同的生物体(或者具有一个相同的序列)，而非源自被相对地描述为异源的生物本体DNA。在一个非限制性例子中，一个衍生自水痘带状疱疹病毒的DNA，其插入进一个来自单纯性疱疹病毒的DNA，该新DNA就是异源的DNA，相对于来自该单纯性疱疹病毒的 DNA。“环-指结构域(RING finger domain) ” 是一个锌-指多肽(zinc finger polyp印tide)，其包含了一个连接了两个锌阳离子的Cys3HiSCyS4的氨基酸模体。字首“环 (RING) ”代表了实质上很有趣的新型基因(Really Interesting New Gene)。在此所述的有关一个异源基因或编码序列被整合入一个病毒DNA中的“整合”是指该异源基因或编码序列被功能性包含入该DNA中，从而当该病毒DNA被此病毒感染的宿主细胞表达时，该异源基因或编码序列也被表达。为本领域常规技术人员所知，一个病毒DNA的“非必要(non-essential)”基因或区域是指DNA的一个区域，当一个DNA序列插入该区域时，并不阻止该病毒感染宿主细胞的能力和在其中复制的能力。水痘带状疱疹病毒糖蛋白和编码其的核酸序列是本领域所熟知的，例如糖蛋白 H、B和E(分别为gH、gB和gE)，例如参考Maresova等人出版的2005，J.Virol. 79(2) 997-1007，其全文被并入以作参考。水痘带状疱疹病毒的中和表位是本领域所熟知的，例如参考Akahori等人出版的病毒学杂志(Journal of Virology), February 2009，p. 2020-2024, Vol. 83, No. 4 ；禾口 Forghani 等人出版的临床微生物学杂志(J Clin Microbiol). 1990 November ；28 (11) 2500-2506，每个出版物全文被并入以作参考。感染细胞多肽O(ICPO) [Infected Cell Polypeptide 0 (ICPO)]是一种蛋白质， 由疱疹病毒DNA[参见美国国家生物技术信息中心的蛋白质数据库编号NP_0446011(NCBI protein database accession numberNP_044601. 1)，在此全部并入以作参考]编码。0RF61 是开放阅读框61蛋白(水痘带状疱疹病毒，varicella zoster virus)[参见美国国家生物技术信息中心的蛋白质数据库编号NP_040183. 1(NCBI protein database accession number NP_040183. 1)，在此全部并入以作参考]。在此所述的免疫是提供病毒抗原(例如在一种疫苗中)到受试者，例如人的免疫系统中，此举激发了免疫应答并在与该病毒抗原后续接触时，引发防御性的体液和/或细胞免疫。用于病毒疫苗的组合物是本领域所知的，并被记载在Burke等人的2003年9月9 日的美国专利U. S. 6，616，931，Loudon等人的2001年7月10日的美国专利U. S. 6，258，362， Chen等人的2004年9月7日的美国专利U. S. 6，787，351中，这些出版物被全文并入以作参考。在此公开的病毒载体疫苗能以一种药学上可接受的溶剂来施用，例如但不限于无菌盐水或无菌缓冲盐水，用或者不用本领域所知的疫苗佐剂一起来施用。“施用 (Administering)，，一种疫苗可采用本领域常规技术人员所知的各种方法和递送系统中的任意一种来实现或操作。该病毒疫苗可以采用本领域所知的方法施用，包括但不限于注射、 局部黏膜/鼻黏膜给药。在此所述的一种“药用载体”是一种药学上可接受溶剂、悬浮剂或媒介，用于递送即时病毒载体到动物或人。该载体可以是液体、气溶胶、凝胶或固体；可以由考虑的施用计划方式来选择。在一个实施例中，该药用载体是一种无菌的药学可接受溶剂。疫苗生产和储存方法为本领域所知，并被描述在W0/2006/012092中，其全文被并于此以作参考。正如其所描述的，用于例如麻疹(measles)、风疹(rubella)和流行性腮腺炎(mumps)病毒的活疫苗的常用稳定剂通常包括一种或多种糖类、氨基酸、糖醇、明胶和明胶衍生物，以稳定病毒，并在很多情况下保持病毒在浓缩步骤中免于变性。在此描述的重组病毒可以被配制成一种疫苗，通过使用一种稳定剂或其它包含天然或重组血清蛋白添加剂来达成目的)。美国专禾Ij U. S. Nos. 6，210，683 ；5，728，386，6，051，238，6，039，958 和 6，258，362也包含了稳定剂的详细说明和更加温和地处理活病毒疫苗的方法。这些公开内容，尤其是描绘稳定剂组合物和稳定方法的这些部分特地被完整并入本文。在与稳定剂一起制备后，该疫苗可以被储存为一种例如冻干疫苗、冻干混合疫苗、液体疫苗或液体混合疫苗。制备这些疫苗的方法是已知的。典型地，冻干疫苗可通过冻干在小瓶或安剖瓶中的具有3_30ml体积的疫苗制备，其被紧紧地密封和储存在5摄氏度或更低温度下。储存的疫苗制品通常按照说明书使用，其作为产品内附物或是贴在小瓶或其它容器上的标签。在多数情况下，冻干疫苗在使用前通过加入无菌蒸馏水重构，得到的溶液通过皮下注射按照一定量接种，例如每剂0. 5ml。这种疫苗也可以通过口服或鼻腔施用。一种重组脱氧核糖核酸，其包含一种具有整合的异源DNA的人单纯性疱疹病毒 (HSV)的脱氧核糖核酸DNA，其中该异源DNA编码包含一种环_指结构域的多肽。在一个实施例中，该HSV DNA是基因组DNA并且该异源DNA被整合入该HSV DNA 以替代编码一种HSV感染的细胞多肽0 (HSV Infected Cell Polypeptide 0，ICP0)的基因组HSV DNA的一部分。在一个实施例中，该异源DNA被插入进该基因组HSV DNA的一个HSV ICPO 5'的非翻译域(UTR)和一个HSV ICPO 3'的非翻译域(UTR)之间。在一个实施例中，该插入的异源DNA是在该ICPO启动子和3' UTR控制下。在一个实施例中，包含了该环-指结构域的该多肽具有水痘带状疱疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。在一个实施例中， 包含该环-指结构域的该异源多肽具有一种马疱疹病毒、牛疱疹病毒或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。在一个实施例中，该HSV DNA是一个HSV基因组。在一个实施例中，该重组脱氧核糖核酸还包含一种编码一种糖蛋白的异源DNA。在一个实施例中，该重组脱氧核糖核酸还包含多达8个异源DNA，且每个DNA编码一个不同的糖蛋白。在一个实施例中，该糖蛋白具有一种水痘带状疱疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。在一个实施例中，该糖蛋白包含一个水痘带状疱疹病毒的中和表位。在一个实施例中，由该重组脱氧核糖核酸编码的多肽未降解哺乳动物类的前骨髓细胞癌(mammalian promyelocytic leukemia，PML)蛋白。在一个实施例中，编码该多肽的该异源DNA被整合，从而当该重组脱氧核糖核酸被整合入一种合适的宿主细胞的基因组时，该多肽被表达。在一个实施例中，编码该糖蛋白的该异源DNA被插入进该HSV DNA的一个非必要基因或区域中。一种包含编码一种带有环-指结构域的多肽的异源DNA的重组人单纯性疱疹病毒 (HSV)，该异源DNA (a)被插入进该HSV基因组的一个非必要区域中，以及(b)在引入该重组 HSV的宿主细胞中被表达。在一个实施例中，该异源DNA被插入进该HSV基因组以替代编码一种HSV感染的细胞多肽O(ICPO)的HSV基因组的一部分。在一个实施例中，该异源DNA被插入进该HSV 基因组的一个HSV ICPO 5'的非翻译域(UTR)和一个HSV ICPO 3'的非翻译域(UTR)之间。在一个实施例中，包含了该环-指结构域的该多肽具有水痘带状疱疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。在一个实施例中，包含该环-指结构域的该多肽具有一种马疱疹病毒、牛疱疹病毒或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。在一个实施例中，该重组HSV还包含一种编码一种糖蛋白的异源DNA，被插入进该HSV基因组的一个非必要域。在一个实施例中，一种水痘带状疱疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。在一个实施例中，该糖蛋白包含一个水痘带状疱疹病毒的中和表位。在一个实施例中，编码该糖蛋白的该异源DNA被插入进该HSV基因组的一个非必要基因或域中。在一个实施例中，没有由该重组HSV基因组编码的多肽降解PML。在一个实施例中，该重组HSV包含多达8个不同的异源DNA，且每个DNA编码一个不同的水痘带状疱疹病毒糖蛋白。在一个实施例中，该重组病毒是通过本领域已知的方法减毒的。一种疫苗，该疫苗包含⑴一种药学可接受载体和⑵一种重组病毒，该重组病毒包含一种包含人单纯性疱疹病毒(HSV)基因组的重组脱氧核糖核酸，该人单纯性疱疹病毒 (HSV)基因组(a)具有一段编码包含一个环-指结构域多肽的整合的异源DNA以及(b)具有一段或多段整合的异源DNA，其中每段DNA编码一种糖蛋白。在一个实施例中，该异源DNA被整合入该HSV基因组以替代编码一种HSV感染的细胞多肽O (ICPO)的HSV DNA的一部分。在一个实施例中，该异源DNA被插入进该HSV基因组的一个HSV ICPO 5'的非翻译域(UTR)和一个HSV ICPO 3'的非翻译域(UTR)之间。 在一个实施例中，包含了一个环-指结构域的该异源多肽具有水痘带状疱疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。在一个实施例中，包含一个环-指结构域的该异源多肽具有一种马疱疹病毒(EHV)、牛疱疹病毒(BHV)或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。在一个实施例中，该糖蛋白具有一种水痘带状疱疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。在一个实施例中，该糖蛋白包含一个水痘带状疱疹病毒的中和表位。在一个实施例中，编码该糖蛋白的异源DNAs和编码包含该环-指结构域的多肽的该异源DNA都被插入进该HSV基因组的非必要基因或区域中。在一个实施例中，该重组病毒是通过本领域已知的方法减毒的。一种使受试者抗水痘带状疱疹病毒感染的免疫方法，该方法包含给予受试者一定量即时疫苗，以有效引起受试者对该水痘带状疱疹病毒的免疫应答，从而使受试者免疫。一种用于预防一种病毒感染的组合物的制备方法，该方法包括将即时(instant) 重组病毒与一种活疫苗稳定剂结合，从而制备该组合物。在此描述方法的一个实施例中，受试者是哺乳动物类。在一个实施例中，受试者是人类。在该方法的一个实施例中，宿主细胞是哺乳动物类的或衍生自一种哺乳动物的。在一个实施例中，宿主细胞来自人类。在此描述的各种元素的组合都涵盖在本发明的范围中。通过参考以下的实验细节，本发明可被更好地理解；但本领域的常规技术人员可以容易地了解到，具体的实验细节只是为了阐明在随后的权利要求书中更完整描述的本发明。实验细节以下公开的研究表明在水痘带状疱疹病毒中的HSV ICPO所对应的直系同源基因 (ortholog) 0RF61，不会降解PML，从而不会干扰宿主的先天免疫。在此公开了一种重组HSV 的构建，其中用于α基因ICPO的编码序列被编码0RF61p的序列替代。结果I细胞核结构域10 (Nuclear domains 10，NDlOs)，也被称为 PML 核体(nuclear bodies)和PML致癌结构域(oncogenic domains)，它形成于细胞核的染色体内部空间，是细胞蛋白的有活力的大分子包含物(dynamic macromolecular inclusionsM2，65)。取决于细胞种类和所处的细胞周期的阶段，这些实体(bodies)的尺寸和频率范围分别在0.2 到lum，每个细胞中从2到30(2，17，62)。在这些位点聚集的细胞蛋白分为两组一组为永久成分的蛋白质，例如PML(前骨髓细胞癌蛋白质promyelocytic leukemia protein)、 SplOO (IOOkDa的斑点蛋白)、Daxx、SUMO—I和青春综合症解旋酶(Bloom syndromehelicase)BLM;另一组为仅在特殊条件下(例如DNA修复机)或在过度表达时(例如 BRCA1)与NDlOs结合的蛋白质(70)。DNA病毒基因组在其复制周期的初始阶段与NDlO组分结合。新形成的转录和复制位点集中在那些通常处于NDlOs内部的蛋白质附近(61)。首次提出病毒复制会影响NDlOs 是由于证实了 PML着色在感染单纯性疱疹病毒HSV后即消失06)。随之，疱疹病毒、腺病毒、 猿猴病毒40 (simian virus 40，SV40)和乳头状瘤病毒的亲代基因组(parental genome) 也显示了与 NDlOs 结合性(10，14，32，33，35，47)。对HSV和NDlOs组分的拮抗(antagonistic)关系已进行了深入的研究。ICPO病毒蛋白的表达对于细胞核结构的毁损是必要和充分的(18，45，46)。ICPO是一种含有C3HC4 环指的核内磷蛋白，其具有IlOkDa的表观分子量(56)，其作为病毒和细胞基因的混杂激活剂(promiscuous activator) (12，23，59)。缺乏ICPO基因的病毒变异体具有增强的粒与蚀斑形成单位(plaque forming unit,pfu)的比例，实质上较低的收率和降低的α基因的表达水平(13，64)。ICPO也发挥Ε3泛素化连接酶的功能，以靶向用于降解蛋白酶的不断新增的的宿主蛋白，包括NDlO实体(NDlObodies)组分例如PML和SplOO的SUMO-I修饰形式 (8，15，18,26,41,53)。未能表达ICPO的HSV变异体在其能力上存在缺陷，而不能修饰或降解NDlO组分 (46)。PML和SplOO的消耗加速了病毒基因的表达，并增加了 HSVICP0缺陷病毒的蚀斑形成效率，但其对野生型病毒无作用。这些数据表明了 PML和SplOO是抗-HSV固有防御机制中的成分，该机制由ICPO的Ε3连接酶活性抵消以确保病毒的有效复制和生长(21，22)。水痘带状疱疹病毒(Varicella-Zoster Virus, VZV)是一种常见的人病原体， 其与HSV —起被分类为alpha疱疹病毒(alphaherpesviruses)。VZV编码一种ICPO的直向同源物(0RF61p) 09，57)，其类似于ICP0，转录时活化病毒启动子以及增强病毒 DNA的传染性(49，50)。重要的是，0RF61p包含了一个环指结构域，与ICPO的反式激活 (transactivation)和NDlO解离和降解活性所必要的区域同源。先前已表明由HSV的ICPO表达对于克服BAG3 ( 一种刺激病毒基因表达和蛋白积聚的宿主陪伴蛋白)的消耗是必须的(38)。尽管0RF61p被认为功能与ICPO类似09)，VZV 受BAG3消耗的影响(37)，这就暗示了 ICPO和0RF61独自地演化了以提供用于病毒复制的不同功能。该报道证明了 0RF61p和其它VZV编码的蛋白质不以与HSV感染的细胞中的ICPO 相同的方式来降解NDlO组分。还研究了在VZV感染期间，PML,Sp 100和Daxx的作用，这篇报道强调了这两种相关的alpha疱疹病毒之间存在的关键区别。材料和方法哺乳动物类细胞.人黑色素瘤(melanoma, MeWo)、siBAG3(37)、 siPML(38)和细胞按照先前所描述获取(37)。为得到表达靶向SplOO和Daxx mRNAs 的siRNAs的稳定细胞系，Meffo细胞被逆转录病毒感染，并在包含200ug/ml和随后500ug/ ml勻霉素(hygromycin)生长媒介中选取。DNA 转化。DNAs 通过 Fugene HD[Roche, Indianapolis, IN]被转化入合适的细胞系。药物处理。干扰素α 购买自 PBL Biomedical [Piscataway, NJ]公司。病毒。[i] VZV. Jones，一种野生型临床分离体，其按照Q4)描述的一样被增殖和滴定。无细胞的病毒按照(36，58)描述一样的制备.[ii]逆转录病毒.逆转录病毒通过将 细胞与前病毒载体 pCK-Super. retro, hygro (38)，pCK-siSplOO 或 pCK-siDaxx 和 pgag-polgpt(44)和 pHCMV_G(75) —起进行瞬时共转化(transient co-transformation) 构建得到。[ii]腺病毒.先前已描述过腺病毒 Adempty，AdICPO 和 Ad0RF61 (74，76)。病毒生长分析。[i]菌斑分析.用病毒存货(virus stocks)的10倍系列稀释物来感染MeWo、siPML、SiSplOO或SiDaxx细胞；感染细胞被固化，着色和计数菌斑。[ii]生长曲线.在MeWo、siPML、siSplOO或siDaxx细胞感染后，与VZV相关的细胞滴度(titer) 通过将感染的细胞与未感染的MeWo细胞混合在一起，并在固化和着色后计数得到的菌斑来测量得到。质粒构建。[i] siRNA质粒。先前描述的靶向SplOO和Daxx mRNA的siRNA寡核苷酸(22,68)被修饰用于克隆入 pCK-super. retro, hygro (38)。为产生 pCK-siSplOO 和 pCK-siDaxx，退火的寡核苷酸对(oligo pairs) siSpl00_上游的(siSpl00_upper) 5' -GA TCCCCGTGAGCCTGTGATCAATAATTCAAGAGATTATTGATCACAGGCTCACTTTTTA-3 ‘和 siSpl00_ 下游的(siSpl00_lower) 5' -AGCTTAAAAAGTGAGCCTGTGATCAATAATCTCTTGAATTATTGATCACAGGCT CACGGG 或 siDaxx_ 上游的5 ‘ -GATCCCCGGAGTTGGATCTCTCAGAATTCAAGAGATTCTGAGAGATCCAA CTCCTTTTTA-3 ‘ siDaxx_ 下游的5 ‘ -AGCTTMAAAGGAGTTGGATCTCTCAGAATCTCTTGMTTCTGAG AGATCCAACTCCGGG-3 ‘被连接入 Bglll/Hindlll 裂解的 pCK-super. retro, hygro (38)。所有引物从Operon Biotechnologies [Huntsville, AL]公司获得，以及所有载体插入物都通过DNA测序验证。抗体。描述了0RF29p 的氨基酸(amino acids,aa) 1086 到 1201 和 0RF63p 的氨基酸H65的兔多克隆抗体G3)。描述了 ICPO的多克隆抗体00)。单克隆ICPO和0RF62p抗体购自 Rumbaugh-Goodwin Wi % [Plantation, FL]。 1 * 0RF61p 136-248 M ■ @!白勺 GST-融合蛋白的多克隆抗体在兔体中培育，并采用先前描述的亲和色谱法(affinity chromatography)进行纯化(37)。PML、GAPDH和微管蛋白的单克隆抗体和Daxx的多克隆抗体从 Santa Cruz Biotechnology [Santa Cruz，CA]公司获得。PML 和 SplOO 的多克隆抗体购自Chemicon[Temecula，CA]公司。STAT1，STAT2和磷酸化STATl的抗体从 Abeam[Cambridge,MA]公司获得。磷酸化 STAT2 抗体购自 SantaCruz Biotechnology 公司。Alexa Fluor 488-耦联物(Alexa Fluor 488-conjugated)抗-鼠(anti-mouse) 禾口 Alexa Fluor 546—華禹联物抗一兔(anti-rabbit)抗体从 Molecular Probes [Carlsbad, CA]公司获得。耦联到用于免疫印迹的辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)的山羊抗-兔和抗-鼠抗体从KPL[feiitherburg，MD]公司获得。间接免疫荧光显微镜法。按照先前描述的，在玻璃盖玻片上的细胞被固化，和用抗体和赫斯特染剂着色(37)。所有样品都通过kiss Axiovert 200M倒置显微镜法 [Carl Zeiss Microimaging hc，Thornwood，NY]成像以及使用采用 Openlab 5 的软件 [Improvision, Lexington, MA] ^ Hamamatsu C4742-80-12AG ^ 5 CCD l/l [Hamamatsu Photonics, Hamamatsu-City, Japan]获取图像.采用Openlab 5对图像进行去褶积并在 Photoshop CS3[Adobe Systems, San Jose，CA]中进行装配。
SDS-PAGE和western免疫印迹。感染的和生物化学转化的细胞被用冷的磷酸缓冲液(PBS)洗涤两次，细胞溶解在1. SDS样品缓冲液中[75mM TrisHCl pH 6. 8,150mM DTT, 3% SDS,0. 15%溴酚蓝，15%甘油]并煮沸，蛋白质用SDS-PAGE进行分析(39)。在western 免疫印迹前将蛋白质转移到硝化纤维膜上。在含5%脱脂牛奶的PBST中封闭薄膜之后，固定的蛋白质与合适的抗体在含脱脂牛奶的PBST中进行反应。薄膜用PBST洗涤三次， 每次5分钟，用偶联到辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)的抗-兔和抗-鼠抗体培养；然后用PBST洗涤三次，每次5分钟，再用PBS洗涤两次。通过加入LumiGLO底物[KPL] 曝光X射线胶卷抗体被可视化。当使用STAT蛋白的抗体时，封闭和抗体培养在添加了 50mM NaF, ImM Na3VOjP 3% BSA的PBST中进行。序列比对。0RF61p(NP_040183. 1)禾Π ICPO (ΝΡ_044601. 1)的氨基酸序列采用 Gonnet矩阵，空位开放罚分10. 0和空位延展罚分0. 1与MacVector ver 10. O [MacVector Inc，Cary，NC]进行比对。ICPO和0RF6Ip之间的序列相似性。先前的报道提出alpha疱疹病毒直向同源物， ICPO和0RF61P共同享有几个生物学特征，包括它们活化基因表达和增强病毒DNA感染性的能力09，50，57)。然而，也报道了不同于ICPO，0RF61p在病毒感染期并不能替代BAG3损耗，这就揭示了这些蛋白在天然环境下并不发挥相同的功能(38)。ICPO的多功能被比对在其特殊的结构域上(16)。这就导出这样的假设，在这些蛋白质之间进行氨基酸序列比对可能提供对它们差异的理解。ICPO和0RF61p的氨基酸序列取自NCBI蛋白质数据库(编号分别为NP_044601. 1和NP_040183. 1)比对(图1).除去一些保守核苷酸序列(9)，发现它们之间的总的氨基酸保守还是较少(在氨基酸水平上10%的相似性).然而，两者在接近 N-末端处都包含了 一个 C3HC4 环指[C-X2-C-X (9-39) -C-X (1-3) -H-X (2-3) -C-X2-C-X (4-48) -C-X2-C] (3)。两种蛋白质之间一个显著差异在于在0RF61p序列中，ICPOC-末端(标记为蓝色)的缺失。重要的是，这个区域对于将ICPO靶向到NDlO体并随后降解其组分是必要的(16，18，45)。因此，进行了有关0RF61p在介导PML和SplOO降解中的能力的研究。0RF61p不能有效地降解PML和SplOO。在用编码这两种直向同源物的质粒转化的MeWo细胞中，通过免疫荧光显微镜法监测了 0RF61p和ICPO对于PML和SplOO定位的作用。在模拟处理的细胞中，都出现了 PML和SplOO的点状核体(图2A和2D) (2)。正如先前报道，ICPO的表达导致了两种细胞蛋白的消失(图2B和2E)(46)。然而，细胞表达0RF61p表现了一个不同的表型。对照模拟处理的细胞，尽管PML包含体(PML containing bodies)更分散以及更小，但该蛋白质还是被检测到，主要为点状的细胞内结构(图2C)。0RF61p在SplOO上的作用看起来更接近ICPO的作用，因为SplOO核体的着色从表达0RF61p的大多数细胞中消失了(Fig. 2F)。 为了直接分析病毒产品对PML和SplOO丰度的影响，Meffo细胞被模拟处理或用不表达疱疹病毒蛋白(Adempty)，ICPO (AdICPO)或0RF61p (Ad0RF61)的复制缺陷腺病毒感染，病毒和细胞蛋白的水平通过western免疫印迹法监测(图3)。采用感染复数(multiplicity of infection) (MOI) 5来确保每个细胞都被感染并表达感兴趣的蛋白质。在模拟感染的细胞中或用Adempty感染的细胞中，PML显示为具有不同分子量的一系列条带。这些条带代表了 PML的剪切和翻译后(post-translationally)修饰形式(54)。如先前描述，检测到Sp 100 (Sp 100A，Sp100A-SUM0和Spl00-HMG)的三种主要形式。ICPO的表达导致了多种PML 异构体的完全消失和迁移较慢品种的SplOO的优选缺失(图3) (8)。相反，0RF61p的表达对由此分析检测到的PML的丰度和种类没有影响。0RF61p —致地降低SplOO水平，尽管并不如ICPO那样有效(图幻。平行的感染细胞通过免疫荧光分析证实了所有的细胞都被感染和表达ICPO或0RF61p(数据没有给出)。在感染了 Adempty的细胞中的PML被重新组织为延伸轨迹(elongated tracks)，可能是应答腺病毒E4 0RF3的表达(6)。由AdICPO的 ICPO的表达导致缺失PML，而在Ad0RF61感染细胞中的PML着色与Adempty样品相同(数据没有给出)。这个观察结果进一步将ICPO和0RF61P区分开来。将免疫荧光数据和western免疫印迹分析结合起来，证明了尽管0RF61p改变NDlO 体的完整性和着色图案，其表达并不导致PML的消失。然而，0RF61p的表达但影响SplOO的水平。0RF6Ip靶向NDlOs并不引起PML的降解。如上述提到的，ICPO的C-末端，其对于靶向NDlOs和PML的有效降解是必要的，从0RF61p中缺失了(图1)。添加这个区域到β -半乳糖苷酶(β-galactosidase)导致其与PML的部分共定位(co-localization) (18)。为了检测0RF61p未能降低PML水平是否是因为它缺失了该区域而不能靶向NDlOs，创造了 0RF61p与ICPO的C-末端的188个氨基酸的翻译融合物(图4A)。得到的蛋白质应该包含对于PML靶向和降解(一个同源的环指和该靶向区域的C-末端)所必要的ICPO的所有区域(16)。MeWo细胞用模拟处理或者用表达ICP0、0RF61p或该融合蛋白的构建物转化。细胞溶解产物的western免疫印迹分析揭示了所有的蛋白产物在相似水平上聚集，以及ICPO 的C-末端域的添加并不改变0RF61p的稳定性(图4B)。随后监测了这些蛋白和PML的定位和丰度。如以上描述，ICPO的表达导致PML着色的消失，而0RF61p的表达导致了在其细胞内的着色图案上的微小变化(图2B和2C)。该融合蛋白具有一个不同于ICPO或0RF61p 的亚细胞(subcellular)定位模式。在大多数细胞中(大约80-90% )，该融合蛋白主要在细胞质中(图4D)。与在融合了这个域的该半乳糖苷酶中所观察到的类似(18)，细胞质中(cytoplasmic)PML包含体的一个次级种群(subpopulation)与该融合蛋白共-定位 (co-localized)。在10-20%的该核蛋白质种群中，核染色质是加边缘的(marginated)，以及该融合蛋白填充在其余的细胞核空间(图4E)。然而在这两种情况下，尽管PML分布改变了，但它还是被检测到了。因此，0RF61p未能降低PML的分子内水平是该蛋白质的内在性质，并不是因为0RF61p缺失了一个NDlO靶向区域。在VZV感染期间PML和SplOO的分布和丰度。0RF61p单独并不有效地降解PML和 SplOO (图2和3)。为了回答这个问题，即在感染期其它VZV蛋白是否影响这些蛋白的分布，Meffo细胞用HSV或无细胞的VZV进行感染，以及通过免疫荧光显微镜法监测病毒和细胞蛋白的细胞内分布。如先前报道，在感染了 HSV的细胞中，用于PML和SplOO的着色消失了(图5A和6A)。在初期分析期间，0RF61p的着色是用于病毒感染细胞的标记(marker)。 在表达0RF61p的细胞中，PML包含体在尺寸上变得更小了，以及与未感染的细胞对照时变得暗了。然而，与在感染了 HSV的细胞中不同，在VZV感染的细胞中PML还是被检测到了 (图5B)。不过，由于还没有完全理解VZV编码蛋白的表达动力学，很可能是在0RF61p在感染期导致PML的缺失后，其它蛋白表达了，0RF62p被当做用于感染细胞的另一个可选择标记。这个蛋白质最初定位在感染细胞的细胞核上；然而，它随后磷酸化了并在感染后期转位到了细胞质里(11)。因此，作为感染细胞的标记以及作为病毒复制周期阶段的指示剂，其细胞内的定位模式是有用的。在0RF62p处于细胞核内的那些细胞中，PML和SplOO 二者都显现为球形结构；这就非常类似于在非感染细胞中所观察到的(图5C和6B)。在感染后的后期时间点，感染细胞用用于糖蛋白gE着色来监测。在VZV感染后期，NDlO组分的定位与在转化的细胞中所观察到的相似(图幻。特别地，PML体仍然存在，尽管其丰度变得降低了以及其着色强度也比在未感染细胞中所观察到的更弱(图5D)。相反，没有观察到SplOO的特征点状着色(图6C)。为了进一步研究在VZV感染期的NDlO组分的去向(fate)并定量地测量其丰度， Meffo细胞用HSV或无细胞VZV感染，以及通过western免疫印迹法监测病毒和细胞蛋白的水平。如先前描述，HSV感染导致了 PML和SplOO多种异构体(multiple isoforms)的快速降解(图7A) (8)。对照HSV，VZV无细胞滴度低且病毒复制动力学是非常慢的。因此，为了分析病毒感染对这些蛋白质的影响，在感染后几天里跟踪了其水平。与在HSV感染期所发生的形成对比，在观察阶段PML和SplOO 二者的水平都增加了(图7A)。PML和SplOO增加率都显著地高于微管蛋白的增加率，表明这两种蛋白在丰度上的增加并不是细胞生长和复制的结果。为了证明此论点，监测了 Daxx(NDK)的另一个构成成分)细胞内水平。与PML 和SplOO不同，在观察期间Daxx的细胞内水平几乎保持不变(图7A)。因为PML和SplOO被干扰素诱导05，60)，这个实验尝试回答这个问题，即在MeWo 细胞中这些蛋白质的表达是否对干扰素敏感，以及干扰素是否对于Daxx有影响。MeWo细胞被两种不同浓度的干扰素α处理。为了证明干扰素通路在MeWo细胞中被激发，STATU STAT2水平以及其活化的磷酸化形式被借助western免疫印迹法监测(图7B)。由这些信号分子丰度和磷酸化所证明，干扰素响应在MeWo细胞中是激活的。测量了三种NDlO组分的丰度。尽管PML和SplOO表达被诱导了，干扰素处理的Daxx水平保持不变(图7B)。这些实验揭示了在VZV感染期，增加的PML和SplOO水平是由于回应由感染细胞分泌的干扰素的诱导以及VZV未能以降解为目的靶向这些蛋白质而导致。在VZV感染期间PML、Spl00和Daxx的功能。ICPO指向PML和SplOO的降解对于 HSV复制是有利的(21，22)。Daxx限制由HCMV和腺病毒的感染(34,68,72) 0因为VZV并不有效地降低NDlO组分的水平，这个实验尝试了回答这个问题，即这些蛋白质的向下-调控是否改变VZV复制的动力学和收率。表达不带靶向、靶向PML、SplOO或Daxx mRNAs的siRNAs重组逆转录病毒被用于转导MeWo细胞以及产生稳定的细胞系(分别为sicontrol、siPML、siSplOO和siDaxx)。通过western免疫印迹法(图8A)和免疫荧光显微镜法(数据没有示出)监测了在这些细胞系中的这些靶蛋白的丰度和定位。如先前报道(21，22)，PML的消耗导致了 NDlO体完整性的缺失，SplOO表达模式的变化，但是在Daxx水平上无明显变化。相反，SplOO或Daxx的向下-调控没有改变其它的NDlO组分的水平和分布。之后，这些细胞系被用于测量VZV的菌斑形成效率。汇合的单层(Confluent monolayers)用无细胞病毒存货(stocks)的系列稀释物来感染。感染后几天，单层被固化和着色，菌斑被计数。在每个细胞系形成的菌斑数目被标准化为在对照细胞中形成的数目。 这个结果揭示了当PML水平下降，增加菌斑的数目在大约2.5倍左右(t(val) =0. 0017)(图8B)。这个结果模拟了在HSV的一个ICP0_变异体中所观察到的02)。相反，SplOO的向下-调控导致较小的(1.2倍)，虽是一惯的，在VZV滴度上的增加(t(val) =0.031)。Daxx 的消耗没有任何影响(图8B)。为了进一步研究NDlO组分对VZV生长的作用，siRNA细胞系用无细胞病毒感染， 并随时间监测病毒蛋白的聚集(图8C)。每个消耗的细胞系中的病毒蛋白所对应的带强度被标准化为在相同时间点对照细胞中所呈现的。0RF63p[—种立早蛋白(immediate early protein) ]、0RF29p [—种早期蛋白(early protein)]的细胞内水平在 siPML 和 siDaxx 细胞感染后早期时间点增加了。然而，在后期时间，其水平与在对照细胞中观察到的类似。类似菌斑形成效率结果，SplOO的消耗仅仅对病毒蛋白水平产生很小的影响。为了研究感染中心的形成，siRNA细胞系用无细胞VZV感染，在感染后的不同时间测量了细胞关联(cell-associated)病毒滴度。与western分析一致(图8C)，在达到与在 sicontrol细胞中观察到的类似稳定水平(plateau)前，感染早期在siPML和siDaxx细胞中形成的感染中心的数目增加了(图8D和8E)。SplOO的消耗对于感染中心产率的影响很小(图8D和8E)。在siPML细胞感染期间，细胞病理效应(Cytopathic effect, CPE)更显著，并且在早于其它细胞系大约M小时菌斑即可见。相反，相比所有其它细胞系，在siDaxx 单层中的菌斑尺寸是相当小的，并且病毒诱导的CPE是最小的，甚至是在感染后期。此外， 尽管该蛋白积聚和感染中心分析证明了加速的病毒复制，类似于在siPML细胞中所发生的 (图8C-E)，令人惊奇的是，在siDaxx中的菌斑形成效率(plaquing efficiency)与在对照细胞中的相同(图8B)。为了探测这些差异存在的基础，在盖玻片上生长的siRNA细胞被感染，并且在感染后2和3天(at 2and 3dpi)，细胞被固化，立早蛋白(0RF63p)和晚期糖蛋白(gE)的表达通过免疫荧光显微镜法进行监测(图9)。在感染后2天对照细胞的核形成了特征的环状结构，该结构表明了细胞融合和有效的病毒扩张(37，71)。在SplOO消耗细胞中，感染病灶(Infected foci)与那些在sicontrol细胞中的尺寸相似。相反，VZV在缺乏 PML或Daxx细胞中扩展更快，这被在感染后2天(at 2dpi)更大的病灶形成所证实的。然而，不像siPML细胞，其发生了广泛的融合；而siDaxx细胞感染扩展不伴随明显的CPE。此外在感染后2天(at 2dpi)，细胞仅仅从siPML单层分离，这导致了评为菌斑的洞。在感染后3天(at 3dpi)(图9)，CPE在来自除了 siDaxx的所有细胞系的单层都是明显的。广泛的细胞融合被检测到，正如被多核体形成和病毒蛋白的同质着色模式所证明。相对其它的细胞系，在siDaxx细胞中的感染扩展是不同的。尽管VZV扩展以感染相邻的细胞，检测到了独自完好的感染细胞且无证据显示细胞融合。这种形态学与sicontrol 细胞显著不同。重要的是，甚至是在病毒感染的后期细胞没有被分离，这就解释了相当小的菌斑尺寸。重要的是，因为感染的细胞保持在单层并未能集拢，在siDaxx系中它们通常没有评为菌斑，从而导致表面上看起来更低的菌斑形成效率(图8B)。在缺乏NDlO体的主要成分的细胞中的病毒复制分析证实了 PML是野生型VZV生长的抑制剂，而SplOO在此过程中如果起任何作用也仅仅是一点点的。Daxx表现出具有一个区别的功能，因为尽管该蛋白的消声(silencing)最初地导致加速的复制和蛋白质积聚，病毒导向的多核体形成是缺陷的。讨论NDlO体的组分，包括PML、SplOO和Daxx，联合DNA病毒基因组并促成了一种内在的抗病毒机制，该机制作用是抑制这些基因组的表达(10，21，22，32，35，47，67-69)。疱疹病毒演化了对策，其绕开这个细胞抑制机制以确保它们的有效复制和扩展。HSV编码一种潜在的转录激活剂，ICP0，其靶向NDlO相关的用于蛋白酶降解的蛋白质，从而导致立早病毒基因的表达增加01，22)。VZV，一种密切相关的alpha疱疹病毒，其编码0RF61P，ICPO的一种直向同源物。 先前的研究已经强调了在这两种蛋白之间的生物活性的保守性，以及已经证明了这两者都是基因表达的激活体09，50)。然而，先前也表明了不同于ICPO，0RF61p未能在病毒复制期间克服用于陪伴蛋白(co-chaperone protein)BAG3的需求，揭示了直向同源物具有不同的功能(38)。这些蛋白质的氨基酸序列比对(sequence alignment)揭示了，虽然0RF61p保有 ICPO保守的环指残基，但它缺乏其HSV直向同源物的C-末端(图1)。这两个区域对于将 ICPO有效靶向NDlO体以及其组分的降解是必要的(16)。0RF61P缺乏ICPO的C-末端以及其相关的NDlO靶向结构域提高了 0RF61p不能降解PML体的成分的可能性。细胞短暂表达ICPO或0RF61p免疫荧光分析以及来自感染了表达疱疹病毒蛋白质的重组腺病毒的细胞的蛋白质western免疫印迹分析揭示了 0RF61p并不消耗PML，以及其SplOO水平的降低不如在表达ICPO的细胞中有效(图3)。此外，通过加入ICPO的靶向结构域将0RF61p靶向 NDlO的尝试并不改变这种表型(图4)。因为ICPO包含两种分离的E3泛素连接酶(E3 ubiquitin ligase)活性，它被描述为一种双头的泛素连接酶(在(30)中有回顾)(图1)。单纯性疱疹病毒泛素连接酶(Herpes simplex virus ubiquitin ligase，HUL)_l 是由 ICPO 的外显子 3编码以及其对于 cdc34 的降解负责08，四，31)。然而，HUL-2的促进PML和SplOO降解的活性映射到ICPO的环指结构域G，31)。在合适的分子环境中的环结构域与蛋白酶的降解相关02)。重要的是，连接一种泛素蛋白酶(HAUSP-USP7)到ICPO的C-末端预示可以促进环指底物(substrates)的降解(30)。这种连接可能导致USP7从新的泛素化HUL-2底物隔离，并确保其用于蛋白酶降解的有效靶向(5，20，30)。基于这些观察，可以预想到两个情形，其解释了为什么0RF61p并没有引起PML和 SplOO的消失。尽管环指结构域对于其转录激活活性是必要的(48)，但0RF61p的其余部分的分子环境可能对其作为一种E3泛素连接酶并不适合。或者，在0RF61p内缺乏一种泛素特殊蛋白酶连接位点可能导致USP7可用，其靶标的快速去-泛素化，从而保护其不受蛋白酶体(proteasomal)降解。更倾向于后一种假设，因为积聚证据揭示了不同于ICPO的自保留性质，其依赖于USP7的结合(5)，0RF61p以一种需要一种功能环指结构域的蛋白酶体依赖方式快速降解了(Kyratsous，DeLong和Silverstein，未发表)。这个观察暗示0RF61p 的环指结构域具有E3连接酶的活性以及能驱动自-泛素化，然而蛋白酶连接位点的缺失导致其消耗。作为这个论点的支持，在0RF61p中没有发现对于结合USP7所必要的在ICPO序列内的氨基酸(19)(图1)。根据VZV蛋白质和NDlOs组分之间关系的更进一步分析，注意到不同于在HSV感染期所观察到的，在VZV感染期PML和Sp 100的丰度增加了(图7A)。这种增加是NDlOs的干扰素-激发组分所特有的(图7B)，因为Daxx水平在整个感染期并没有改变(图7A)。因为VZV诱导干扰素，病毒蛋白被认为并不直接诱导NDlO组分的合成，因此PML和SplOO丰度增加是干扰素刺激的一个间接作用。不能排除这种可能性，即与干扰素不相关的其它途径或许有助于PML和SplOO在感染细胞中的水平增加。令人惊奇的是，尽管0RF61p的自发表达导致SplOO水平的降低(图3)，VZV感染导致一种增加(图7)。在感染期干扰素的诱导被认为掩盖了 0RF61p对SplOO的降解。这就与在HSV感染期所观察到的形成对比，但对照0RF61p时ICPO导致SplOO更有效的降解与这个观察又保持一致(图3)。缺乏ICPO的HSV变异体对干扰素高度敏感(51)，以及这个作用是由PML介导的 (7)。相反，尽管VZV对干扰素敏感；但0RF61变异体不同于ICPO变异体那样对干扰素高度敏感(1)。这些数据与在VZV感染期PML是不降解的这个观察一起揭示了干扰素通过特有的机制来抑制这两种人alpha疱疹病毒的复制，以及这些病毒演化了不同的特别对策。作为结论，不同于HSV，VZV可能并不需要PML的降解来克服由干扰素引起的抑制。还有报道称PML、Sp 100和Daxx抑制疱疹病毒复制的早期阶段(21，22，67-69)。消耗每种上述蛋白质的稳定细胞系被用于分析这些蛋白质是否也影响VZV的复制动力学和产率(图8A)。不同于其在HSV感染中的作用，SplOO在感染了 VZV的细胞中对菌斑形成效率、基因表达和感染中心滴度几乎没有影响。然而，SiPML和SiDaxx两者的感染细胞系导致滴度增加和在早期病毒蛋白的积聚。因而，这些蛋白质专一地阻止病毒复制的早期阶段。除去这些差别，VZV 的细胞关联滴度在所有细胞系中的感染后期都达到相同的滴度峰值。VZV复制被假设是由两种独立的宿主介导步骤控制由PML、Daxx和可能的其它宿主蛋白介导的早期限制，以及决定病毒产率的后期限制。尽管那些在早期发挥抑制病毒生命周期的初始阶段的蛋白质的消耗导致加速的复制动力学，但这对于增加感染中心的扩展和发展并不是充分的。研究NDlO组分在野生型HSV感染期间的功能是困难的，因为这些蛋白质在ICPO 表达后快速降解了，从而从感染细胞中缺失了。因此，这些宿主产物的消耗对野生型病毒复制动力学和产率并无作用，但是提高了一种未能导向降解的ICPO-病毒的复制01，22)。这项研究的结果证明了在PML消耗的细胞中，野生型VZV模拟ICP0_病毒复制(图8)，并且未能导向NDlO体的主要组分的降解(图3)。与PML相反，当0RF61p被表达，SplOO丰度部分地降低了(图3)，以及该蛋白的消耗对病毒复制只有很小的作用(图8)。因此，VZV可能已演化了，以便滴定(titrate) SplOO的水平达到有效复制所必要的程度。或者，在siRNA消耗后在细胞内保持的少量SplOO可能对于其用于静默VZV是足够的。总之，这项研究表明VZV在细胞培育中的生长显示其作为alpha疱疹病毒家族的一个独特的成员。不同于其它的ICPO直向同源物(55)，0RF61P并不导向NDlO组分的降解。VZV与这个内在的防御机制的相互作用与腺病毒如何对付宿主介导的静默最相似(72， 73)。这两种病毒都不能降解NDlO蛋白质，然而两者都克服由干扰素带来的限制。此外，与 HSV相反，但其同样是腺病毒，VZV复制不受由SplOO消耗的影响，但当PML和Daxx被静默时，它的复制被加速了。尽管认为HSV和VZV非常相似，这项研究证实了它们已经演化了独特的和专一的途径以干扰宿主细胞的抑制，从而确保其有效的生长和扩展。结果IIAlpha疱疹病毒编码单纯性疱疹病毒(HSV) α基因产物ICPO的直向同源物。 ICPO是一种细胞核磷蛋白，其作用为一种病毒和细胞基因的混杂激活剂(promiscuous activator) (83，87，104，105)。ICPO也发挥作为E3泛素连接酶的作用以靶向用于蛋白酶降解的几种宿主蛋白(80,86,87,92,102).通过此活性，ICPO促进核域10 (NDlO)体组分，包括前骨髓细胞癌(promyelocytic leukemia, PML)蛋白和SplOO的降解。这些蛋白质与疱疹病毒基因组的静默相关(86，87，98，110)。因此，ICPO介导的NDlO组分的降解可能破坏 HSV基因静默，以允许有效的基因表达。这个假设对于ICPO如何诱导基因活化提供了一种似乎合理的机理解释。引入编码来自HSV、牛疱疹病毒、马疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒(VZV)的ICPO直向同源物的DNA也能够影响细胞核的结构和蛋白质(103)。另外对于此报道更具体的是， 0RF61p作为VZV的直向同源物，它和这个基因家族中的原型ICPO —样激活病毒启动子和提高病毒DNA的易感性(100，101)。然而，HSV和VZV的直向同源物之间的两个关键的生物学差异在先前已被证明了。不同于ICP0，0RF61p不能补足BAG3(—种宿主陪伴蛋白)的消耗。结果就是，VZV受到静默BAG3的影响(91)，而HSV的生长仅仅当ICPO没有被表达时变化(9 。此外，由于两种蛋白都靶向NDlOs组分，ICPO的表达导致PML和SplOO这两者都降解，而0RF61p专一地降低SplOO的水平(9 。这些发现表明这些蛋白质分别地演化了以提供用于病毒复制的不同功能。缺失ICPO基因的病毒变异体具有增加的粒子与菌斑形成单元(plaque forming unit) (pfu)比例，实质上较低的产率和降低的α基因表达水平，以一种感染复数 (multiplicity of infection,moi)和细胞类型依赖的方式(78，80，84，109)。这些变异体在降解NDlO组分上也是有缺陷的(99)。PML和SplOO的消耗加速了病毒基因的表达，并增加了 HSV ICPO缺陷病毒菌斑形成效率，但对于野生型病毒没有作用这就提出PML和SplOO 是一种内在的抗-HSV防御机制的成分，该机制由ICPO的E3连接酶的活性抵消(86，87)。 有趣的是，ICPO零病毒(ICP0 null viruses)也对于干扰素(IFN)高度敏感(102)，一种预示为通过PML介导的性质(79)。构建了一种表达0RF61p以替代ICPO的HSV变异体病毒，以便直接对照这两种直向同源物的活性。得到的嵌合病毒仅仅部分地补救了这种ICPO零表型(ICP0 null phenotype)。这样的研究强调了 ICPO和0RF61p之间的生物学差异，并阐明了在感染期对于PML和SplOO需求。材料和方法哺乳动物类细胞.人黑色素瘤(MeWo)、siPML(93)、siSpl00(92)、 L7(106)和U20S细胞按照先前描述的获取(91，111)。DNA 转化·通过 Fugene HD[Roche，Indianapolis，IN]，DNAs 被转化入合适的细胞系。药物治疗.干扰素α 购自 PBL Biomedical [Piscataway, NJ]公司。病毒.[i]HSV.使用的菌株是野生型HSV-I (Glasgow strain 17)和一种菌株 17(dll403)的 ICPO零病毒衍生物(109)。[ii]表达VZV 0RF61p&HSV(HSV-0RF61).dll403 病毒粒子(nucleocapsids)被用线性化的pCPC-061共感染入MeWo细胞。挑选出大的菌斑并通过PCR扩增筛选重组病毒。那些对0RF61p而非ICPO编码序列为阳性的菌斑是被纯化五次的菌斑。病毒生长分析.[i]菌斑分析』610、8丨 1^、8丨5 100、1^7或似05细胞的汇合单层用病毒存货(Stocks)的10倍系列稀释物感染，单层被固化和着色，以及菌斑被计数。[ii] 生长曲线.在分析前，所有HSV存货的滴度通过在ICPO-互补细胞系L7上滴定来测量。病毒产率按照先前描述的来测定(93)。
Hirt DNA 提取。Hirt DNA 按照描述制备(90)。质粒构建物。VZV 0RF61 PCR扩增自VZV基因组DNA (Jones菌株)，其采用RV61 ( 5' -GGGTCGACTTGCATTACCCTATCCCAGTATT-3' )(SEQ ID NO :7)禾口3, Sal61(5' -CCGTCGACC CCAACAAACTAGGACTTCT-3 ‘ ) (SEQ ID NO 8)。这些 PCR 产物被克隆入 pCR2. 1-T0P0 以产生 pCPC-T61cJ。0RF61编码序列被切离为一种Ncol/Sall片段，该片段用于在Ncol/Sall消化的pDS17中替代编码ICPO的序列(113)，以产生pCPC-061。所有引物从Operon Biotechnologies[Huntsville,AL]公司获得以及所有载体插入物通过DNA测序验证。重组病毒基因组的分析。Hirt DNAs中的0RF61序列的存在性被验证以及通过PCR 方法证实IE-O编码序列的缺失，采用引物0for 5' -ACAGAAGCCCCGCCTACGTT-3‘，Orev 5 ‘ -GGTGCCCGTGTCTTTCACTTTTC-3 ‘ ,61for 5 ‘ GGGAATTCGGGGCCCCTTCAATCGTCGGCTAG-3 ‘,61rev 5' TGCGGCCGCGAATCTCGCGTTTCCCTCTGTTCC-3‘ (SEQ ID NOS 3-6，分别地)。抗体。对于ICPO的多克隆抗体已描述00)。对于ICPO和ICP4的单克隆抗体购自 Rumbaugh-Goodwin 研究院[Plantation, FL]。描述过抗 ORF δ Ip 的多克隆抗体(92)。 对于微管蛋白的单克隆抗体从Santa Cruz Biotechnology [Santa Cruz，CA]公司获得。抗 PML和SplOO的多克隆抗体购自Chemicon[Temecula，CA]公司。结合了用于免疫印迹的辣根过氧化物酶的山羊抗-兔和抗-鼠抗体从KPUfeiithersburg，MD]公司获得。SDS-PAGE和western免疫印迹。感染的或生物化学法转化的细胞被用冷的磷酸盐缓冲液(PBQ洗涤两次，细胞溶解在1.切SDS样品缓冲液[75mM TrisHCl pH 6. 8，150mM DTT，3% SDS，0. 15%溴酚蓝，15%甘油]中，并煮沸。宿主和病毒蛋白被用于SDS-PAGE分析(94)。在western免疫印迹前，蛋白质被转移到硝化纤维膜上。在含有5%脱脂牛奶的 PBST中封闭薄膜之后，固定的蛋白质与合适的抗体在含1 %脱脂牛奶的PBST中反应。薄膜用PBST洗涤三次，每次5分钟，用结合到辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)的抗-兔和抗-鼠抗体接种；然后用PBST洗涤三次，每次5分钟，再用PBS洗涤两次。通过加入LumiGLO底物[KPL]并曝光X射线胶卷抗体被可视化。结论产生一种VZV-HSV重组其表达0RF6Ip。用VZV共感染(Coinfection)补充了一种 HSV-ICPO变异体的生长(109)。随后，一种有条件地表达0RF61p的细胞系被用于补充一种 ICPO零变异体(ICPO null mutantM24)。后一实验揭示了这些病毒的直向同源物共同享有一些生物活性。然而，这些蛋白质区别地影响NDlO组分和野生型VZV，而非HSV，表明对这些组分的不同需求(92)。因此，为进一步剖析0RF61p的功能，这项研究探讨了当它在代替重复的立早O (immediate early 0) (IE-O)位点时是否能替代HSV ICPO0为了替代编码ICPO HSV 的位点(the loci encoding ICPO HSV)，用 dl 1403作为病毒骨架。dl 1403编码前105个氨基酸和额外的56个氨基酸，他们衍生自IE-O基因的第二个和第三个外显子的帧频失调融合蛋白(out of frame fusion) 0按照在材料和方法中的描述，0RF61p编码序列被扩增以及插入进一个Ncol/Sall消化的ICPO克隆抗体。该Ncol位点包含了 AUG密码子，该密码子被这两个基因用于启动它们各自的蛋白质合成。得到的质粒 (pCPC-061)结构完整性，其保持了该IE-O启动子和3' UTR，被通过限制性内切核酸酶裂解以及DNA测序分析验证。随后，pCPC-061被线性化并与dll403病毒粒子(nucleocapsids)一起共-转染入MeWo细胞(107)。得到的重组病毒被滴定在MeWo细胞上，以及挑选出大菌斑并推测0RF61p的表达会补足ICPO-缺陷(100，109)。由这些菌斑制得的Hirt DNAs 通过PCR方法被筛查，采用引物IE-O的上游和下游以及与0RF61同源的两个内部引物(图 10A)。包含带有编码0RF61p序列并不编码ICP0DNA的病毒DNA的菌斑(图10B)被进一步纯化以及用于感染细胞，以测定它们是否表达0RF61p。该分析结果显示在图IOC并总结如下感染了 dll403或HSV-0RF61的细胞的western免疫印迹分析证实了它们在感染后6小时表达相似数量的ICP4且无ICPO表达，并且HSV-0RF61表达0RF61p。因此，在HSV-0RF61 中一个缺陷的IE-O基因的两个复制品被0RF61p编码序列替代以及得到的病毒在IE-O启动子的控制下表达0RF61p。HSV-0RF61的生长和菌斑形成效率。进行了两个实验以测试是否0RF61p的表达补救了 ICPO零表型。首先，野生型dll403和HSV-0RF61被相对于L7和Vero细胞滴定以及相对菌斑形成效率被计算为在L7细胞上的滴度相对于在Vero细胞上的滴度的百分比。 HSV dll403，和其它的ICPO变异体病毒，具有高的颗粒/菌斑形成单元(pfu)比例，这在当在补充细胞例如L7上测试它们的滴度被并在亲代的Vero细胞系上对照它们的滴度时是明显的。这三种病毒的菌斑形成效率是野生型=0. 9，dll403 = 340和HSV-0RF61 = 9. 5 (图 11A)。因此，尽管0RF61p的表达提高HSV-0RF61相对于dll403的菌斑形成效率达大约35 倍，但这对于恢复野生型菌斑形成不是充分的。这项研究接着探究了 0RF61p的表达如何影响重组病毒在MeWo细胞中的生长动力学。细胞在低的感染复数(moi)下被感染，样品随时间被收集，每一细胞感染病毒的产率通过在L7细胞上的菌斑分析来测定。生长曲线的分析揭示了 HSV-0RF61复制的动力学介于野生型和dll403 二者之间(图11B)。这些实验导出这样的结论，依据菌斑形成效率和病毒产率，0RF61p不能完全补偿ICPO的缺乏。在感染了 HSV-0RF61的细胞中病毒指定蛋白的积聚。在低感染复数(mois)下 ICPO变异体的生长缺陷表现为所有类别的病毒-指定蛋白的延迟表达和降低的积聚(2， 4)。因此，在moi 0. 2处MeWo细胞用野生型、dll403和HSV-0RF61进行感染。免疫荧光分析 ICP4(没有给出数据)被用于验证每一病毒感染了相同数量的细胞。细胞溶解产物在指定的时间制备得到并处理用于western免疫印迹分析。蛋白质丰度分析和合成动力学揭示了在低感染复数(moi)的条件下，在感染后4小时在感染野生型病毒的细胞中检测到ICP4的积聚。相反，这种蛋白质在直到感染后6小时在感染dll403或HSV-0RF61的细胞中都没有检测到(图12)。此外，在感染后8小时ICP4的丰度在感染了变异体病毒的细胞中相对于在野生型感染细胞中明显降低了。如先前描述，ICP27的合成动力学和积聚依赖功能的ICPO 的表达(97)。这个表型在当0RF61p被表达时仅仅部分反转了(reversed)(图13)。正如预期，ICPO和0RF61p仅仅在感染了表达这些蛋白质的病毒的细胞中被检测到。这些数据， 与菌斑形成效率和生长的研究(图11) 一致，证明了 0RF61p不完全表型复制(phenocopy) ICPO的生物学性质，尽管它明显地提高了一种ICPO-病毒的复制。感染后NDlO成分的命运.ICPO对于游离NDlOs和靶向其两个主要成分PML和 SplOO并用于蛋白酶体降解是必要和充分的，。与之相对，0RF61p不降解PML，但降低SplOO 水平(92)。相应地，PML和SplOO的命运在感染HSV-0RF61期间被跟随，并与在感染野生型或dll403的细胞中所发生的进行对照。Western免疫印迹分析揭示了在感染了野生型病毒的细胞中，在较早的时间如感染后2小时就检测到了 PML的降解。相反，PML水平在感染了 dll403或HSV-0RF61的细胞中都没有改变(图13A)。这些结论更加坚定了先前的发现并证实了 0RF61p不影响PML的稳定状态水平(steady state level)，甚至在其它HSV立早或早期蛋白存在的情况下。SplOO是NDlOs的另外一个主要组分，众所周知它在感染HSV 后以一种ICPO依赖的模式有效降解了(80)。这项研究证明了在HSV基因表达的环境下， 0RF61p有效导向SplOO的降解(图13A)。野生型HSV和VZV病毒区别地受PML或SplOO的消耗影响(92)。在siPML和 SiSplOO细胞中测定了 HSV-0RF61相对菌斑形成效率，并对照了野生型HSV和dll403的效率以测定HSV-0RF61是否受到宿主蛋白PML或SplOO向下调控的影响。如先前报道，野生型病毒的菌斑形成效率在当滴定在消耗了 PML(SiPML)或SplOO (SiSplOO)的细胞上时不受影响(图13B)。相反，dll403在缺失这些NDlO成分时仅部分被补偿(图13B)。HSV-0RF61 的相对菌斑形成效率表型模拟(phen0C0pied)VZV(9》。更具体地，在siPML细胞中病毒滴度增加，而在SiSplOO细胞中其保持不变(图13B)。干扰素对于病毒复制的影响。先前的研究建议了 HSV的干扰素(IFN)敏感性是 PML介导的，并提出一种ICPO-病毒在某种程度上是高度敏感的，因为它未能降解这种细胞蛋白。已显示了 HSV-0RF61不能降解PML，这项研究探索了 IFN处理如何影响这种变异体病毒的生长。对比了 HSV-0RF61p、MeWo上的野生型HSV-I和dll403、Vero [其响应但不表达 IFN(8 ]和U20S [—种补充ICPO变异体病毒的细胞系(112)]细胞在存在和不存在干扰素 (IFN)的情况下的菌斑形成效率。在MeWo和Vero细胞中dll403和HSV-0RF61这两者的菌斑形成效率都受假定为响应干扰素而合成的干扰素-刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的影响(图14)。这个在野生型病毒的MeWo和Vero细胞上观察到的敏感度上小的差异0到5_倍)并不是由绝对菌斑形成效率(absolute plaquing efficiency)差异造成的结果，而是反射出在Vero细胞中所有病毒对干扰素(IFN)作用的较大敏感度(表 1)。
表1 病毒滴度
权利要求
1.一种重组脱氧核糖核酸，该重组脱氧核糖核酸包含一种具有整合的异源DNA人单纯性疱疹病毒(HSV)的脱氧核糖核酸(DNA)，其中该异源DNA编码一种包含环-指结构域的多肽。
2.根据权利要求1所述的重组脱氧核糖核酸，其中该HSVDNA是基因组DNA，以及该异源DNA被整合入该HSV DNA以替代该HSV基因DNA组中编码HSV感染细胞多肽0 (ICPO)的部分。
3.根据权利要求2所述的重组脱氧核糖核酸，其中该异源DNA被插入进该HSV基因组 DNA的一个HSV ICPO 5'的非翻译域(UTR)和一个HSV ICPO 3'的非翻译域(UTR)之间。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的重组脱氧核糖核酸，其中包含了该环-指结构域的该多肽具有水痘带状疱疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的重组脱氧核糖核酸，其中包含该环-指结构域的该异源多肽具有一种马疱疹病毒、牛疱疹病毒或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。
6.根据权利要求4或5所述的重组脱氧核糖核酸，其中该HSVDNA是一种HSV基因组。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的重组脱氧核糖核酸，该重组脱氧核糖核酸还包含一种编码一种糖蛋白的异源DNA。
8.根据权利要求7所述的重组脱氧核糖核酸，其中该糖蛋白具有一种水痘带状疱疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的重组脱氧核糖核酸，其中该糖蛋白包含一个水痘带状疱疹病毒的中和表位。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的重组脱氧核糖核酸，其中由该重组脱氧核糖核酸编码的多肽都不降解哺乳动物类的前骨髓细胞癌(PML)蛋白。
11.根据权利要求1-10任意一项所述的重组脱氧核糖核酸，其中编码该多肽的该异源 DNA被整合，从而当该重组脱氧核糖核酸被整合入一种合适的宿主细胞的基因组时，该多肽被表达。
12.根据权利要求7-11任意一项所述的重组脱氧核糖核酸，其中编码该糖蛋白的该异源DNA被插入进该HSV DNA的一个非必要基因或区域中。
13.一种包含编码一种带有环-指结构域的多肽的异源DNA的重组人单纯性疱疹病毒 (HSV)，该异源DNA (a)被插入该HSV基因组的一个非必要区域中，以及(b)在该重组HSV引入的宿主细胞中被表达。
14.根据权利要求13所述的重组HSV，其中该异源DNA被插入进该HSV基因组以替代该HSV基因组中编码HSV感染细胞多肽0 (ICPO)的部分。
15.根据权利要求13或14所述的重组HSV，其中该异源DNA被插入进该HSV基因组的一个HSV ICPO 5'的非翻译域(UTR)和一个HSV ICPO 3'的非翻译域(UTR)之间。
16.根据权利要求13-15任意一项所述的重组HSV，其中包含了该环-指结构域的该多肽具有水痘带状疱疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。
17.根据权利要求13-15任意一项所述的重组HSV，其中包含该环-指结构域的该多肽具有一种马疱疹病毒、牛疱疹病毒或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。
18.根据权利要求13-17任意一项所述的重组HSV，该重组HSV还包含一种编码一种糖蛋白并被插入该HSV基因组的一个非必要区域中的异源DNA。
19.根据权利要求18所述的重组HSV，其中该糖蛋白具有一种水痘带状疱疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。
20.根据权利要求18所述的重组HSV，其中该糖蛋白包含一个水痘带状疱疹病毒的中和表位。
21.根据权利要求18所述的重组HSV，其中编码该糖蛋白的该异源DNA被插入进该HSV 基因组的一个非必要基因或区域中。
22.根据权利要求18所述的重组HSV，其中由该重组HSV基因组编码的多肽都不降解PML。
23.根据权利要求13-22任意一项所述的重组HSV，其中该重组HSV包含多达8个不同的异源DNA，且每个DNA编码一个不同的水痘带状疱疹病毒糖蛋白。
24.一种疫苗，该疫苗包含(1) 一种药学可接受载体和( 一种重组病毒，该重组病毒包含一种包含人单纯性疱疹病毒(HSV)基因组的重组脱氧核糖核酸，该人单纯性疱疹病毒 (HSV)基因组(a)具有一种编码包含一个环-指结构域多肽的整合的异源DNA以及(b)具有一个或多个整合的异源DNA，其中每个DNA编码一种糖蛋白。
25.根据权利要求M所述的疫苗，其中该异源DNA被整合入该HSV基因组以替代该HSV DNA中编码一种HSV感染的细胞多肽0 (ICPO)的部分。
26.根据权利要求M或沈所述的疫苗，其中该异源DNA被插入进该HSV基因组的一个 HSV ICPO 5'的非翻译域(UTR)和一个HSV ICPO 3'的非翻译域(UTR)之间。
27.根据权利要求M46任意一项所述的疫苗，其中包含一个环-指结构域的该异源多肽具有水痘带状疱疹病毒0RF61蛋白的氨基酸序列。
28.根据权利要求M-27任意一项所述的疫苗，其中包含一个环-指结构域的该异源多肽具有马疱疹病毒、牛疱疹病毒或假狂犬病病毒蛋白的氨基酸序列。
29.根据权利要求M-观任意一项所述的疫苗，其糖蛋白具有一种水痘带状疱疹病毒糖蛋白的氨基酸序列。
30.根据权利要求M-四任意一项所述的疫苗，其糖蛋白包含一个水痘带状疱疹病毒的中和表位。
31.根据权利要求M-30任意一项所述的疫苗，其中编码该糖蛋白的异源DNA和编码包含该环-指结构域多肽的异源DNA都被插入进该HSV基因组的非必要基因或区域中。
32.一种使受试者抗水痘带状疱疹病毒感染的免疫方法，该方法包含给予受试者一定量根据权利要求26-31任意一项所述的疫苗，以有效引起受试者对该水痘带状疱疹病毒的免疫应答，从而使受试者免疫。
33.一种制备用于预防一种病毒感染的组合物的方法，该方法包括将根据权利要求 13-23任意一项所述的重组病毒与一种活疫苗稳定剂结合，从而制备该组合物。
全文摘要
提供了一种重组脱氧核糖核酸，该重组脱氧核糖核酸包含一种具有异源DNA整合的人单纯性疱疹病毒(HSV)的脱氧核糖核酸(DNA)，其中该异源DNA编码一种包含环-指(RING-finger)结构域的多肽，一种包含如所述的重组病毒，一种疫苗以及免疫方法。
文档编号A61K39/12GK102573898SQ201080040508
公开日2012年7月11日 申请日期2010年7月16日 优先权日2009年7月28日
发明者C·A·克雷特苏, C·A·帕奈格劳蒂兹, M·S·沃尔特斯, S·J·西尔弗斯坦 申请人:纽约哥伦比亚大学理事会