专利名称：麻疹-人乳头瘤组合疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对麻疹和人乳头瘤病毒(HPV)的组合疫苗。特别地，本发明涉及含 有异源核酸的重组麻疹病毒载体，所述异源核酸编码一种或多种源自于HPV的抗原，优选 HPV 16型(以及任选地18型、6型和11型)的主要衣壳抗原Li、次要衣壳抗原L2、早期基 因E6及早期基因E7癌蛋白。在第一个实施方案中，产生表达HPV抗原(优选Ll和/或L2)的预防性疫苗，以使 其在哺乳动物(优选人)中可诱导强的长效免疫应答，以提供针对HPV和MV感染的保护。 在另一个实施方案中，产生表达E6和E7蛋白(以及任选地Ll和I^)的治疗性疫苗，以使 其诱导强免疫应答，该免疫应答可以在早期或晚期阶段解决持久的HPV感染，包括HPV诱导 的宫颈癌。在一个优选实施方案中，所述组合疫苗易于大规模生产，并能够以低成本分发。
背景技术：
人乳头瘤病毒诱导的综合征每年世界范围内约有五十万新增宫颈癌登记病例(特别是在发展中国家中)，是 妇女死亡的第二大诱因。人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌的首要致病因子，在超过95%的此 类癌症中可发现HPV的DNA(I)。自1998年以来，预防和治疗的策略主要依赖于结构化筛选 程序来检测并消除侵袭前(pre-invasive)的疾病。不过，HPV检测的使用受到社会问题的 限制，目前的主要障碍是其高成本。因此，开发预防HPV感染的疫苗代表了预防宫颈癌的重 要机会，同时治疗性免疫将会在恶变前及恶性疾病的治疗中很有价值。HPV属于可感染扁平上皮的一个双链小DNA病毒大家族。(近来对乳头瘤病毒 的全面综述见 Howley PM 和 Lowy DIU2007)，在 Fields Virology 第 5 版中)，Knipe， D.M.和Howley主编，P.M. Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia PA 19106,USA, 2299-2354页。迄今为至，已经描述了超过100种基因型，其中至少35种类型感染生殖道。 尽管多数HPV类型产生良性病变，但一小部分基因型与扁平上皮内高度病变和宫颈癌强相 关。这一部分已被鉴定为“高风险”，估计HPV-16可解释约60%的宫颈癌，而HPV-18可解释 另外的 10% -20% ο 其他高风险类型包括 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 和 73 型。 低风险HPV (如HPV-6和HPV-11)导致良性生殖器疣(90 %的良性尖锐湿疣为HPV6或11阳 性)。可消除最常见高风险类型的16/18型二价疫苗也能够应对低风险类型。理想的疫苗 将通过使用来自不同类型的抗原和/或含有保守区的抗原来保护机体抵御其他HPV类型。HPV基因组编码八种蛋白。晚期Ll和L2基因编码衣壳蛋白；早期蛋白El和E2 负责病毒复制与转录，E4涉及病毒从被感染细胞中的释放。高风险型HPV病毒DNA在宿主 基因组中的整合导致失去El或E2介导的转录控制，并因此导致负责恶性转化过程的E6和 E7蛋白的过表达O)。来自高风险亚型的结构蛋白Ll代表了预防性疫苗的最佳靶标。另 一方面，E6和E7是显而易见的治疗性靶标。实际上有几种预防性HPV疫苗制剂基于来自HPV16和18型(在一些情况下还有 其他类型)的主要病毒衣壳蛋白Li，其作为单体，或是作为病毒状颗粒(VLP) (W094/00152、W094/20137.W093/02184 和 W094/05792)。VLP 可额外包含 L2 蛋白，例如 W093/00436 中所 述以L2为基础的疫苗。这些疫苗具有高免疫原性并且看来是安全的，但是其高成本使得无 法在风险人群中一般性普及，并且其HPV类型特异性代表了另一种局限性。因此，仍然需要 开发针对HPV的其他改良疫苗，它们应该是廉价的。此外，用抗原进行的疫苗接种主要诱导 抗体特异性应答，它对已产生的HPV感染及相关疾病益处甚微或者没有益处。治疗性疫苗的开发不仅依赖于中和抗体的产生，还主要依赖于特异性细胞免疫应 答的诱导，而这正是清除已产生感染的关键因素。因此，治疗性疫苗需要包括一些源自于 早期HPV蛋白而非晚期蛋白的抗原决定簇。高风险HPV类型的早期基因(E6和E7)编码 主要转化蛋白。这些基因能够使上皮细胞永生化，被认为在致癌过程的启动中起作用。这 些早期基因的蛋白产物干扰肿瘤抑制基因的正常功能。HPV E6能够与p53相互作用，导致 其机能障碍，从而损害其在DNA发生错误时阻断细胞周期的能力。E6还使端粒酶长度保持 在其临界点之上，保护细胞不发生凋亡。HPVE7与视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)结合，激活启 动细胞周期的基因，导致组织增殖。E6和E7蛋白代表了优良的靶标，已经描述了基于E6 的多种HPV治疗性疫苗的方法。近年来，已经描述了许多基于肽/蛋白或遗传免疫的策略 用于诱导HPV特异性CTL活性。关于针对HPV之疫苗开发进展的综述见参考文献(3)。已 使用已知主要促进细胞应答的DNA疫苗(编码HPV蛋白的质粒DNA)进行了尝试。尽管事 实上DNA疫苗在小鼠模型中工作良好，但大量临床试验却未能提供在人类中作用原理的证 据。与基于肽的方法相关的主要缺点包括MHC多态性问题以及诱导T细胞耐受而非T细 胞活化的风险。由于诱导了特异性T细胞耐受，用肿瘤特异性肽进行的疫苗接种已显示导 致肿瘤过度生长的增强。用更大的蛋白进行免疫可克服这些问题，但需要高效的体内表 达系统和/或安全的佐剂以引发高效的细胞免疫应答。涉及重组病毒载体疫苗的方法尚 在开发中(Poxvirus, Adenovirus, Alphavirus, Poliovirus e Herpes Virus)。例如在 US2007269409 (W02004044176)中对基于腺病毒的疫苗进行了描述，其编码HPV的E6或E7 蛋白。基于腺病毒的疫苗能够产生长效免疫，但是，HPV DNA在宿主基因组中的整合仍有可 能发生，并可能成为安全性方面的限制。鉴于上述不足，使用麻疹病毒作为载体来表达HPV 抗原代表了开发预防性组合HPV-麻疹疫苗以及作为治疗性HPV疫苗的创新策略。基于麻 疹病毒的免疫载体麻疹病毒(MV)是副粘病毒科(Paramyxoviridae)的一员。MV的非区段基因组具 有反信使极性，导致纯化的基因组RNA在体内或体外均不翻译，不具有感染性。已对非区段 (-)链RNA病毒的转录与复制及其作为病毒颗粒的装配进行了研究和报道。麻疹病毒的 转录与复制不牵涉感染细胞的核，而是发生在所述感染细胞的胞质中。麻疹病毒基因组包 括编码来自六个基因(命名为N、P、M、F、H和L)的六个主要结构蛋白以及来自P基因的另外 两个非结构蛋白的基因。MV是导致幼儿急性发热疾病的主要原因。据世界卫生组织(WHO) 估计，每年有一百万幼儿死于麻疹。这一高死亡主要发生在发展中国家，但近些年内工业化 国家比如美国也再次受到了麻疹流行的侵袭，主要是由于免疫计划坚持得不彻底(5)。目 前，正在使用几种减毒的活MV疫苗毒株(包括ktiwarz、Moraten和Edmonston-hgreb毒 株)，它们几乎都通过在非人细胞中多次传代而来自于最初的Edmonston菌株(6)。MV疫 苗被证明是迄今为止开发的最安全、最稳定及有效的人类疫苗之一。该疫苗在许多国家大 规模生产，并通过WHO的扩大免疫规划(Extended Program on Immunization,EPI)以低成本分发，在单次注射后诱导终身免疫G，7)，加强也是有效的。保护由抗体以及CD4和CD8T 细胞同时介导。已显示抗体和⑶8细胞的持久性高达疫苗接种后25年(7)。Martin Billeter及其同事建立了一种创新而有效的反向遗传学方法，从源自于 Edmonston毒株MV的克隆脱氧核糖核酸(cDNA)产生非区段性负链RNA病毒，如8和WO 97/06270中所述，组装麻疹病毒的反基因组ρ (+) MVEZ的方案示于
图1。首先，这些技术允 许定点诱变，使得能够对这些病毒生物学情况的多个方面获得重要的深入了解。同时，插入 了外源编码序列，从而a)允许通过标记基因的表达对病毒的体内复制进行定位，b)开发针 对麻疹及其他病原体的候选多价疫苗，和c)创造候选溶瘤细胞病毒。对于RNA病毒而言意 想不到的显著的重组体遗传稳定性以及可插入遗传材料的高负载能力(超过61Λ)都从实 验上支持了这些病毒的载体用途。已知的优点也有利地在考虑之内，比如所述载体与DNA 病毒相比的小基因组尺寸、减毒MV作为已明确证明具有高安全性及效力之疫苗的丰富临 床经验，以及每剂疫苗的低生产成本。重组麻疹病毒的核苷酸序列必须包含复制子，其带有的核苷酸总数为6的倍数。 “6倍数规则(rule of six) ”表述为这一事实，即存在于重组cDNA中的核苷酸总数最终为 六的倍数的核苷酸总数，该规则允许麻疹病毒的基因组RNA高效复制。将异源DNA克隆到MV载体的额外转录单元(Additional Transcription Unit, ATU)中，所述ATU插入到对应于麻疹病毒反基因组RNA的cDNA中。所述ATU的定位可以在 所述cDNA上变化但其总是定位于将使其从麻疹病毒表达梯度中受益的位点中。因此，适 于克隆异源DNA序列的ATU或任何插入位点可散布在cDNA中，插入位点(尤其是ATU)的 优选实施方案存在于序列的N端部分，尤其是在麻疹病毒L基因上游的区域中，有利地在所 述病毒M基因的上游，更优选所述病毒N基因的上游。重组麻疹病毒的有利免疫学特性可以展示于动物模型中，所述模型选自对麻疹病 毒易感的动物，其中测定针对异源抗原和/或针对麻疹病毒的体液和/或细胞免疫应答。在 此类适于用作表征免疫应答之模型的动物中，本领域技术人员特别地可利用表达⑶46特 异MV受体的转基因小鼠，或猴子。该技术允许生产适合于用作组合MV疫苗的含有并稳定表达外源基因的拯救病 毒。作为构思证据，MV已被用于表达源自SIV、HIV、乙型肝炎、腮腺炎、西尼罗河(WN)病毒 和SARSCoV(9-U)的抗原。在多数此类研究中，表达异源抗原的重组MV看来在转基因小鼠 模型中诱导了特异性体液中和抗体(13)，并显示出诱导针对某些蛋白的细胞免疫应答(9， 11)。目前，基于MV的任何候选重组疫苗的临床试验仅处于计划阶段，但实验结果支持这一 假说MV组合疫苗应该在引发针对其它病原体的长持久性免疫保护方面与针对载体病毒 本身一样有效。实际上，就表达WNV gpE的MV来说，已记载在猴体内有长达六个月的完全 保护(14)，并且表达登革热抗原的MV诱导了中和抗体的长期产生(15)。此外，在转基因小 鼠和恒河猴中，重组拯救MV能够在存在对MV的已有免疫时诱导针对异源抗原的特异性抗 体应答(9，11，16)。活的拯救重组MV免疫易于在大多数国家大规模生产，并能够以低成本分发。就安 全性而言，MV复制仅在细胞质中发生，排除了整合到宿主DNA中的可能。这些特性使得重组 拯救MV疫苗成为用于HPV抗原多价疫苗接种载体的富有吸引力的候选。然而，成年人(甚 至已经MV免疫过的个体)也可受益于MV重组免疫，因为本发明重组形式MV病毒的再施用可导致抗MV抗体的加强(11)。迄今为至，尚未开发出方法来产生能诱导MV免疫与HPV免疫之组合的疫苗。本发明特别涉及重组麻疹病毒的制备，所述病毒带有编码源自HPV之抗原的异源 核酸。发明详述本发明的目的在于从能够包含稳定整合核苷酸序列的重组麻疹载体生产麻 疹-HPV组合疫苗，所述核苷酸序列编码来自不同HPV类型的Li、L2、E6和/或E7蛋白。本发明包括重组MV-HPV病毒的拯救(rescue)，所述病毒能够在易感的转基因小 鼠、猴和人宿主中感染、复制并表达L1、L2、E6或E7蛋白。 此外，本发明包括多价重组麻疹-HPV载体的构建，其中两种不同抗原被同时克隆 并表达在同一载体内，赋予针对这两者的免疫。另外，本发明涉及不同重组麻疹-HPV病毒的组合，其各自带有并表达来自于不同 HPV类型的基因，以在宿主中引发针对不同HPV类型的免疫应答。此外，本发明包括含有此种重组病毒的疫苗的生产方法。此外，本发明还涉及白介素或白介素-2作为佐剂用于提高组合疫苗的应答的用 途。最后，本发明涉及疫苗，其能够在人中诱导针对HPV和麻疹病毒的强效且终身的 免疫应答，以预防感染和/或治疗与感染相关的疾病。表 权利要求
1.能够引发针对麻疹和HPV两者的免疫应答并提供针对它们的保护的麻疹-HPV组合 疫苗，其包含表达HPV抗原的重组麻疹疫苗病毒。
2.根据权利要求1的麻疹-HPV组合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗病毒表达一种或不同 种HPV抗原的至少一种Ll蛋白。
3.根据权利要求2的麻疹-HPV组合疫苗，其中所述Ll蛋白选自HPV16-L1、HPV18-L1 以及 HPV6-L1 和 HPVl I-Ll。
4.根据权利要求1的麻疹-HPV组合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗病毒表达一种或不同 种HPV抗原的至少一种L2蛋白。
5.根据权利要求4的麻疹-HPV组合疫苗，其中所述L2蛋白选自HPV16-L2、HPV18-L2、 HPV6-L2 和 HPVl1-L2。
6.根据权利要求1的麻疹-HPV组合疫苗，其中所述重组麻疹疫苗病毒表达一种或不同 种HPV抗原的至少一种E6或E7蛋白。
7.根据权利要求6的麻疹-HPV组合疫苗，其中所述E6蛋白选自HPV16-E6、HPV18-E6 和 HPV6-E6。
8.根据权利要求6的麻疹-HPV组合疫苗，其中所述E7蛋白选自HPV16-E7、HPV18-E7 和 HPV6-E7。
9.根据前述权利要求中任一项的麻疹HPV组合疫苗，其中所述HPV抗原由哺乳动物表 达系统产生。
10.根据权利要求1的麻疹-HPV组合疫苗，其中所述哺乳动物表达系统为^3T-3-46 细胞。
11.载体，其包含不同HPV类型及麻疹之抗原的核苷酸序列。
12.根据权利要求11的载体，其中所述载体包含选自图fe-51中所述的核苷酸序列。
13.根据权利要求11的载体，其中所述载体还包含选自图如和4b中所述的核苷酸序列。
14.根据权利要求11的载体，其中所述抗原选自HPV-16、HPV-18、HPV-6和HPV-Il的 Ll或L2或E6或E7蛋白。
15.根据权利要求11的载体，其中Ll的序列被克隆到麻疹病毒序列的P和M蛋白之间 或H和L蛋白之间。
16.含有权利要求11所述载体的宿主。
17.根据权利要求20的宿主，其选自大肠杆菌或哺乳动物细胞系。
18.根据权利要求1的组合疫苗，其中重组麻疹病毒来源于衍生自EdmostonZagreb的 疫苗株。
19.根据前述权利要求中任一项的组合疫苗，其包含重组麻疹病毒，该重组麻疹病毒中 插入了编码完整HPV16-L1、HPV18-L1以及HPV6-L1和HPV11-L1的核酸序列。
20.根据前述权利要求中任一项的组合疫苗，其包含重组麻疹病毒，该重组麻疹病毒中 插入了编码 HPV16-L2、HPV18-L2、HPV6-L2 和 HPVl 1-L2 的核酸序列。
21.根据前述权利要求中任一项的组合疫苗，其包含重组麻疹病毒，该重组麻疹病毒中 插入了编码HPV16-E6、HPV18-E6和HPV6-E6的核酸序列。
22.根据前述权利要求中任一项的组合疫苗，其包含重组麻疹病毒，该重组麻疹病毒中插入了编码HPV16-E7、HPV18-E7和HPV6-E7的核酸序列。
23.根据前述权利要求中任一项的组合疫苗，其包含重组麻疹病毒，该重组麻疹病毒 中插入 了编码 HPV16-L1 或 HPV18-L1 或 HPV6-L1 或 HPVl 1-L1 或 HPV16-L2 或 HPV18-L2 或 HPV6-L2 或 HPVl 1-L2 或 HPV16-E6 或 HPV18-E6 或 HPV6-E6 或 HPV16-E7 或 HPV18-E7 或 HPV6-E7或其任意组合的核酸序列。
24.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述重组麻疹病毒中插入了同时编码两 种或三种上述HPV抗原的至少两种或三种核酸序列。
25.根据权利要求1的疫苗，其中所述重组麻疹病毒包含如图fe至51所述的编码序列。
26.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述重组麻疹病毒除编码HPV抗原外，还 编码具有佐剂特性的蛋白。
27.根据权利要求25的疫苗，其中所述佐剂为白介素，优选为白介素2。
28.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述疫苗基本由至少一种所述重组麻 疹-HPV病毒或两种至若干种这些病毒的混合物组成。
29.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述重组麻疹HPV病毒或者两种至若干 种这些病毒的混合物中不含有缺损干扰颗粒(DI)。
30.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中偶然产生的DI颗粒已通过空斑纯化消除。
31.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中偶然产生的DI颗粒已通过终点稀释法消除。
32.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中偶然产生的DI颗粒已通过物理方法消除。
33.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述物理方法为离心。
34.根据前述权利要求的疫苗，其作为组合疫苗的组分，其中其他组分为风疹、腮腺炎、 水痘或另一减毒活疫苗病毒，所述病毒为为天然减毒的或重组的，单独的或组合的。
35.根据前述权利要求的疫苗，所述疫苗与用于肠胃外给药的合适稳定剂和山梨醇混合。
36.根据前述权利要求的疫苗，所述疫苗与适于鼻内给药的合适稳定剂和/或佐剂混合。
37.根据前述权利要求的疫苗，所述疫苗与适于吸入给药的合适稳定剂和/或佐剂混合。
38.根据前述权利要求的疫苗，所述疫苗与适于口服给药的合适稳定剂和/或佐剂混合。
39.根据前述权利要求的疫苗，所述疫苗与适于任何栓剂制剂的合适稳定剂和/或佐 剂混合。
40.根据前述权利要求中任一项的疫苗，所述疫苗与适于经皮给药的合适稳定剂和/ 或佐剂混合。
41.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其包含重组麻疹病毒，所述重组麻疹病毒带有 实施例中所报告具体序列所述的编码序列。
全文摘要
本发明涉及针对麻疹和人乳头瘤病毒(HPV)的组合疫苗。特别地，本发明涉及含有异源核酸的重组麻疹病毒载体，所述异源核酸编码一种或多种源自于HPV的抗原，优选HPV 16型(以及任选地18型、6型和11型)的主要衣壳抗原L1、次要衣壳抗原L2、早期基因E6及早期基因E7癌蛋白。在第一个实施方案中，产生表达HPV抗原(优选L1和/或L2)的预防性疫苗，以使其在哺乳动物(优选人)中可诱导强的长效免疫应答，以提供针对HPV和MV感染的保护。在另一个实施方案中，产生表达E6和E7蛋白(以及任选地L1和L2)的治疗性疫苗，以使其诱导强免疫应答，该免疫应答可以在早期或晚期阶段解决持久的HPV感染，包括HPV诱导的宫颈癌。在一个优选实施方案中，所述组合疫苗易于大规模生产，并能够以低成本分发。
文档编号A61K39/12GK102099053SQ200980119406
公开日2011年6月15日 申请日期2009年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者弗兰切斯卡·斯库代里, 朱塞平娜·坎塔雷拉, 桑吉夫·K·门迪雷塔, 维维亚娜·詹尼诺, 赖因哈德·格吕克, 阿加塔·法齐奥, 马丁·比耶泰 申请人:卡迪拉保健有限公司