专利名称：一种高效增殖丙肝病毒体的方法及其组份的制作方法
发明所属领域本发明属于分子生物学领域，涉及一种高效增殖丙肝病毒体的方法及其系统组份。具体地说，本发明涉及一种利用重组痘病毒在体外细胞中高效培养增殖丙肝病毒体的方法，该方法克服了传统的丙肝病毒不能在培养的细胞上扩增和难扩增的限制，可大量生产用于体外研究和疫苗防治等目的丙肝病毒体，本发明还涉及一种体外增殖丙肝病毒体所需的系统组份。
从感染病人分离出的丙肝病毒能够感染人类的原始肝细胞，外周血单核细胞，以及某些细胞系如人类T淋巴细胞系HPBMa10-2，B淋巴细胞系Daudi和肝细胞系。然而在这些细胞培养系统中，丙肝病毒的复制通常是瞬时和低效的。这些缺点使得这些细胞培养系统不适合于扩增丙肝病毒。另一种扩增丙肝病毒的方法是用体外转录丙肝病毒的正链RNA转染人类肝细胞瘤细胞系Huh-7或使丙肝病毒突变体在培养细胞中增殖。许多研究小组报道用这种方法未能制备出可检测到的丙肝病毒或检测到的丙肝病毒滴度小于107。尽管中国专利申请号01124001.6报道说从转染的细胞中制得了感染性的病毒颗粒，但这种方法由于转染全长丙肝病毒RNA到Huh-7细胞的效率低，丙肝病毒RNA易在细胞中降解，以及在丙肝病毒全长RNA上加入IRES-EGFP序列后，序列延长，降低其RNA复制效率，同时即使有少量的全长RNA复制，因其长度超过了病毒颗粒包装长度的范围，难有高滴度的病毒产生出来(≤105-7)，实验重复性低.
本发明的另一个目的是提供在培养细胞中高效增殖丙肝病毒体所需的系统组份。
本发明的再一个目的是提供一种在离体细胞中扩增的丙肝病毒体。
在本发明的一个方面，提供了一种高效增殖丙肝病毒体的方法，它包括的步骤是A制备下列组份为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；c能启动和促进上述载体表达的痘病毒；d宿主细胞；或为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；b能表达丙肝病毒结构蛋白的载体；c能同时启动和促进上述载体表达的痘病毒；d宿主细胞；其中，载体a由下列步骤制备①扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到载体上；②在载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的NS3和NS5A进行3个氨基酸突变，得到载体a，
载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体上；B将步骤A中的载体a或者载体a和b先转染宿主细胞d，再用痘病毒c感染已转染表达载体的宿主细胞，获得重组宿主细胞；C培养重组宿主细胞，并收集细胞表达产物。
在本发明中，能启动a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体的启动子选自T7，或SP6或T3等启动子，这些启动子能被含有T7噬菌体RNA聚合酶基因或其他启动子基因的重组痘病毒启动，并有效地表达所携带的基因。
在本发明的一个优选方案中，提供了一种高效增殖丙肝病毒体的方法，它包括的步骤是A制备下列组份为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体，且丙肝病毒全长基因组cDNA位于T7启动子和T7终止子之间，序列长度小于9660核苷酸；c含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主细胞；或为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；且丙肝病毒全长基因组cDNA位于T7启动子和T7终止子之间，序列长度小于9660核苷酸；b能表达丙肝病毒结构蛋白的载体；且丙肝结构蛋白基因组cDNA位于痘病毒早期或后期启动子和终止子之间；c含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主细胞；其中，载体a由下列步骤制备①扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到pFK-1载体上；②在载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的进行E1202G，T1208I，S2197P的三次点突变，得到载体a，载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体pSC59上，得到载体b；B将步骤A中的载体a或者载体a和b先转染宿主细胞d，再用痘病毒c感染已转染表达载体的宿主细胞，获得重组宿主细胞；C培养重组宿主细胞，并收集细胞表达产物。
在本发明的一个优选方案中，痘病毒敏感型的宿主细胞选用HeLa，或BSC-1，或CV-1，或MRC-5等哺乳动物细胞，更优选HeLa细胞。
在本发明的一个优选方案中，含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒选用vTF7-3病毒，ATCC NO.VR-2153，更优选采用D13L基因缺陷型且含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒，或在感染细胞的培养基中加入利福平阻止痘病毒装配或复制，但利福平的加入不影响痘病毒基本功能的体现。细胞培养上清液的丙肝病毒纯化可通过0.2μm的滤器和蔗糖梯度离心。
在本发明中，a能表达丙肝病毒全长基因的重组载体由下列方法制备根据Aizak等报道的HCV基因组序列，通过偶联逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从丙肝病人肝脏病毒基因组RNA中产生含有HCV全长基因的cDNA，并根据丙肝病毒1a或丙肝病毒1b的保守序列设计6个PCR引物，根据病人的来源如在美国或其他西方国家可选用1b株引物，在中国或日本选用1a引物，首先用SEQ ID NO1，3’UTR末端序列引物和SEQ ID NO5，NS3的序列合成2组cDNA.用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2合成1a的3’UTR核苷酸序列或SEQ ID NO1和SEQ ID NO3合成1b株的3’UTR核苷酸序列，然后纯化得DNA。用此小片段和SEQ ID NO4作引物合成丙肝病毒从NS3到3’UTR的片断，同时用SEQ ID NO5和SEQ ID NO6合成丙肝病毒5’UTR到NS3的片断，此两个DNA片断有部分重叠，再用于合成全长HCV DNA的模板用SEQ ID NO1和SEQ ID NO6做Long-PCR扩增全长HCV DNA，获得丙肝病毒全长核苷酸序列。由于在SEQ ID NO6上加有HindIII和SEQ ID NO1上加有SpeI位点，全长HCVDNA可克隆到pFK-1载体上的HindIII和SpeI的酶切位点上。以此HCV DNA为模板做3次定点突变成E1202G，T1280I，及S2197P。改造后的载体DNA为pHCV-2.pHCV-2经ScaI酶切后可直接转染细胞提供HCV RNA基因组.
在本发明中，b能表达丙肝病毒结构蛋白的重组载体由下列方法制备在上述制备pHCV-2基础上获得的，获得丙肝病毒全长核苷酸序列经SpeI酶切后克隆到pSC59载体上，命名为pHCV-1.此载体带来痘病毒的启动子和终止子，用于转染细胞，大量提供高效表达HCV结构的酶蛋白。
在本发明中，将载体转染入宿主细胞可采用多种常用的方法，如基因枪注射法，脂质体转染法等。在一个具体的实施例中，采用Lipofect Amine脂质体转染法，用等量的pHCV-2，CCTCCM201013和pHCV-1，CCTCC M201012共转染HeLa细胞系，培养液是含2.5％胎牛血清的DMEM。经过4个小时的转染后，除去转染介质，并用含2.5％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培养基中含有107pfu vTF7-1，ATCC No.VR-2153。病毒感染2小时后，除去病毒上清液，加入细胞培养基，细胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中进行培养。经72小时的温育后，收集细胞培养上清液即为含有丙肝病毒体的液体。在另一个具体的实施例中采用Lipofect Amine转染法，将pHCV-1，CCTCC M201013表达载体转染CV-1细胞，培养液是含1.0％胎牛血清的OPTI-MEM。经过6个小时的转染后，除去转染介质，并用含1.0％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培养基中含有105pfu vTF7-3，并加入利福平，病毒感染2小时后，除去病毒上清液，加入含有利福平的细胞培养基，细胞在含1.5％胎牛血清的DMEM中进行培养。经48小时的温育后，收集细胞培养上清液即为含有丙肝病毒体的液体。在本发明还提供了一种扩增丙肝病毒的最佳方法，该方法包括的步骤是A制备下列组份为a CCTCC M201013c ATCC NO VR-2153d HeLa或为a CC TCC M201013b CCTCC M201012c ATCC NO VR-2153d HeLa其中，载体a由下列步骤制备①从病人血清中用6个引物扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到pFK-1载体上，形成pFK-1 HCV DNA；②在pFK-1 HCV DNA载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的NS3和NS5A进行3个氨基酸突变，依次为NS3区的第1202位点Glu变为Gly，第1280位点的Thr变为Ile，NS5A区的第2197位点Ser变为Pro，得到pHCV-2，CCTCC M201013；载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体pSC59载体上，形成pHCV-1，CCTCC M201012；B将步骤A中的载体a或者载体a和b先转染宿主细胞d，再用痘病毒c感染已转染表达载体的宿主细胞，获得重组宿主细胞；C培养重组宿主细胞，并收集细胞表达产物。
在本发明中还提出了根据本发明的方法制备而获得的丙肝病毒体.
采用本方法获得的病毒体是高浓度的，从实验中测定的数据与中国专利申请号01124001.6报道的数据相比高10-1000倍，而且不通过信号放大，在电镜下可见病毒粒子存在。
在本发明的另外一个方面，本发明还提供了一种高效表达丙肝病毒体的系统，该表达系统含有下列组份a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；c能启动和促进上述载体表达的痘病毒；d宿主细胞；或为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；b能表达丙肝病毒结构蛋白的载体；c能同时启动和促进上述载体表达的痘病毒；d宿主细胞；其中，载体a由下列步骤制备①扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到载体上；②在载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的NS3和NS5A进行3个氨基酸突变，得到载体a，载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体上；在本发明中，能启动a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体的启动子选自T7，或SP6或T3等启动子，这些启动子能被含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒启动，并有效地表达所携带基因。
在本发明的一个优选方案中，本发明提供了一种更佳高效的增殖丙肝病毒体的表达系统，该表达系统包括的组份为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体，且丙肝病毒全长基因组cDNA位于T7启动子和T7终止子之间，序列长度小于9660核苷酸；c含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主细胞；或为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；且丙肝病毒全长基因组cDNA位于T7启动子和T7终止子之间，序列长度小于9660核苷酸；b能表达丙肝病毒结构蛋白的载体；且丙肝结构蛋白基因组cDNA位于痘病毒早期或后期启动子和终止子之间；c含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主细胞；其中，载体a由下列步骤制备①扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到pFK-1载体上；②在载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的进行E1202G，T1208I，S2197P的三次点突变，得到载体a，载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体pSC59上，得到载体b；在本发明的一个优选方案中，痘病毒敏感型的宿主细胞选用HeLa，或BSC-1，或CV-1，或MRC-5等哺乳动物细胞，更优选HeLa细胞。
在本发明的一个优选方案中，含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒选用VTF7-3病毒，ATCC NO.VR-2153，更优选采用D13L基因缺陷型且含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒，或在感染细胞的培养基中加入利福平阻止痘病毒装配或复制，但利福平的加入并不影响其基本的功能发挥。”基本的功能”是指能启动和促进上述转染入细胞的载体的表达。
在本发明的一个更优选方案中，体外表达丙肝病毒体的系统组份为a CCTCC M201013c ATCC NO VR-2153d HeLa或为a CCTCC M201013b CCTCC M201012c ATCC NO VR-2153d HeLa其中，载体a由下列步骤制备①从病人血清中用6个引物扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到pFK-1载体上，形成pFK-1 HCV DNA；②在pFK-1 HCV DNA载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的NS3和NS5A进行3个氨基酸突变，依次为NS3区的第1202位点Glu变为Gly，第1280位点的Thr变为Ile，NS5A区的第2197位点Ser变为Pro，得到pHCV-2，CCTCC M201013；
载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体pSC59载体上，形成pHCV-1，CCTCC M201012；本发明所指的丙肝病毒体包括丙肝病毒，丙肝病毒突变体，和丙肝病毒减毒株。
本发明所指的丙肝病毒全长基因组是指含有组装丙肝病毒所必需的核酸序列的多聚核苷酸序列，包括DNA，和/或RNA，和/或cDNA形式。基因组中可以有一个或多个基因序列的缺失，但不影响其免疫原性或其感染性。在本发明的一个优选方案中，本发明对丙肝病毒NS3和NS5A基因区进行了缺失和/或突变，获得了多个丙肝病毒全长基因的缺失或突变的表达载体，这样可提高病毒复制效率，克服丙肝病毒不能在细胞中扩增和扩增效率低的问题。
含有T7噬菌体RNA聚合酶的重组痘病毒可通过常规分子生物学方法制备，或向保藏机够买，如向ATCC够买，ATCC NO VR-2153。或参照Fuerst等描述的一种制备含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的痘病毒重组体的方法制备。在这种重组体中，同源重组将拥有痘病毒启动子的T7 RNA聚合酶插在胸腺嘧啶脱氧核苷激酶编码区。即可获得vTF7-3。
在本发明的一个优选方案中，提出了一种产生D13L基因缺陷型重组痘病毒vT7D13L。第一步是构建一种质粒pGPT-D13L，该质粒可以在同源重组中用于以细菌的gpt基因替代痘病毒必需基因例如D13L的编码区。病毒必需基因是指可以对维持痘病毒生命力所必需的病毒蛋白进行编码的基因。质粒含有在痘病毒前/后启动子和痘病毒终止子之间克隆的细菌gpt基因所得的gpt转录单元的末端有500bp-1kbp两个序列，这两个序列与痘病毒必需基因的ORF上游旁侧序列和下游末端序列同源。在痘病毒vTF7-3感染之后，质粒可以用于感染适当的细胞如非洲绿猴肾细胞CV-1。在感染48小时后，收集细胞，进行裂解，释放出痘病毒体。为了选择重组体，用细胞裂解产物和野生型痘病毒共同感染CV-1细胞、在MPA、黄嘌呤和次黄嘌呤的存在下，gpt-阳性的重组体将形成空斑，因为在较高的MOI下，几乎所有的细胞都会庇护野生型痘病毒，而这些野生型痘病毒为缺陷病毒提供了反式的基本蛋白，在痘病毒启动子的控制下，用含有必需基因的质粒pD13L感染那些被vTF7-3瞬间转染了的非洲绿猴肾细胞CV-1，可以得纯的缺陷型痘病毒的浆液。该启动子与前/后启动子不应同源，前/后启动子是用gpt表达，以降低在缺陷病毒基因组和含有必需基因的质粒之间的重组可能性。
检测重组丙肝病毒体的存在和测定丙肝病毒制品的感染滴度使用现在通行的方法。其中的方法之一是采用PCR方法。在本发明中提供了一种具体的RT-PCR方法用含1％胎牛血清的Opti-DMEM将收集的细胞培养物上清液10倍稀释。然后在一个24孔板中每孔加入1ml的稀释后的上清液。24孔板每孔在前一天接种上106个Huh7细胞。经24小时培养，除去接种物，并用10％胎牛血清的1ml新鲜DMEM取代之。培养6天之后，收集细胞，并从细胞中提取全部的RNA。用RT-PCR放大丙肝病毒5’UTR，检测丙肝病毒的负链RNA。PCR所用的引物为SEQ ID NO87，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，通过PCR扩增，DNA电泳，紫外光下检测电泳带的存在。
在本发明的另一个测定丙肝病毒制品的感染滴度的方法中，采用现在临床常用的检测病人血液的荧光检测试剂盒，根据试剂盒中的方法进行操作，并根据阳性/阴性标准判断结果，结果表明重组丙肝病毒的基因考贝数为每毫升8.0×108-4×109。
本发明提供了另一个检测丙肝病毒的常用方法。对收集的上清液低速离心去沉淀，再用PEG6000沉淀，固定染色，电镜观察；或收集细胞，固定染色，电镜观察。
本发明利用了痘病毒的独特性。这种病毒利用自身的酶在宿主细胞的细胞质中进行DNA的复制和mRNA的合成时，细胞质中存在的质粒也将被复制，而且编码区如果与痘病毒启动子相连，也将被转录成mRNA。由于这些性质，痘病毒被广泛地用来表达外源蛋白。本发明所提供的方法利用了痘病毒的复制机制来生产丙肝病毒体。在制备丙肝病毒体时，为了清除痘病毒颗粒，本发明还提供一种缺陷型重组体痘病毒，并用于扩增丙肝病毒体，该重组体中删除了痘病毒基因组中的D13L基因。D13L是编码65kDa蛋白的基因，而该蛋白是痘病毒的组份，对于形成病毒是必不可少的。尽管Falkner等最近公开了一种利用细胞系，稳定地表达一种痘病毒基本蛋白，生成有缺陷的重组痘病毒的方法。但它不能用于制备D13L缺陷型重组痘病毒。不能利用完整细胞系选择和制备D13L缺陷型痘病毒重组体其中的一个主要问题是，痘病毒所感染的细胞会稳定地表达D13L蛋白，而这将抑制宿主细胞蛋白的合成，从而切断D13L蛋白的供应。由于D13L蛋白是痘病毒颗粒的基本成份，缺少D13L将会阻止痘病毒的形成。
本发明提供了一种在体外细胞中增殖丙肝病毒的系统，该系统利用痘病毒表达机制来制备丙肝病毒体。在被含有T7 RNA聚合酶重组痘病毒感染的细胞中，痘病毒DNA聚合酶可以复制细胞质中的载体a和b/或a，痘病毒RNA聚合酶能转录与痘病毒启动子相连的病毒DNA。产生的mRNA能被宿主细胞翻译系统所翻译而合成病毒蛋白。病毒基因组RNA则由T7RNA聚合酶转录质粒DNA而获得。因而，如果细胞被含有编码RNA病毒蛋白的正链RNA的转录区域和在合适启动子下游的正链RNA的质粒转染，那么当用重组痘病毒再进行感染时，就会在细胞质中大量地合成病毒蛋白和病毒基因组RNA。然后所得的病毒蛋白和基因组RNA将组装成病毒体。这些病毒体在生物学上和形态学上都与原始毒种类似。
丙肝病毒的基因组RNA含有一个内部核糖体结合位点(IRES)，对于丙肝病毒，用一个含有在噬菌体启动子和终止子之间的全长基因组RNA的cDNA拷贝的质粒来转染细胞对制备病毒就足够了。在这个例子里，病毒蛋白将从基因组RNA中被翻译出来，接着包装病毒RNA形成病毒粒子。然而，和另一个含有在痘病毒后启动子或前后启动子下游的编码病毒蛋白cDNA的质粒共转染细胞来提供更多的病毒蛋白将会把病毒粒子的产量提高到原来的10到100倍。
使用痘病毒复制机制制备丙肝病病毒的优点之一是它可以绕过限制病毒繁殖的障碍，当用丙肝病毒自身的复制机制进行病毒复制时存在这种障碍。利用痘病毒高效复制的机制，几天后就可以得到高滴度的丙肝病毒。另一个优点是这种系统可用广泛用于制备一系列的RNA病毒，如流感病毒和慢病毒载体的制备。第三个优点是，当系统用于制备RNA病毒载体时，它可以避免产生复制型活病毒。第四个优点是，本系统是高效的，与传统方法相比提高病毒滴度10-1000倍。
引物是根据1a和1b的保守序列中设计而获得，由美国genebase公司合成从急性丙肝病人肝组织(100mg)或100μl血清中用TrL20L System(GIBCO/BRL)提取RNA，用100μl的10mM DDT加上5％RNasin(Promega)悬浮。10μl的样品保存在-80℃用于每次RT-PCR。
cDNA制备RNA在65℃中变性2分钟，在20μl的反应液中用Superscr pt II reversetranscriptase(GIBCO/BRL)，通过SEQ ID NO1或SEQ ID NO5合成cDNA。反应在42℃进行1小时，然后用RNase H和RNase T1(GIBCO/BRL)消化20分钟，1/10的cDNA产物直接用于以下的PCR扩增。
PCR扩增HCV 3’UTR1a株的3’UTR是通过两对引物而扩增的。1a株用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。在50μl反应液中(含有1倍的PCR buffer，250μm dNTP(Pharmacia)，20pmol引物，1μl(5unit)Taqman多聚酶(Stategene)，2μl cDNA产物，扩增条件是94℃，2分钟，变性，然后是35个循环PCR扩增，每次循环包括94℃ 1分钟，60℃退火30秒钟，68℃30秒钟合成，最后68℃7分钟扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳分离相应产物然后用gel purification Kit(胶纯化试剂盒)(Qiagene)纯化DNA。
用Long-PCR扩增HCV cDNA片断及全长HCV DNA1)复盖NS3到3’UTR区域的HCV DNA的合成及扩增是用相应的cDNA产物及通过3’UTRDNA小片段及SEQ ID NO4而合成的。3’UTR cDNA经94℃ 5分钟变性后直接置入4℃，用于以下PCR反应，PCR合成是通过长模板延长系统(Boehringer Mannheim)合成的。缓冲液和相应的试剂及反应条件均由生产厂提供，其中包括2μl cDNA模板，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳分离然后用gel purification Kit(胶纯化试剂盒)(Qiagene)纯化。
2)复盖5’UTR到NS3区域的DNA片断的合成和扩增是以相应的cDNA产物做模板通过SEQ ID NO6和SEQ ID NO5作物用长模板延长系统合成，扩增条件及DNA纯化和上述相同。
3)合成全长HCV DNA用纯化过的5’UTR-NS3及NS3-3’UTR为模板通过SEQ ID NO5和SEQ ID NO6作引物合成和扩增HCV全长DNA，试剂，条件均按长模板延长系统(Boehinger Mannheim)提供，因SEQ ID NO6含有T7启动子序列，由此所获全长HCV基因的5’端带有T7 RNA酶启动子。
克隆HCV全长DNA经HindIII和Spe I酶切后克隆到pFK-1载体HindIII和SpeI位点上。pFK-1由pBR322衍生而来，经StyI-EcoRI切除后，pBR322的StyI-EcoRI片断，被多克隆片断HindIII-Not I-Spe I位点所代替而得到pFK-1 HCV DNA。
点突变为保证HCV能够在敏感Huh-7细胞中高效复制，转录，表达，我们应用点突变技术在NS3和NS5A基因上进行3个特异氨基酸突变。所有突变点的编号均按EmBL databaseaccession number AJ238799为参考。特异突变点为NS3基因的1202位点的Glu变为Gly，NS3基因的1280位点的Thr变为Ile，以及NS5A的2197位点的Ser变为Proline。具体操作如下，分别设计合成3对24核苷酸的寡链(突变点在寡链中间)，每对寡链为互补序列。点突变通过mutagenesis kit(突变试剂盒)(Stategene)来完成。实验条件和试剂均由厂家提供，得到克隆后经检测序列证实点突变后在此基础上进行第二次点突变，依次进行，顺序如下pFK HCV→pFK HCV E1202G→pFK HCV E1202G T1280I→pFK HCV E1202G T1280IS2197P(名称为pHCV-2a)。将pHCV-2a重组载体转染HB101细菌，用含氨苄的LB培养基选择细菌克隆，扩大培养，获取大量载体。含有丙肝病毒全长基因的pHCV-2a重组载体于2001年4月19日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M201013a。pHCV-2用于复制HCV全长RNA。实施例②能表达丙肝病毒全长基因组另一载体的制备引物是根据1a和1b的保守序列中设计而获得，由美国genebase公司合成从急性丙肝病人肝组织(100mg)或100μl血清中用TrL20L System(GIBCO/BRL)提取RNA，用100μl的10mM DDT加上5％RNasin(Promega)悬浮。10μl的样品保存在-80℃用于每次RT-PCR。
cDNA制备RNA在65℃中变性2分钟，在20μl的反应液中用Superscr ptII reversetranscriptase(GIBCO/BRL)，通过SEQ ID NO1或SEQ ID NO5合成cDNA。反应在42℃进行1小时，然后用RNase H和RNase T1(GIBCO/BRL)消化20分钟，1/10的cDNA产物直接用于以下的PCR扩增。
PCR扩增HCV 3’UTR1a株的3’UTR是通过两对引物而扩增的。1b株用SEQ ID NO1和SEQ ID NO3。在50μl反应液中(含有1倍的PCR buffer，250μm dNTP(Pharmacia)，20 pmol引物，1μl(5 unit)Taqman多聚酶(Stategene)，2μl cDNA产物，扩增条件是94℃，2分钟，变性，然后是35个循环PCR扩增，每次循环包括94℃ 1分钟，60℃退火30秒钟，68℃30秒钟合成，最后68℃7分钟扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳分离相应产物然后用gel purification Kit(胶纯化试剂盒)(Qiagene)纯化DNA。
用Long-PCR扩增HCV cDNA片断及全长HCV DNA4)复盖NS3到3’UTR区域的HCV DNA的合成及扩增是用相应的cDNA产物及通过3’UTRDNA小片段及SEQ ID NO4而合成的。3’UTR cDNA经94℃ 5分钟变性后直接置入4℃，用于以下PCR反应，PCR合成是通过长模板延长系统(Boehringer Mannheim)合成的。缓冲液和相应的试剂及反应条件均由生产厂提供，其中包括2μl cDNA模板，PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳分离然后用gel purification Kit(胶纯化试剂盒)(Qiagene)纯化。
5)复盖5’UTR到NS3区域的DNA片断的合成和扩增是以相应的cDNA产物做模板通过SEQ ID NO6和SEQ ID NO5作物用长模板延长系统合成，扩增条件及DNA纯化和上述相同。
6)合成全长HCV DNA用纯化过的5’UTR-NS3及NS3-3’UTR为模板通过SEQ ID NO5和SEQ ID NO6作引物合成和扩增HCV全长DNA，试剂，条件均按长模板延长系统(Boehinger Mannheim)提供，因SEQ ID NO6含有T7启动子序列，由此所获全长HCV基因的5’端带有T7 RNA酶启动子。
克隆HCV全长DNA经HindIII和SpeI酶切后克隆到pFK-1载体HindIII和SpeI位点上。pFK-1由pBR322衍生而来，经StyI-EcoRI切除后，pBR322的StyI-EcoRI片断，被多克隆片断HindIII-NotI-SpeI位点所代替而得到pFK-1 HCV DNA。
点突变为保证HCV能够在敏感Huh-7细胞中高效复制，转录，表达，我们应用点突变技术在NS3和NSSA基因上进行3个特异氨基酸突变。所有突变点的编号均按EmBL databaseaccession number AJ238799为参考。特异突变点为NS3基因的1202位点的Glu变为Gly，NS3基因的1280位点的Thr变为Ile，以及NS5A的2197位点的Ser变为Proline。具体操作如下，分别设计合成3对24核苷酸的寡链(突变点在寡链中间)，每对寡链为互补序列。点突变通过mutagenesis kit(突变试剂盒)(Stategene)来完成。实验条件和试剂均由厂家提供，得到克隆后经检测序列证实点突变后在此基础上进行第二次点突变，依次进行，顺序如下pFK HCV→pFK HCV E1202G→pFK HCV E1202G T1280I→pFK HCV E1202G T1280IS2197P(名称为pHCV-2b)。将pHCV-2b重组载体转染HB101细菌，用含氨苄的LB培养基选择细菌克隆，扩大培养，获取大量载体。含有丙肝病毒全长基因的pHCV-2b重组载体于2001年4月19日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M201013b。pHCV-2用于复制HCV全长RNA。实施例③能表达丙肝病毒蛋白酶和结构酶的载体。
通过SEQ ID NO1和SEQ ID NO6作引物以pHCV-2作模板，扩增带有三个点突变的HCV全长DNA。凝胶纯化后经SpeI酶切后克隆到pSC59的SpeI和StuI位点下，而获得pHCV-1。将pHCV-1重组载体转染HB101细菌，用含氨苄的LB培养基选择细菌克隆，扩大培养，获取大量载体。含有丙肝病毒全长基因的pHCV-1重组载体于2001年4月19日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M201012.pHCV-2的HCV结构蛋白和酶蛋白基因可通过PCR扩增，可以克隆到pSC59载体上，此载体带来痘病毒的启动子和终止子，用于转染细胞，大量提供HCV蛋白和结构蛋白。实施例④构建表达T7 RNA聚合酶重组痘病毒vT7D13LvTFD13L痘病毒重组体是由同源重组所产生的，采用的是Moss和Earl所提出的方法。含有T7 RNA聚合酶痘病毒重组体的第一步获得vTF7-3痘病毒重组体，该病毒可从美国ATCC中获得，该重组体具有插入在胸腺嘧啶编码区域的T7 RNA基因是利用下列引物从痘病毒基因组DNA中PCR放大痘病毒D13L编码区域以及两侧的500bp侧链序列以SEQ ID NO10和SEQID NO11作引物，2.7kb PCR产物含平整末端，然后将其克隆在pUC19的PvuII位中。所得的质粒用BstxI和HindIII进行消化，以除去D13L编码区域，随后与一DNA片断相连，该片断在痘病毒前/后启动子7.5的控制下，对细菌gpt基因进行编码。所得质粒为pGPT-D13L。在T25摇瓶中的非洲绿猴肾细胞CV-1 106个细胞在MOI为0.05下用vTF7-3痘病毒重组体(ATCC可购得)进行感染。初始感染两小时后，采用LipofectAmine法用10μg的pGPT-D13L质粒转染细胞，四小时转染之后，细胞置于具有2.5％胎牛血清的新鲜DMEM中。经过48小时的保温，可以收集细胞，并反复冻融使细胞裂解，所得的0.5ml细胞裂解液中含有vT7D13L痘病毒重组体和vTF7-3筛选vT7D13L重组体。是由DMEM中含有2.5％胎牛血清、2.5μg/ml MPA、250μg/ml黄嘌呤和15μg/ml次黄嘌呤的xGPT选择培养基中进行。细胞裂解产物进行10倍稀释，然后感染已经用xGPT选择培养基预保温12小时的非洲绿猴肾细胞CV-1，每孔中用1ml的稀释的细胞裂解产物进行感染。2小时后将一小部分野生型痘病毒WR加入到培养基中，至MOI为10。细胞再保温2小时。除掉病毒接种物后，用3ml 1％的低熔琼脂糖进行重叠。挑选出来的vT7D13L空斑可用于感染，96孔板中用5μg/孔的pD13L质粒转染非洲绿猴肾细胞CV-1，该质粒含有痘病毒前/后启动子相连的D13L。转染是采用LipofectAmine法。保温72小时后收集空斑，并用pD13L瞬间转染的非洲绿猴肾细胞CV-1进行数次连续重复选择，进一步提纯。构建pD13L质粒。使用下列两个引物从痘病毒WR基因组DNA放大D13L；以SEQ IDNO12和SEQ ID NO13作引物，得到的片断克隆在pSC59的克隆位点上，质粒pSC59是在pUC19基础上构建的。它含有痘病毒前/后启动子，多个克隆位点以及痘病毒终止子。
由于痘病毒重组体基因组中含有gpt基因，以及重组体不含D13L基因。vT7D13L在未被pD13L转染的细胞中不能繁殖，用此种方法可证实vTFD13L痘病毒重组体的纯度。在pD13L质粒瞬间感染CV-1细胞中，vT7D13L可以进行繁殖和滴度测定。vT7D13L可用蔗糖梯度离心法可以进一步提纯。实施例④ 转染细胞及丙肝病毒的获得。
将实施例①获得的载体pHCV-2(CCTCC M201013)经ScaI酶切及纯化后与实施例③获得的载体pHCV-1转染Hela细胞。取1μg pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中，置室温15分钟，另取1μg pHCV-1加入100微升OPTI-MEM中，置室温15分钟混匀；并取5微升LF2000加入95微升OPTI-MEM中置室温15分钟混匀，将载体与LF2000混匀，转染106个Hela细胞，并设无载体和无LF2000两个对照组，经过4个小时的转染后，除去转染介质，并用含2.5％胎牛血清和DMEM取代，DMEM培养基中含有107pfu vTF7-3(ATCC NO VR-2153)重组痘病毒。经2小时的接种后，除去接种物，细胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中进行培养。经48-72小时的温育后，收集含有丙肝病毒体的细胞培养物上清液。
实施例⑥转染细胞及丙肝病毒的获得将实施例①获得的载体pHCV-2(CCTCC M201013)转染Hela细胞。取1μg ScaI酶切过pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中，取1μg pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中置室温15分钟；并取5微升LF2000加入95微升OPTI-MEM中置室温15分钟混匀，将载体与LF2000混匀，转染105个Hela细胞，并设无载体和无LF2000两个对照组，经过6个小时的转染后，除去转染介质，并用含2.5％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培养基中含有107pfu vTF7-3(ATCC N0VR-2153)重组痘病毒，并加入利福平10毫克/每毫升。经2小时的接种后，除去接种物，细胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中进行培养。经48-72小时的温育后，收集含有丙肝病毒体的细胞培养物上清液。
实施例⑦转染细胞及丙肝病毒的获得将实施例①获得的载体pHCV-2(CCTCC M201013)转染Hela细胞。取1μg ScaI酶切过pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中，取1μg pHCV-2加入100微升OPTI-MEM中，置室温15分钟；并取5微升LF2000加入95微升OPTI-MEM中置室温15分钟混匀，将载体与LF2000混匀，转染106个Hela细胞，并设无载体和无LF2000两个对照组，经过4个小时的转染后，除去转染介质，并用含2.5％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培养基中含有107pfu vT7D13L(实施例④构建的D13L缺陷型重组痘病毒)。经2小时的接种后，除去接种物，细胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中进行培养。经72小时的温育后，收集含有丙肝病毒体的细胞培养物上清液。实施例⑧ 用RT-PCR测定扩增病毒的滴度在24孔板中加入Huh 7细胞，每孔106个细胞，24小时后，去上清，加入实施例⑤获得的细胞培养物上清夜，此上清液10倍稀释，每孔加入1ml的稀释后的上清液。24小时后，除去接种物，并用含10％胎牛血清的1ml新鲜DDMEM取代之。培养2天之后，收集细胞，并从细胞中提取全部的RNA。用RT-PCR检测丙肝病毒的电泳带，PCR引物序列为RT-PCR引物为SEQ ID NO14，PCR引物为SEQ ID NO15和SEQ ID NO116。每孔加800微升TrizolReagent，反复吹打使细胞充分裂解，并于室温放置5分钟；加160微升氯仿，摇动EP管15秒，室温放置2-3分钟；于4℃，12000转离心15分钟，弃上清；加入400微升异丙醇，室温放置10分钟，于4℃12000转离心10分钟，弃上清；加入75％乙醇800微升沉淀RNA，并于4℃，7500转离心5分钟；弃上清，沉集的RNA空气干燥，加20-40μl无菌水溶解RNA备用。RNA逆转录总体积30μl，反应体系如下RNA 15微升，引物1微升，75℃变性分钟，置-3℃，3分钟；加入5x buffer 6微升，dNTP 6微升，Rnasin 1微升，总体积29微升，在42℃停留2分钟，加入MMLVRTase，1微升，37℃停留50分钟，70℃ 15分钟灭活得到丙肝病毒cDNA。PCR扩增反应体系为Buffer 5微升，cDNA 2微升，MgCl24微升，dNTP 4微升，上下游引物各1微升，Taq酶0.5微升，双蒸水36.5微升；PCR反应条件为95℃1分钟，95℃30秒-56℃30秒-72℃40秒-72℃5分钟，Tn32个循环。扩增产物于-20℃贮存。电泳条件2％琼脂糖，18V/厘米电压，电泳10-15分钟，可见300bp带，即为丙肝病毒电泳带。实施例⑨ 用RT-PCRR荧光定量检测扩增病毒的滴度根据深圳达尔安生物工程有限公司产品丙肝病毒核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒说明书进行操作。检测结果判定计算Ax＝A1-A0(A0为反应前值，A1为反应后值)；实验有效性判别将阴性对照管的Ax称为N，监界阳性标准品的Ax值称为P1，强阳性标准值Ax称为P2，若此3值满足P2＞P1＞N，则本次实验有效。否则，实验无效，应检查试剂、仪器、反应条件等方面的误差。结果判定，在实验有效的前提下，样品Ax＞N+0.6×(P1-N)判定阳性；如果N+0.6×(P1-N)＞Ax＞N+0.4×(P1-N)则属于实验灰度区，需重复实验一次，若重复实验结果Ax值＞N+0.4×(P1-N)判为阳性，否则判为阳性；如果Ax值＜N+0.4×(P1-N)判为阴性。
RT-PCR荧光定量检测结果
实施例⑩丙肝病毒的电镜检测。
将实施例⑥中的已转染载体并感染痘病毒的HeLa不同培养时间进行收集。方法采用常用的方法。用2.5％的戊二醛固定，包埋切片，电镜观察，可见20-30纳米的丙肝病毒粒子。
序列表<110>李卫云，于红潮，李一君；<120>一种高效增殖丙肝病毒体的方法及其组份<160>16<210>1<211>74<212>DNA<213>丙肝病毒<400>CAA AAA ACC CCT CAAGAC CCG TTT AGA GGC CCC AAG GGG TTA TGC 45CT ACTAGTACT TGA TCT GCA GAG AGG CCA74<210>2<211>19<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
AAGGTTGGGTAAACACTCC 19<210>3<211>22<212>DNA<21 3>丙肝病毒<400>
AACGGGGAGCTAAACACTCCTG 22<210>4<211>30<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CGA CTC CTC GCG CCT ATT ACG GCC TAC TCC 30<210>5<211>30<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
GGA GTA GGC CGT AAT AGG CGC GAG GAG TCG30<210>6<211>48<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CGTAAG CTT AAT ACG ACT CACT ATA GCC AGC CCC CTG ATG GGG GCG AC 48<210>7<211>25<212>DNA<213>丙肝病毒<400>CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGC25<210>8<211>23<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CCTATCAGGCAGTAGTACCACAA23<210>9<211>23<212>DNA<213>HCV<400>
CTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTG 24<210>10<211>25<212>DNA<213>痘病毒<400>
CATAGTATCGATTACACCTCTACCG25<210>11<211>28<212>DNA<213>痘病毒<400>
GAGAGGTTTTCTACTACTTGCTCATTAG28<210>12<211>39<212>DNA<213>痘病毒<400>
TTAATTGTTGTCGCCCATAATCTTGGTAATACTTACCCC<210>13<211>27<212>DNA<213>痘病毒<400>
ATGAATAATACTATCATTAATTCTTTG27<210>14<211>25<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGC25<210>15<211>23<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CCTATCAGGCAGTAGTACCACAA23<210>16<211>24<212>DNA<213>丙肝病毒<400>
CTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTG2权利要求
1.一种高效增殖丙肝病毒体的方法，它包括的步骤是A制备下列组份为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；c能启动和促进上述载体表达的痘病毒；d宿主细胞；或为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；b能表达丙肝病毒结构蛋白的载体；c能同时启动和促进上述载体表达的痘病毒；d宿主细胞；其中，载体a由下列步骤制备①扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到载体上；②在载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的NS3和NS5A进行3个氨基酸突变，得到载体a，载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体上；B将步骤A中的载体a或者载体a和b先转染宿主细胞d，再用痘病毒c感染已转染表达载体的宿主细胞，获得重组宿主细胞；C培养重组宿主细胞，并收集细胞表达产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，该方法包括的步骤是A制备下列组份为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体，且丙肝病毒全长基因组cDNA位于T7启动子和T7终止子之间，序列长度小于9660核苷酸；c含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主细胞；或为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；且丙肝病毒全长基因组cDNA位于T7启动子和T7终止子之间，序列长度小于9660核苷酸；b能表达丙肝病毒结构蛋白的载体；且丙肝结构蛋白基因组cDNA位于痘病毒早期或后期启动子和终止子之间；c含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主细胞；其中，载体a由下列步骤制备①扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到pFK-1载体上；②在载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的进行E1202G，T1208I，S2197P的三次点突变，得到载体a，载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体pSC59上，得到载体b；B将步骤A中的载体a或者载体a和b先转染宿主细胞d，再用痘病毒c感染已转染表达载体的宿主细胞，获得重组宿主细胞；C培养重组宿主细胞，并收集细胞表达产物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是痘病毒敏感型宿主细胞为HeLa，或BSC-1，或CV-1，或MRC-5等哺乳动物细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是痘病毒敏感型宿主细胞为HeLa细胞。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是转染采用脂质体转染法。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征是载体a为CCTCC M201013。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征是载体b为CCTCC M201012。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征是痘病毒c为含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒vTF7-3，ATCC NO.VR-2153。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征是痘病毒c为含有T7噬菌体RNA聚合酶基因且D13L基因缺陷型痘病毒；
10.根据权利要求2所述的方法，其特征是，该方法包括的步骤是A制备下列组份为a CCTCC M201013c ATCC NO VR-2153d HeLa或为a CCTCC M201013b CCTCC M201012c ATCC NO VR-2153d HeLa其中，载体a由下列步骤制备①从病人血清中用6个引物扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到pFK-1载体上，形成pFK-1 HCV DNA；②在pFK-1 HCV DNA载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的NS3和NS5A进行3个氨基酸突变，依次为NS3区的第1202位点Glu变为Gly，第1280位点的Thr变为Ile，NS5A区的第2197位点Ser变为Pro，得到pHCV-2，CCTCC M201013；载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体pSC59载体上，形成pHCV-1，CCTCC M201012；B将步骤A中的载体a或者载体a和b先转染宿主细胞d，再用痘病毒c感染已转染表达载体的宿主细胞，获得重组宿主细胞；C培养重组宿主细胞，并收集细胞表达产物。
11.一种权利要求1-10所述方法得到的丙肝病毒体.
12.一种高效增殖丙肝病毒体的组分，其特征是该组份为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；c能启动和促进上述载体表达的痘病毒；d宿主细胞；或为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；b能表达丙肝病毒结构蛋白的载体；c能同时启动和促进上述载体表达的痘病毒；d宿主细胞；其中，载体a由下列步骤制备③扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到载体上；④在载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的NS3和NS5A进行3个氨基酸突变，得到载体a，载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体上；
13.根据权利要求12所述的组份，其特征是该组份为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体，且丙肝病毒全长基因组cDNA位于T7启动子和T7终止子之间，序列长度小于9660核苷酸；c含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主细胞；或为a能表达丙肝病毒全长基因组RNA的载体；且丙肝病毒全长基因组cDNA位于T7启动子和T7终止子之间，序列长度小于9660核苷酸；b能表达丙肝病毒结构蛋白的载体；且丙肝结构蛋白基因组cDNA位于痘病毒早期或后期启动子和终止子之间；c含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒；d痘病毒敏感型的宿主细胞；其中，载体a由下列步骤制备①扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到pFK-1载体上；②在载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的进行E1202G，T1208I，S2197P的三次点突变，得到载体a，载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体pSC59上，得到载体b；
14.根据权利要求12或13所述的组份，其特征是痘病毒敏感型宿主细胞为HeLa，或BSC-1，或CV-1，或MRC-5等哺乳动物细胞。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征是痘病毒敏感型宿主细胞为HeLa细胞。
16.根据权利要求13所述的组份，其特征是载体a为CCTCC M201013。
15.根据权利要求13所述的组份，其特征是载体b为CCTCC M201012。
17.根据权利要求13所述的组份，其特征是痘病毒c为含有T7噬菌体RNA聚合酶基因的重组痘病毒vTF7-3，ATCC NO.VR-2153。
18.根据权利要求17所述的组份，其特征是c痘病毒为含有T7噬菌体RNA聚合酶基因且D13L基因缺陷型痘病毒；
19.根据权利要求13所述的组份，其特征是a CCTCC M201013c ATCC NO VR-2153d HeLa或为a CCTCC M201013b CCTCC M201012c ATCC NO VR-2153d HeLa其中，载体a由下列步骤制备①从病人血清中用6个引物扩增丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，并克隆到pFK-1载体上，形成pFK-1 HCV DNA；②在pFK-1 HCV DNA载体上对丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列的NS3和NSSA进行3个氨基酸突变，依次为NS3区的第1202位点Glu变为Gly，第1280位点的Thr变为Ile，NS5A区的第2197位点Ser变为Pro，得到pHCV-2，CCTCC M201013；载体b通过引物以载体a为模板，扩增带有三个点突变的丙肝病毒的全长基因组核苷酸序列，克隆到表达载体pSC59载体上，形成pHCV-1，CCTCC M201012；
全文摘要
本发明公开了一种高效扩增丙肝病毒体的方法,该方法包括的步骤是制备a能表达丙肝病毒基因组RNA的载体和/或b能表达丙肝病毒多聚蛋白的载体,以及c启动上述载体表达的痘病毒和d宿主细胞的组分,依次加入各种组分,在离体细胞中增殖丙肝病毒体,此方法克服了传统的丙肝病毒不能在培养的细胞上扩增限制和扩增效率低的问题,可大量生产用于体外研究和疫苗防治等目的的丙肝病毒体。本发明还公开了一种增殖丙肝病毒体的系统组分。
文档编号C12N15/09GK1377959SQ0211766
公开日2002年11月6日 申请日期2002年5月10日 优先权日2001年5月10日
发明者李信墙, 李研 申请人:李卫云, 于红潮, 李一君