一种丙型肝炎病毒的dna疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种丙型肝炎病毒的DNA疫苗及其制备方法，属于分子生物学和感染免疫领域。本发明的DNA疫苗是HCV-E2的第2个N-糖基化位点产生突变，即N423RT突变为D423RT。该突变体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在E2基因两端引入CpG序列，并将突变的片段构建到真核表达载体上即得到能产生E2突变体的DNA疫苗。本发明方法简便，成本低，制备的DNA疫苗可诱导产生比野生型HCVE2更强的特异性细胞免疫和中和性抗体，特异性的杀伤性CD8+T活性增强，并能够引起较强的IFN-γ、IL4释放，有效地中和病毒进一步感染，克服了糖基化蛋白质在表达上的困难。
【专利说明】一种丙型肝炎病毒的DNA疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学和感染免疫领域，具体涉及一种丙型肝炎病毒的DNA疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002]丙型肝炎病毒(h印atitis C Virus, HCV)感染是导致慢性肝炎、肝癌、肝硬化的主要因素之一，严重影响人类健康，我国是HCV高感染率国家之一，目前的治疗手段有限，尚无有效的治疗和预防性HCV疫苗。
[0003]HCV为单链正义RNA病毒，其基因表达产物为含3011个氨基酸的多聚蛋白，经蛋白酶剪切后形成多种蛋白(核衣壳蛋白Core、包膜蛋白El和E2 ;离子通道蛋白P7 ;非结构蛋白 NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)(Pwalotsky JM, Gastroenterology, 2002，122(6):1554-1568)。E2蛋白对应于多 聚蛋白链中的氨基酸序列是384?746氨基酸。HCV包膜糖蛋白为病毒外壳的主要成分，在感染中发挥着重要的作用:参与病毒蛋白粒子的装配、与肝细胞表面受体结合相互作用介导病毒进入，并且，E2是诱导中和抗体的主要抗原区，故HCV E2区及其编码的抗原是HCV疫苗研究的重点(Fournillier, et al.J.Virol, 2001; 75:12088),此外，E1、E2含有T、B细胞表位，可以诱导保护性免疫反应，是保护性抗原。
[0004]E2是高度糖基化的蛋白，糖基化是蛋白翻译后的重要修饰加工环节，可以诱导蛋白空间构象正确折叠，增加蛋白的酶亲水性，稳定性，并且可以调节蛋白的抗原性。E2上含有11个N-糖基化位点，并且尽管不同基因型HCV中包膜蛋白E2的氨基酸序列具有可变性，这些糖基化位点却是高度保守的(Goffard, A et al..J.Virol, 2005，79:8400-8409; Slater-Handshy et al, Virology, 2004, 319 (I): 36-48),这意味着这些糖基化修饰是HCV生活周期中起重要作用。对这些聚糖的功能分析表明:糖基化修饰在蛋白质折叠、HCV进入中起关键作用，同时寡糖链可以保护病毒的包膜蛋白被宿主细胞的蛋白酶降解，还可以遮蔽病毒抗原，使机体不能有效识别病毒，保护病毒抵抗抗体中和作用，例如:E2上423和448(E2N2和E2N4)位糖基化位点突变明显减少HCVpp (HCV假病毒)的感染性，417，532和645位的糖基化修饰(E2N1，E2N6和E2N11)能够保护HCVpp以及HCVcc (HCV cell culture，细胞培养病毒)抵抗抗体的中和作用(Reviewed by Helle, viruses, 2011)。另一方面,通过除去病毒包膜蛋白的糖苷还可以改变蛋白的免疫原性，研究表明，El的209位糖基化位点突变后，可以诱导更强的细胞免疫反应，305位突变可增强体液免疫，E2的576位突变可显著增强特异性细胞免疫反应。但是E2上与中和性抗体表位惜惜相关的糖基化修饰位点N1/N2/N4/N6/N11去除后能否在体内诱导产生抗HCV中和抗体(neu_IgG)仍不清楚，并且这些位点中N-聚糖删除能否在体内介导产生强的细胞免疫反应国内外均未见报道。
[0005]E2对HCV整个生命周期至关重要，然而至今仍无针对HCV E2的小分子药物或者有效的广泛性中和抗体，对HCV的治疗手段非常有限。利用经典的蛋白免疫获得抗体的方法在实际应用中困难重重，一方面要获得真核表达的含完整糖基化修饰的E2蛋白(?70KD)产量极低且纯化困难，而采用原核表达系统获得的E2蛋白仅有?35KD，缺乏糖基化修饰，不能保持原有的构型，以此作为抗原缺乏一些关键的抗原表位，另一方面，HCV E2蛋白的免疫保护性较低，需要进一步改造。利用DNA疫苗可以在基因水平方便的对抗原进行某些改造，并且制备方法简单。DNA疫苗已经广泛地应用于乙型肝炎病毒，狂犬病毒和人类获得免疫缺陷病毒的预防和治疗中。它的基本原理是将编码抗原的基因片段直接通过肌肉注射或基因枪等方法直接导入宿主体内，DNA转入体内后即可表达相应的蛋白抗原，其中，内生(源)性蛋白抗原经MHC I类途径呈递，诱导产生细胞毒性淋巴反应(CTL)效应性⑶8+T细胞，而可溶性抗原蛋白释放到细胞外后，被专职抗原递呈细胞(APC)摄取，然后经MHC II类途径呈递，活化CD4+T细胞，及其随后产生抗体的B细胞活化，因此DNA免疫可全面诱导机体的免疫反应。在制备DNA疫苗时还可引入菌源性的非甲基化CpG DNA作为佐剂，它是指以CpG为核心的寡核苷酸序列，主要是通过与TLR9识别发挥免疫促进作用，具有增强巨噬细胞，DC细胞以及B细胞的功能，激活小鼠免疫细胞的最佳CpG序列为GACGTT，激活人免疫细胞的最佳 CpG 序列为 GTCGTT (reviewed by M.Krieg)。
【发明内容】
[0006]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种具有更强免疫保护性的HCV包膜糖蛋白E2突变体以及编码该突变体的基因。
[0007]本发明的另一目的在于提供产生上述突变体的DNA疫苗。
[0008]本发明的再一目的在于提供上述DNA疫苗的制备方法。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0010]一种HCV包膜糖蛋白E2突变体，其第2个N-糖基化位点发生突变，即N423RT突变为D423RT，使N糖基化修饰不能进行，所述的突变为将天冬酰胺突变为天冬氨酸；所述的HCV包膜糖蛋白E2突变体的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011 ] 编码上述HCV包膜糖蛋白E2突变体的基因，E2基因序列的N-糖基化位点的核苷酸发生了突变，突变为能编码天冬氨酸的核苷酸。
[0012]优选的，编码如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的HCV包膜糖蛋白E2突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0013]上述基因的N端还引入了菌源性非甲基化CpG序列，较佳的CpG序列为GACGTT。
[0014]一种产生上述突变体的DNA疫苗，包含真核表达载体和上述基因；所述的真核表达载体优选为P⑶NA3.1。
[0015]上述DNA疫苗的制备方法，包括如下步骤:在HCV E2基因两端引入CpG序列以及酶切位点，将该片段构建到载体上，再用定点突变PCR方法将E2上相应的N-糖基化位点突变，将突变的片段构建到真核表达载体上即得到所述DNA疫苗。
[0016]优选的，使用引物CpG-sE2-F和sE2_R扩增E2基因，在E2基因两端引入CpG序列及酶切位点BamH 1、Hind III ;使用引物CpG_sE2-f、E2N2_Ur扩增含点突变序列的上游片段，用引物E2N2-Df、sE2-R扩增含点突变序列的下游片段，再使用CpG-sE2_F和sE2_R以上游片段和下游片段为模板扩增得到E2第2个N-糖基化位点突变为天冬氨酸的片段，将该片段构建到P⑶NA3.1上，得到产生如SEQ ID N0.1所示序列的E2突变体的DNA疫苗；其中，所述引物序列如下:
[0017]CpG-sE2-f: CGGGATCCGACGTTATGGTAGGGAACTGGGCGAAGG,[0018]sE2-r:GCAAGCTTCTCGGACCTGTCCCTGTCGTC,
[0019]E2N2-Df: TTGGCACATCgATCGCACGGCCTTGAAC,
[0020]E2N2-Ur:GTTCAAGGCCGTGCGATcGATGTGCCAA。
[0021]本发明具有如下优点和效果:本发明的HCV包膜糖蛋白E2突变体可诱导产生比野生型HCV E2更强的特异性细胞免疫(CTL)和中和性抗体(neutralizing antibody, NAb),特异性的杀伤性CD8+T活性增强，并能够引起较强的IFN- Y、IL4释放，因而可以有效地清除病毒，在体外能有效地中和病毒感染。本发明方法简便，成本低，制备的DNA疫苗以真核表达质粒DNA为免疫原，直接偶联CpG佐剂联合免疫，克服了糖基化蛋白质在原核和真核表达上的困难，有效地中和病毒进一步感染。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是免疫后小鼠血清中E2特异性抗体的滴度结果图。
[0023]图2是免疫印迹检测免疫后小鼠血清中和抑制HCV的NS3的表达结果图。
[0024]图3是乳酸脱氢酶释放实验检测小鼠细胞毒性T细胞特异性杀伤活性的结果图，横坐标表示效靶细胞的比例。
[0025]图4是酶联免疫斑点法检测免疫后小鼠脾脏中淋巴细胞免疫水平结果图；其中，A:淋巴细胞释放IFN- Y的水平，B:淋巴细胞释放IL4的水平。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段 为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0027]实施例1
[0028]构建分泌型糖基化单点缺失突变的E2突变体的真核重组质粒
[0029]利用PCR从Ia型HCV基因组序列(基因序列号为GenBank Acc.N0.AY958062)中扩增出可表达分泌型E2蛋白(Secreted E2, sE2)的E2的基因序列，同时在该序列N端起始密码子(ATG)上游引入菌源性非甲基化CpG序列(GACGTT)，进一步将该片段构建到真核表达载体pcDNA3.1㈠(Invitrogen)上。再通过PCR定点突变方法将sE2上第2个N-糖基化位点(N423RT)的天冬酰胺突变为天冬氨酸(D423RT)，获得重组质粒分别命名为平N2。
[0030]本实施例中所用到的引物如下表所示:
[0031]
【权利要求】
1.一种HCV包膜糖蛋白E2突变体，其特征在于:包膜糖蛋白E2的第2个N-糖基化位点发生突变，即N423RT突变为D423RT。
2.根据权利要求1所述的HCV包膜糖蛋白E2突变体，其特征在于:其氨基酸序列如SEQID N0.1 所示。
3.编码权利要求1或2所述的HCV包膜糖蛋白E2突变体的基因，其特征在于:E2基因序列的N-糖基化位点的核苷酸发生了突变。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于:其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
5.根据权利要求3所述的基因，其特征在于:所述基因的N端引入了菌源性非甲基化CpG序列。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于:所述的CpG序列为GACGTT。
7.—种产生权利要求1或2所述的的DNA疫苗,其特征在于:包含真核表达载体和权利要求3-6任一项所述的基因。
8.根据权利要求7所述的DNA疫苗，其特征在于:所述的真核表达载体为PCDNA3.1。
9.权利要求7或8所述的DNA疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤:在HCVE2基因两端引入CpG序列以及酶切位点，将该片段构建到载体上，再用定点突变PCR方法将E2上相应的N-糖基化位点的突变，将突变的片段构建到真核表达载体。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于:使用引物CpG-SE2-F和sE2_R扩增E2基因；使用引物CpG-sE2-f、E2N2-Ur扩增含点突变序列的上游片段，用引物E2N2_Df、sE2-R扩增含点突变 序列的下游片段；再使用CpG-sE2-F和sE2_R以上游片段和下游片段为模板扩增得到E2第2个N-糖基化位点突变的片段，将该片段构建到PCDNA3.1上，得到产生如SEQ ID N0.1所示序列的E2突变体的DNA疫苗；其中，所述引物序列如下:
CpG-sE2-f:CGGGATCCGACGTTATGGTAGGGAACTGGGCGAAGG,
sE2-r:GCAAGCTTCTCGGACCTGTCCCTGTCGTC,
E2N2-Df:TTGGCACATCgATCGCACGGCCTTGAAC,
E2N2-Ur:GTTCAAGGCCGTGCGATcGATGTGCCAA。
【文档编号】C12N15/51GK103435690SQ201310417993
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】章晓联, 闵远琴 申请人:武汉大学