专利名称：制备纯化的甲型肝炎病毒体和疫苗制剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种从感染的细胞培养物的上清液中纯化甲型肝炎病毒以及制备纯化的HAV抗原制剂的方法。本发明也涉及一种包含一种制剂的HAV疫苗组合物，其中该制剂含有充分量的在哺乳动物中诱导保护性免疫应答的纯化的成熟HAV粒子。
背景技术：
甲型肝炎不断地引起散发性的、地方性的以及偶发性的死亡，并且是一个全球性的公共卫生问题。所述感染是由微小RNA病毒家族的一个成员-甲型肝炎病毒(HAV)所引起的，其中的微小RNA病毒是一组小的非包膜的RNA病毒。所述病毒体的直径为27-32nm，由从单个多肽前体分子裂解得到的VP1，VP2和VP3三个多肽组成。
甲型肝炎病毒(HAV)是唯一的嗜肝性病毒，其可分离自细胞培养物，但所述病毒通常难以增殖，具有长的潜伏期且没有细胞致病作用。尽管一些灵长类动物细胞类型已经被报道能够支持HAV的复制，诸如胎恒河猴肾脏细胞系(FRhk-4)、初级的非洲绿猴肾脏细胞(AGKM)、连续的非洲绿猴肾脏细胞(BCS-1)，但这些细胞通常不能用于人的疫苗，因为猴子的肾脏往往具有高含量的潜伏的猴病毒，其在用于病毒生产疫苗的过程中可变为可见的。其它的细胞系不能被使用是因为一些细胞的致肿瘤特性引起对其用于疫苗生产的抑制。用于繁殖HAV的初级人上皮细胞、成纤维细胞或肾脏细胞或细胞株的批量生产因这些细胞在培养物中的低传代数而受到限制。事实上，世界卫生组织(WHO)的应用指南表明仅仅少数的一些细胞系被允许用于病毒疫苗的生产。
一种目前被接受并被证实适用于生产人疫苗的细胞系是VERO细胞。VERO细胞是已被许可用于人疫苗制备工艺的持续猴肾脏细胞，并且现在被用于脊髓灰质炎和狂犬病疫苗的生产。
人们已经尝试使用VERO细胞来生产HAV，但在VERO细胞上复制HAV是受限制的，因为VERO细胞具有病毒生长的温度限制且从未在被感染细胞的上清液中发现病毒(Locarnini等，1981，J.Virol.37216-225)。US4783407公开了在滚瓶中在不高于33℃的温度下在VERO细胞上生产HAV来克服温度限制。在此系统中，冻融培养细胞后，每摇瓶可获得大约50μg的HAV抗原。目前尚没有描述基于在VERO细胞上增殖HAV的商用疫苗。
迄今为止，福尔马林灭活的HAV疫苗已被生产出来用于临床试验(Andre等，1990，在Melnick(ed)Prog.Med.Virol.Basel，Karger 3772-95，Armstrong等，1993，J.Hepatology 1820-26)且四种疫苗已被许可，它们能诱导持久的免疫力并保护抵抗初次感染。目前有效的灭活HAV全病毒疫苗的生产方法利用人胚胎的肺成纤维细胞系MRC-5作为宿主细胞，其在组织培养物中生长缓慢且仅仅添加胎牛血清。
在细胞培养物中使用血清和/或在培养基中添加来自动物或人来源的蛋白添加剂带来的问题，即不同批次的不同特性和组成以及被支原体、病毒或BSE-因子污染的风险所带来的问题，是众所周知的。因此，人们进行许多尝试来提供有效的宿主系统和不需要血清或其它来自血清的化合物的培养条件。此外，由于含有病毒抗原的原材料的污染较小，通过利用不含血清的培养基避免了污染，使得提纯更为有效。
Binn等人(1984.J.Clincal.Microbiol.2028-33)测试了一些用于复制HAV的灵长类动物细胞和用于分离和生产大量病毒的最佳条件。通过在BSC-1细胞，一种迄今尚没有被用于人疫苗制备的异双倍体细胞系上，在摇瓶中进行无血清HAV生产显示出，在培养21天后可在上清液和细胞组分中发现病毒抗原。维持在支持病毒生长的无血清培养基中的细胞等同于维持在血清中的细胞。通过低速离心维持在无血清培养基中的冻融细胞的上清液和受感染的BSC-1细胞的上清液获得的候选HAV疫苗，由Binn等在1986年描述于J.Infect.Diseases153749-756中。
Flehmig等人(1987.J.Medical Virol.227-16)用分离自持续地受感染的正常人胚胎的成纤维细胞的细胞培养物的上清液的HAV来制备候选HAV疫苗，其中的胚胎成纤维细胞生长在含有血清的无细胞致病作用的培养基中。
因此，从由NUNC细胞工厂生产的大量上清液通过连续步骤分离和纯化而得到的HAV抗原被用于疫苗接种试验。
然而，所有生长在细胞培养物中的HAV菌株具有不能有效率地释放病毒到培养物的上清液中的特性。尽管有多达50％的传染性病毒可被释放，然而典型地少于30％的传染性病毒是胞外的(Nasser等，1987.Appl.Environmental Microbiol.532967-2971)。因此，通常在未浓缩的培养物上清液中是不可检测抗原的且大容量的浓缩增加了此方法中HAV提纯的难度。因为HAV抗原不是被有效地释放到培养物的上清液中且大容量的浓缩是昂贵的(Bishop等，1994.J.Virol.Meth.47203-216)，因此所描述的大多数纯化方法利用来自胞内生产的病毒细胞溶解产物的HAV抗原作为生产HAV疫苗的来源(EP0339667；EP0583142，Andre等，1990，InMelnick(ed)Prog.Med.Virol.Basel，Karger 3772-95；Armstrong等，1993，J.Hepatology1820-26)；Hagen等，1996，Biotechnol.Appl.Biochem.23209-215；Bader等，1996，Amer.J.Gastroenterol.91217-222，Hennessey等，1999，Vaccine 172830-2885，WO00/23574)。然而，这些方法是费时的，其使用细胞释放胞内生产的抗原所必需的去垢剂且需要强烈的和一系列纯化步骤来去除细胞中的去垢剂和污染物。
为诱导保护性的免疫应答，有人提议，衣壳蛋白必须是折叠的且以正确的构象进行装配成而且前体蛋白不能引发保护性的免疫应答。成熟的HAV粒子由3个病毒衣壳蛋白(VP1，VP2，VP3)组成。通过几个连续的裂解可以以单一的前体分子(P1)获得这些蛋白。在病毒成熟和装配过程中形成了不同的中间体。裂解前的蛋白首先装配为五邻体结构，然后60个五邻体形成一个前病毒体。前病毒体由VP1，VP0和VP3组成。在最后对VP2和VP4中的VP0进行成熟切割后，由这些前病毒体获得了成熟的病毒体。VP4不存在于成熟的病毒体中。
由细胞溶解产物和/或细胞培养物的上清液得到的HAV的大规模制剂含有成熟病毒体、前病毒体和前衣壳的混合群体(Bishop等，1997.Arch.Virol.1422147-2160；EP 339667，EP 339668)。成熟的病毒由多肽VP1、VP2和VP3组成，其中衣壳蛋白VP1和VP3包含主要的抗原位点且能够诱导中和抗体(Lemon等，1989，在Semler等编辑，微小RNA病毒的分子方面及检测。华盛顿特区ASM p 193-208)。人们已经进行了很多尝试来纯化HAV以及分离各种形式的HAV粒子。1997年Bishop等人(同上)利用线性梯度离心来分离不同的HAV粒子形式，并且发现密度为1.32-1.33g/cm3的HAV粒子是显示前病毒体和成熟病毒体不完全分离的含有VP0和VP2粒子的混合物。在主要包含成熟的HAV病毒体的组分中，发现VP2多于VP0，其相应的比率为55％比45％。在细胞溶解产物和培养物上清液中还都检测到了病毒体和前病毒体，且除了VP0之外，还检测到释放的含有可变水平的VP1前体蛋白PX的粒子，其具有大约67KD的分子量。Dubois等人(1991，J.Virol.Meth，32327-334)由包括通过等密度离心纯化的完全粒子的1.33g/cm3密度的主要峰值组分制备了一种疫苗。US 5,268,292描述了由持续感染的细胞分离和纯化HAV的方法，且发现大多数的银染蛋白为病毒多肽VP1，VP2和VP3，而且可检测到一种大约67kD的多肽。
每年全球市场对HAV疫苗的需求量为1亿剂。有效的疫苗生产需要由宿主系统高产量大规模培养生产病毒的。此外，人们需要一种利用已可利用的材料以及需要最少数量的耗时操作来增殖病毒的方法，其中宿主细胞、培养基、生长条件和生产系统是实现此有效的制备方法所必需的。大多数的疫苗没有被纯化来保持灵敏的对疫苗效果起关键作用的生物活性。可以期望一种纯的产物用于生产具有较高免疫原性的稳定的疫苗且从临床角度考虑产生较小的副作用。
发明概述本发明的一个目的是提供一种由感染的细胞培养物的细胞培养物的上清液纯化HAV的方法。
本发明的另一个目的是提供一种由感染的细胞培养物的上清液分离完全的HAV粒子的方法。
本发明的另一个目的是提供一种由感染的细胞培养物的上清液分离成熟的HAV粒子的方法。
本发明的另一个目的是提供一种生产HAV粒子的纯化制剂的方法。
本发明的另一个目的是提供一种生产包含完全的HAV粒子的纯化制剂的方法。
本发明的另一个目的是提供一种生产包含成熟HAV粒子的纯化制剂的方法。
本发明的另一个目的是提供一种生产包含灭活的、纯化的成熟HAV粒子的纯化制剂的方法。
本发明的另一个目的是提供一种包含纯化的HAV粒子的制剂。
本发明的另一个目的是提供一种纯化的完全的HAV抗原疫苗。
本发明的另一个目的是提供一种纯化的成熟的HAV抗原疫苗。
附图的简要说明
图1A显示了HAV纯化过程中的不同中间体的SDS-PAGE蛋白模式和银染色。
图1B显示了利用HAV特异性豚鼠血清进行的HAV纯化过程中不同中间体的蛋白质印迹分析。其显示泳道1HAV浓缩物(原始材料)，泳道2开放的，泳道3超滤步骤10倍浓缩物的滤液；泳道4超滤步骤10倍浓缩物的保留物；泳道5开放的，泳道6渗滤步骤1的渗滤物1；泳道7渗滤步骤1的渗滤保留物1；泳道8用0.22μ过滤器过滤后的渗滤保留物1；泳道9开放的，泳道10渗滤保留物加Benzonase(处理3小时后)；泳道11渗滤保留物加蛋白酶(处理24小时后)；泳道12开放的；泳道13用缓冲液渗滤的渗滤滤液2；泳道14渗滤保留物2；泳道15开放的；泳道16渗滤保留物2(利用0.22u过滤器)；泳道17开放的以及泳道18分子量标准。
图1C显示了利用VERO细胞特异性抗血清的HAV纯化过程中不同中间体的蛋白质印迹分析。泳道1分子量标准；泳道2开放的；泳道3HAV浓缩物(原始材料)，泳道4开放的，泳道5超滤步骤10倍浓缩物的滤液；泳道6超滤步骤10倍浓缩物的保留物；泳道7渗滤步骤1的渗滤滤液1；泳道8渗滤步骤1的渗滤保留物1；泳道9用0.22μ过滤器过滤后的渗滤保留物1；泳道10开放的，泳道11渗滤保留物加Benzonase(处理3小时后)；泳道12渗滤保留物plus蛋白酶(处理24小时后)；泳道13开放的；泳道14用缓冲液渗滤的渗滤滤液2；泳道15渗滤保留物2；泳道16渗滤保留物2(利用0.22μ过滤器)。
图2A显示了利用增加的抗衣壳蛋白的豚鼠血清进行蔗糖-梯度纯化而得到的HAV制剂不同组分的蛋白质印迹分析。
图2B显示了利用抗VP0的特异性豚鼠血清进行蔗糖-梯度纯化得到的HAV制剂不同组分的蛋白质印迹分析。泳道1分子量标准；泳道2组分11，泳道3组分12，泳道4组分13；泳道5组分14；泳道6组分15；泳道7组分16；泳道8集合组分12-14。
图3显示了利用VERO细胞的特异性抗血清进行的HAV纯化过程中不同中间体的蛋白质印迹分析。泳道1细胞培养上清液；泳道2渗滤保留物1(超/渗滤后)；泳道3渗滤保留物1加蛋白酶(处理24小时后)；泳道渗滤保留物2(用缓冲液渗滤后)；泳道5蔗糖-梯度的组分12-14。
图4显示了由本发明的成熟HAV粒子组成的HAV制剂以及两种利用抗VP0、抗VP1和抗VP3抗体的许可疫苗的蛋白质印迹分析。泳道1分子量标准；泳道2上清液的10倍浓缩物(超速离心前的)；泳道3蔗糖-梯度的峰组分1；泳道4蔗糖-梯度的峰组分2；泳道5VERO细胞的裂解物；泳道6VAQTA 10倍；泳道7HAVRIX 10倍；泳道8分子量标准。
发明详述在本发明中建立了一种方法，它允许在无血清条件下生产HAV抗原以及允许从受感染细胞的细胞培养物的上清液简单地纯化HAV抗原。通过本发明的方法可有效地除去细胞或细胞培养基中的污染杂质。
根据本发明的一个目的，提供一种纯化HAV抗原的简单方法，其在单一的纯化步骤中产生高度的纯度。
依据该方法，通过过滤浓缩含有产生并释放到培养基中的HAV的细胞培养物的上清液，用一种核酸降解试剂和一种蛋白酶处理浓缩的HAV制剂，过滤经所述试剂和蛋白酶处理的制剂，以及分离完全纯化HAV粒子的制剂，从而由HAV感染的细胞培养物的细胞培养上清液纯化得到了HAV抗原。
然后进一步对完全的HAV粒子的纯化HAV制剂进行分离步骤，从完全HAV粒子的纯化的HAV制剂中分离出纯化的成熟HAV粒子的步骤。包含纯化和分离步骤的本发明的方法产生了适于人临床应用的纯化HAV制剂，所述制剂基本上不含来自细胞和细胞培养物的污染物。
术语“完全的HAV粒子”是指由衣壳蛋白VP1、VP2和VP3组成的成熟的、传染性HAV病毒体的含有RNA的HAV粒子，以及含有VP1、VP3和VP0前体多肽的不成熟的前病毒体。
术语“成熟的HAV粒子”是指仅反由衣壳蛋白VP1、VP2和VP3组成的含有RNA的HAV病毒体。
术语“适于人临床应用”是指通过发色体LAL试验测定的10μg抗原的内毒素含量小于大约2IU。此外，根据本发明，通过定量PCR利用内标测定的污染DNA的水平，尤其是VERO细胞的DNA水平小于大约100pg/100IU HAV抗原，优选地小于大约50pg，更优选地小于大约40pg。因此具有大约20IU HAV抗原的疫苗剂量具有小于大约20pg，优选地小于大约10pg，最优选地小于大约8pg的污染DNA。此外，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析测定的每剂量病毒抗原的细胞污染物水平小于总蛋白含量的大约0.1％，优选地小于大约0.05％。
术语“基本上不含”是指污染杂质诸如来自细胞或细胞培养物的蛋白质或污染细胞的核酸的量，低于本领域检测方法的最灵敏状态的检测极限。蛋白质印迹分析和光密度方法被用于测定样品中污染蛋白质的量。US 5,858,658中所描述的用于核酸定量分析，特别是用于基因组VERO细胞DNA的高灵敏度PCR法，可用于定量测定样品中核酸的残余量。
术语“来自细胞和细胞培养基的污染物”是指细胞片段、细胞多肽和蛋白质、细胞核酸以及其它来自细胞的高分子和来自培养基的多肽以及蛋白质。
术语“细胞核酸″是指获自用于繁殖所述病毒的已经被病毒感染的细胞的异源DNA或RNA。
本发明的纯化的HAV抗原基本上不含污染蛋白质和核酸，适用于人临床应用并且是稳定的。“纯化的甲型肝炎病毒抗原”是指通过SDS-PAGE(银染或考马斯染色)和蛋白质印迹测定的纯度和HAV抗原与总蛋白量的比值，所述纯度优选地大于大约98％。
根据本发明的目的，提供了一种生产完全HAV粒子的纯化制剂的方法，包括用核酸降解试剂和蛋白酶处理获自HAV感染的细胞培养物的细胞培养物上清液的HAV制剂以及分离完全HAV粒子的制剂的步骤。用核酸降解度剂和蛋白酶处理之前，收集和浓缩含有HAV的上清液。含有HAV的细胞培养物上清液可来自任意能产生和释放HAV到上清液中的细胞培养物。细胞培养物优选地为一种不含血清的细胞培养物。
根据本发明方法的一个实施方案，所提供的细胞培养上清液来自HAV感染的VERO细胞。VERO细胞存在于在悬浮液、摇瓶或烧瓶中。
根据优选的实施方案，VERO细胞优选地为一种微载体培养物，其中所述细胞与所述微载体结合。该微载体可为一种选自右旋糖酐、骨胶原、塑料、胶质和纤维素以及其它如Butler描述的(1988，在Spier& Griffiths，Animal cell Biotechnology 3283-303)组的微载体。所述细胞优选培养在不含血清或不含血清和蛋白质的培养基中。不含血清或不含血清和蛋白质的培养基可以是如Kistner等(1998，Vaccine 16960-968)，Merten等(1994.Cytotech.1447-59)，Cinatl.等(1993.Cell Biology Internat.17885-895)，Kessler等(1999.Dev.Biol.Stand.9813-21)，WO 96/15231，US 6,100,061所描述的实例或本领域已知的任意其它不含血清或不含血清和蛋白质的培养基。所述细胞优选地从安瓿瓶中在不含血清或不含血清和蛋白质培养基生长到生物量，并在细胞培养生长、病毒增殖和病毒生产过程期间保持在各自的培养基条件下。
然而，本发明的方法可被用于任意的已知能释放HAV粒子到细胞培养基中的HAV-感染的细胞的细胞培养物上清液，该培养基的实例被Binns等(1984，同上文)或Flehmig等(1987，同上文)描述，其中可使用任意的易受HAV感染并释放HAV到培养基中的宿主细胞。
由于在HAV感染的细胞的细胞培养基中的HAV粒子被稀释，通过减少培养基的体积来浓缩培养基中的HAV抗原。这些可通过任意已知的减少液体体积以及浓缩含有病毒的液体的方法，诸如离心、过滤、沉淀、两相分配的方法来实施。在本发明的一个优选方面中，通过过滤来浓缩含有HAV的培养基收集物。根据本发明的方法，超滤是优选的。这具有其它的优点，可以在同一步骤中除去比HAV粒子小的污染物。然后用核酸降解试剂和蛋白酶处理所获得的含有HAV的浓缩物。试剂和蛋白酶可能需要针对其活性的特定条件，诸如离子强度、pH和缓冲液。为提供所述活性的有效缓冲液条件，可通过使得核酸降解试剂和蛋白酶在含HAV的制剂中具有有效活性的缓冲液来除去和交换细胞培养基。这些可通过本领域已知的方法，诸如通过超滤或色谱法进行的透析和缓冲液交换来实施。根据本发明方法的一个优选的方面，其是通过过滤来实施的。此过滤优选通过渗滤来进行。
本发明的核酸降解试剂可以为一种降解核酸的酶，优选为一种核酸降解酶，诸如核酸酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶或内切酶，诸如来自粘质沙雷氏菌(Serrati amarcescens)，市售的Benzonase(Benzon PharmaA/S)。
用于降解高分子量蛋白质和多肽的蛋白酶可以是本领域公知的任意蛋白酶，诸如例如蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶。
然而，动物来源的蛋白酶，诸如牛或猪胰蛋白酶带有被感染剂如BSE污染的危险。
因此，根据本发明方法的一个优选方面，含有HAV的制剂用微生物来源的蛋白酶进行处理。微生物蛋白酶可以为链霉蛋白酶。链霉蛋白酶为来自灰色链霉菌(S.g.)的不同酶的混合物，并且可以从市售获得。这种混合物包含许多不同的蛋白，包括蛋白酶、磷酸酶、胶原酶以及胰蛋白酶类蛋白酶，通常称作S.g.胰蛋白酶(SGT)。这种酶的选择性以及活性显示出与动物来源的胰蛋白酶较大程度的相似性。因为链霉蛋白酶为不同酶的组合物，其中的酶活性之一也许对制剂中的HAV具有副作用。
根据一个优选的实施方案，使用微生物蛋白酶的纯化的胰蛋白酶类酶。尤其是，使用一种链霉蛋白酶的纯化组分，胰蛋白酶类酶灰色链霉菌胰蛋白酶(SGT)。纯化的SGT优选地通过在苄脒上的亲和层析，并用包括0.5到1.2M精氨酸的洗脱剂洗脱纯化的SGT的方法获得。人们已经发现通过这种方法纯化的SGT非常有效，并且由于其较高的比活度，可以通过向培养基中加入较低的蛋白载量进行使用。通过本领域公知的其它已知方法从链霉蛋白酶纯化得到的SGT也可用于本发明的方法中。这种方法包括诸如由Yokosawa等描述的方法(1976.Biochem.79757-763)或者其它层析法。
用核酸降解试剂以及蛋白酶处理HAV制剂后，从制剂中除去试剂和蛋白酶以及源于它们的活性产生的降解产物，例如高分子量大分子的低分子量片段如核酸或者蛋白质及其它杂质。根据本发明的方法，通过过滤进行杂质的去除。从而，获得含有小于30pg的污染核酸/IUHAV抗原的纯化制剂。该制剂具有最少5000IU的HAV抗原/mg蛋白。
人们发现，通过过滤能有效地去除杂质，并且在一个单独的步骤内分离了完全的HAV粒子。因此，如上所述获得的完全HAV粒子的纯化制剂基本上由完全的HAV粒子组成，其中的完全HAV粒子是通过过滤从HAV感染的细胞的细胞培养物上清液中纯化而来的。
通过如上所述方法获得的完全HAV粒子的纯化制剂可被用作分离成熟的HAV粒子以及产生成熟的HAV粒子的纯化HAV制剂的来源。制剂中不同的HAV粒子形式(病毒体以及原病毒体)可以通过传统的离心作用，诸如蔗糖梯度上的等密度离心、CsCl-梯度或者凝胶层析或者制备性场流分级法分离开来。
根据本发明的另一目的，提供了制备纯化的成熟的HAV粒子制剂的方法。所述方法包括下列步骤提供HAV感染的细胞培养物的细胞培养物上清液，用核酸降解试剂以及蛋白酶处理所述的HAV制剂，从所述的完全HAV粒子的制剂中分离完全的HAV粒子制剂并且分离纯化的成熟HAV病毒体。所述的成熟HAV病毒体可以通过离心作用，诸如等密度离心进行分离。离心作用优选为使用蔗糖-梯度的等密度离心、利用蔗糖垫层的粒化或者离心作用。因此所述方法提供了成熟HAV粒子的纯化的HAV制剂的生产方法，其中成熟的HAV粒子从完全HAV粒子的制剂中分离而来。成熟的HAV粒子的制剂通过过滤以及等密度离心从HAV感染的细胞的细胞培养物上清液获得。所描述的方法简单、有效并且减低了成本，而且提供了在现有技术中尚未描述的纯粹产物。
通过对从生长在不含血清并且不含蛋白的培养基上的细胞培养物开始的特定条件进行组合，利用HAV感染的不含血清以及不含蛋白的细胞培养物的无细胞上清液作为产生纯化HAV的来源，避免了来自细胞和细胞培养基的可能污染物的主要来源。然而，不能期望与微载体结合的细胞能将产生的病毒释放到细胞培养基中，可以利用本发明的方法从所述细胞培养基中有效纯化HAV粒子。通过过滤纯化使得所述方法适合于大规模纯化的方案。另外用核酸降解试剂和蛋白酶处理破坏了所有的高分子量的大分子，然后也通过过滤将大分子除去。
本发明的纯化的HAV制剂不含来自细胞或者细胞培养基的污染蛋白。这通过利用抗宿主细胞蛋白的特异性抗体的蛋白质印迹分析以及测定HAV抗原与制剂中总蛋白量的比例来进行确定。去除来源于细胞的污染核酸的效率通过如美国专利5,858,658描述的残余核酸的高灵敏度定量分析方法来进行确定。也可以使用本领域公知的其它核酸定量分析方法。本发明方法的纯化HAV制剂具有小于约0.5pg的污染核酸/IU HAV抗原。
减毒的HAV为本领域公知的并且降低了传播传染性粒子的风险。然而，在人类疫苗中使用灭活甚至减毒的疫苗病毒提高了疫苗的安全性。根据本发明的一个实施方案，所述方法包括用病毒灭活试剂处理纯化的HAV粒子的步骤。灭活试剂可以为本领域公知的具有灭活活性的任何试剂，诸如福尔马林、BEI、激光、紫外线、化学处理诸如亚甲基蓝、补骨脂素或其任意组合。优选地，用福尔马林灭活病毒。
病毒灭活可以在纯化过程的任一阶段进行，然而最方便地是在最后纯化步骤之前用病毒灭活试剂进行处理，借此从完全的HAV粒子形式的制剂中分离得到成熟的HAV粒子。
根据本发明的这个方面，所述方法提供了完全HAV粒子的纯化灭活HAV制剂的生产方法，其中完全HAV粒子是通过过滤和病毒灭活处理从HAV感染细胞的细胞培养上清液中纯化而来。
根据本发明的另一个方面，所述方法提供了成熟HAV粒子的纯化灭活HAV制剂的生产方法，其中成熟的HAV粒子从是通过过滤和离心作用从HAV感染细胞的细胞培养上清液纯化而来。可以在离心和分离成熟的HAV粒子之前或者之后进行HAV粒子的灭活，优选在离心作用之前进行灭活处理。这就使得通过最后的纯化和分离步骤去除灭活剂的污染残余物成为可能。
根据另一方面，本发明提供了从HAV感染的细胞的细胞培养物上清液中分离完全的HAV粒子的病毒体的方法。此方法包括如下步骤过滤无细胞的细胞培养物上清液的HAV收集物、用核酸降解试剂和蛋白酶处理过滤后的HAV制剂以及分离完全的HAV粒子。分离的完全HAV粒子不含任何HAV的前体多肽，诸如P1或者PX。所述方法不包括除过滤以外的任何其它纯化和分离步骤。
通过如上所述的方法，提供了纯化的HAV制剂，所述制剂由纯化的完全HAV粒子组成，基本上不含HAV的前体多肽P1并且不含来自细胞或者细胞培养物的污染蛋白。该制剂具有小于30pg的污染核酸/IUHAV抗原，并且具有至少5000IU的HAV抗原/mg蛋白。
根据另一方面，本发明提供了从HAV感染的细胞的细胞培养物上清液中分离成熟的HAV粒子的方法。这种方法包括如下步骤用核酸降解试剂和蛋白酶处理来源于HAV感染的细胞培养物的细胞培养物上清液的过滤后的HAV制剂，分离完全的HAV粒子并且进一步分离成熟的HAV病毒体颗粒。在用核酸降解试剂和蛋白酶处理之前过滤无细胞的培养物上清液HAV。成熟HAV粒子的分离优选通过离心作用进行。所述方法不包括任何其它的纯化或分离方法诸如层析步骤。
通过如上所述的方法，提供了成熟HAV粒子的纯化制剂，也就是说不含来自细胞或者细胞培养物的污染蛋白。纯化的成熟HAV病毒体颗粒不含HAV前体多肽P1并且不含HAV原病毒体。该制剂具有小于0,5pg/IU HAV抗原的来自细胞或者细胞培养物的污染核酸，并且具有至少5000IU的HAV抗原/mg蛋白。
该制剂可以进一步包括生理学上可接受的载体和/或稳定剂。
可以把该制剂配制成免疫原性组合物。根据本发明的一个实施方案，免疫原性组合物为HAV粒子的水溶液并且可以直接使用。
纯化的HAV粒子可以用任意各种公知的佐剂混合或者吸附。这种佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝、皂草苷，诸如Quil A，单磷酰基脂质A(MPL)以及3-脱酰基的单磷酰基脂质A(3D-MPL)或者QS21。
根据本发明的一个方面，提供了生产HAV疫苗的方法，所述方法包括如下步骤用核酸降解试剂和蛋白酶处理HAV感染的细胞培养物的上清液的HAV制剂，分离完全的HAV粒子制剂并且将纯化的完全HAV粒子配制在免疫原性组合物中。
根据本发明的另一方面，提供了生产HAV疫苗的方法，所述方法包括如下步骤用核酸降解试剂和蛋白酶处理HAV感染的细胞培养物的上清液的HAV制剂，分离完全的HAV粒子的制剂，从所述完全的HAV粒子制剂中分离纯化的成熟HAV病毒体并且制备包括纯化的成熟HAV病毒体制剂的免疫原性组合物。所述疫苗可以包括已经用病毒灭活试剂处理的纯化的HAV粒子。根据本发明的另一方面，提供了制备包括灭活的HAV粒子的HAV疫苗的方法，所述灭活的HAV粒子可以是纯化的完全HAV粒子或者成熟的HAV病毒体颗粒。因此所述方法包括用灭活剂处理完全的HAV的纯化制剂的步骤。然后通过传统方法从HAV制剂中除去灭活剂。所述灭活剂还可以通过过滤和分离如上所述的灭活的成熟的HAV粒子来除去。在最后一步，制备了包括纯化的灭活的完全或者成熟HAV病毒体制剂的免疫原性组合物。
根据本发明的另一方面，提供了一种HAV疫苗，它包括宿主保护量的纯化的成熟HAV粒子的制剂，所述制剂不含来自细胞或者细胞培养物的污染物。用于配制疫苗的制剂不含HAV前体多肽P1以及HAV原病毒体。
术语“宿主保护量”是指疫苗中病毒抗原的临界保护剂量，其中所述量可以有效地免疫易感的哺乳动物使其抗甲型肝炎病毒感染并且诱导宿主的保护性免疫反应。
本发明的成熟HAV粒子的制剂比已知的可以从市售得到的HAV制剂对试验的动物模型具有更高的免疫原性。获得有效免疫反应所需要的本发明的疫苗制剂中的抗原剂量(IU)比其它疫苗制剂中的低。这至少可以部分地由本发明制剂的更高纯度来解释。另外，该制剂由成熟的HAV粒子构成，所述成熟HAV粒子仅仅由HAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3组成，这些衣壳蛋白含有诱导中和抗体的主要抗原位点。该制剂不包括将减少HAV制剂中免疫原性位点比例的不成熟粒子、前病毒体或者HAV前体多肽。
因此，本发明的疫苗组合物优选包括小于约25IU的HAV抗原/剂，优选地小于约20IU的HAV抗原/剂的宿主保护量的HAV抗原。根据本发明的优选实施方案，疫苗中宿主保护量为约5至约25IU的HAV抗原/剂。然而可以使用更高的浓度。该疫苗组合物中来自细胞的污染核酸的量小于约0.5pg/IU抗原。该疫苗组合物为稳定的，是指组合物中的成熟的HAV粒子没有发生可觉察程度的降解，即在2-8℃保存1年后，与标准参考相比，超过95％的HAV抗原保持了通过抗原ELISA和动物体内的效力研究测定的粒子结构。
由纯化的成熟HAV粒子组成的免疫原性组合物可以进一步包含缓冲液和/或生理学上可接受的载体。该组合物可以包括佐剂。同样显示包含低浓度佐剂的组合物能诱导比包含更高佐剂浓度的组合物更高的抗体和中和抗体滴度(参见实施例5)。因此疫苗组合物可以包括少量的佐剂。疫苗中佐剂的终浓度可以为约0.001％至约0.5％(w/v)，优选地为约0.05至约0.1％(w/v)。佐剂可以为标准佐剂、氢氧化铝或者磷酸铝。免疫原性HAV制剂可以包括诸如免疫刺激剂的其它成分。
根据另一方面，疫苗进一步至少包括来自病原体的第二抗原。该抗原可以来自于对人类来说是致病的病毒或者细菌。
根据一个实施方案，疫苗更进一步包括乙型肝炎病毒抗原。
优选地，HBV抗原为HBV表面抗原(HBsAg)，其中HBV表面抗原选自HBVpreS1-preS2-S(大抗原)、preS2-S抗原(中抗原)或者S-抗原(小抗原)或其混合物。HBsAg可以与纯化的HAV粒子混合以获得HAV/HBV疫苗组合物。HBV抗原可与免疫刺激剂或者与佐剂诸如铝盐或者如上所述的任意其它佐剂组合。
根据另一方面，疫苗可以更进一步包括来源于选自流感嗜血菌、脑膜炎球菌A、B、C、W或者Y、肺炎链球菌、肺炎球菌的病原体的抗原。
在下列实施例中对本发明的优点进行说明。实施例是对本发明的详细说明而非限制其范围。
实施例1通过VERO细胞生产HAV抗原在细菌质粒pHAV/7中克隆来自减毒株HM175/7的基因组的全长cDNA(Cohen等，1987，J.Virol.613035-3039)，用来通过体外转录制备全长基因组RNA。在34℃用体外转录的HAV RNA转染不含血清的VERO细胞以产生不含外来试剂的HAV HM175/7病毒原种。
把VERO细胞(非洲绿猴，Cercopthecus aethiops，肾)用作生产细胞系。细胞获自美国典型细胞培养物保藏中心，马里兰，传代数124，保藏号为ATCC CCL 81。细胞适合于生长在不含血清或者不含血清和蛋白的培养基上，如Kistner等人于1998年(同上文)或者WO96/15231所描述的。为了在不含血清的培养基中生长，使用添加了无机盐、氨基酸、碳酸氢钠和酵母或者大豆提取物的基础DMEM HAM′sF12培养基。不使用任何动物来源的培养基组分来制备工作细胞库。
将一安瓿培养在DMEM培养基中的VERO细胞的工作细胞库(WCB)与Ham′s F12养分混合物以1∶1的比例再悬浮在包含血清的培养基以及不含血清的、补充了大豆或酵母抽提物的培养基中。
通过利用纯化的灰色链霉菌胰蛋白酶(1μg/ml)进行转种以避免动物来源的任何试剂，所述试剂可以包括任何致病性试剂。在扁瓶以及滚瓶中传代培养后，将6-8×107个细胞/克微载体(Cytodex III；Pharmacia)接种在12L的搅拌发酵罐中。细胞在37℃生长共6-8天。控制20％+/-10％的氧饱和度以及pH7.1+/-0.2以及搅拌速度30-60rpm的培养条件。在以6×105到1×106个细胞/毫升的细胞密度接种的第二天，将感染复数(m.o.i.)在0.1和1.0之间的HAV HM175/7病毒悬浮液在34℃的温度下泵入发酵罐中。两小时后开始让病毒吸附，进行培养基灌注。用新鲜的培养基每天更换一半的发酵罐体积。通过筛子将微载体以及附着的细胞保持在发酵罐中。在发酵过程期间，控制pH7.1，O2(30％)，搅拌速度30-60rpm)以及34℃的温度。
为了大规模生产HAV HM175/7病毒，将生物量为1×1011的VERO细胞培养物接种在微载体上并37℃在不含血清的培养基的条件下在100L的发酵罐中进行繁殖。将温度降低到34℃并在随后的发酵周期中细胞数目增加8到10倍。在最后的发酵罐中，用感染复数为0.01到1.0的HAV对细胞进行转染。通过持续灌注细胞培养基，可以在34℃进行感染细胞的繁殖至350天。当在培养基中检测到病毒抗原时，收集包含上清液的病毒并保藏在4℃。在感染后35-45天开始收集细胞培养物的上清液。
实施例2纯化病毒收集物将实施例1的细胞培养物上清液的病毒收集物通过在ProstakUltrafilter 200K上超滤浓缩100倍，然后将缓冲液更换为50mM的Tris缓冲液pH8.0，0.01吐温进行透滤步骤(Prostak 200K，Diafilter)。通过用Benzonase(Sigma)1000U/L(在1mM MgCl2中)在室温下培养Diaretenate 3小时来除去可能存在于制剂中的残余寄主细胞核酸。随后，添加浓度为0.5到5U/ml的纯化的灰色链霉菌(SGT)的胰蛋白酶类微生物蛋白酶，并且在室温下进一步培养保留物24小时。将寄主细胞污染物，即核酸和/或蛋白通过在100K膜上用20mM PBS pH7.4作为缓冲液的渗滤法除去。
实施例3HAV的最初纯化效率使用两种细胞培养收集物在连续发酵过程期间以不同时间间隔对第一个纯化步骤的效率进行研究。在通过超滤/透滤后以及酶处理继之以最终的透滤步骤后，如实施例2所述进行纯化并从原材料提取样品。
A.蛋白质印迹分析在每一过滤步骤期间取出包含至少1000ELISA单位/ml HAV抗原的样品，进行SDS-PAGE并进行银染以观察总蛋白并通过蛋白质印迹分析进行分析以确定HAV特异性抗原。
图1A显示了银染色后各种中间体的蛋白图谱。在原材料和纯化过程的第一中间体中可以检测到广泛的多肽(图1A，泳道1-11)，然而在蛋白酶处理和透滤后只剩下一条轻微的蛋白谱带(图1A，泳道14和16)。
通过银染，HAV特异性衣壳蛋白在原材料和纯化的渗滤保留物中都可以检测到。
利用HAV衣壳蛋白的特异性抗血清进行的蛋白质印迹分析鉴定了HAV特异性抗原(图1B)。可见在纯化过程中除去了HAV前体蛋白(P1)(图1B，泳道1-11)。用蛋白酶处理后，在细胞培养物上清液的原材料中检测到HAV特异性多肽，该多肽不存在于渗滤保留物中，而HAV特异性衣壳蛋白VP1、VP2和VP3不受蛋白酶处理的影响(图B，泳道14和16)。通过银染和蛋白质印迹分析不同的中间体，清楚地证明了纯化过程的效果。
利用因VERO细胞蛋白而产生的抗血清进行的蛋白质印迹分析(图1C)显示出在原材料和纯化中间体中可检测到广泛的主要是高分子量的VERO蛋白。在最终的保留物中，仅仅可检测到少量的VERO细胞污染物(图1C，泳道15-16)。
发现只利用连续过滤步骤的初步纯化过程在除去寄主细胞污染物以及病毒前体蛋白中是卓有成效的。高分子量VERO细胞蛋白通过蛋白酶处理被分解成片段然后通过透滤步骤有效地除去。此外，纯化过程产生传染性HAV粒子的纯化制剂。传染性HAV粒子由三种病毒衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3)组成。通过在病毒的成熟和组装过程中的几个相继的裂解，从单个的多肽前体分子(P1)获得这些蛋白。为了诱导保护性的免疫应答，认为衣壳蛋白必须是折叠的且装配成正确的结构，而且前体蛋白不能引发保护性的免疫应答。已经证明，前体蛋白对处理的反应灵敏并且可以被除去，而病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3则不受蛋白酶的影响。
因此，在HAV疫苗的生产过程中的第一个纯化步骤在去除VERO细胞蛋白以及不成熟的前体蛋白方面效率很高。
B.HAV抗原含量用测试试剂盒E12(Mediagnost，Tübingen，德国)依照厂商的说明进行竞争性EIA。
在稀释缓冲液中对每一样品进行连续稀释并测定100μl的每一样品。利用统计计算程序(Softmax，Molecular Devices)通过四参数分析测定抗原的浓度。
C.总蛋白浓度的测定通过市售的双辛可宁酸(bicinchoninic acid)(BCA)分析(Pierce)，与标准蛋白制剂相比来进行总蛋白含量的确定。
向100μl的每一样品中添加2ml的BCA溶液并在60℃保温30分钟。随后，利用光度计在562nm的波长处测定样品的光密度。利用标准曲线计算蛋白浓度。
D.测定纯化HAV的组织培养感染剂量(TCID50)通过连续的1log稀释在细胞培养基中制备的样品，通过FRhK-4细胞进行TCID50的测定。与生长在微量滴定板上的FRhK-4细胞平行添加100μl的每一连续稀释液8次。
计算截止值，表示为负对照微孔的平均光密度。
所有光密度比截止值高两倍的位置被认为是阳性的。通过根据Poission分布的最大相似法测定TCID50并表示为log10TCID50。
E.利用PCR测定ERO细胞的DNA浓度如US 5,858,658所述，通过定量PCR测定VERO细胞的DNA量。
如表1所示，病毒的传染性(通过TCID50测定的)不受纯化过程的影响，而HAV抗原的量减少了大约50％，在第1批中从485,000IU减少到263,940且在第2批中从490,00减少到216,558。
总蛋白的量在第1批由26,670mg减少到37mg且从在第1批由26,100减少到42mg。VERO细胞的DNA量通过简单过滤法减少了大约9,000倍。在酶处理和渗滤后，在渗滤保留物中检测到2.97μg和6.36μg的VERO细胞DNA。假定20IU相当于一个疫苗抗原剂量，在通过过滤初始纯化后，经计算VERO细胞DNA的量/疫苗剂量分别为590pg和230pg。
表1HAV纯化效果的测定
此外，纯化过程的不同中间体的纯度等级是通过用HAV抗原与总蛋白的相对数量来计算的。如表2所示，纯度等级分别从18.2IU/mg增加到7134IU/mg和从18.8IU增加到5156IU/mg。
表2过滤过程中间体纯度等级的评价
发现在传染性HAV粒子失活之前的过滤方法在宿主细胞污染物的减少方面是稳定和高效的。纯度的等级增加了大约300倍，而VERO细胞DNA减少了大约9000倍。在纯化过程期间HAV抗原的损失，而并非传染性的损失最可能是由于除去了病毒特异性前体蛋白像原聚体和五邻体而致。
因此，在灭活HAV疫苗生产中应用的第一纯化步骤在去除宿主细胞污染物像VERO细胞蛋白质和DNA和不成熟的HAV前体多肽方面是高效的。
实施例4纯化HAV的灭活以及灭活HAV粒子的分离将实施例3的纯化的传染性甲型肝炎病毒制剂通过用0.1％福尔马林在37℃温育120小时来灭活。
灭活的HAV制剂然后在pH7.3的PBS缓冲液中的0-65％蔗糖梯度上进行梯度离心。区带离心后通过蛋白质印迹分析来研究不同组分(组分11到16)，以及0-65％蔗糖梯度的集合峰组分(组分12到14)。
A.通过抗HAV抗体鉴定纯化的HAV通过用特异性多克隆豚鼠的抗HAV衣壳抗体(附图2B)或多克隆豚鼠的抗VPO抗体(附图2B)温育对每一组分进行蛋白质印迹分析而分析HAV抗原。
显示了单一组分11到16(附图2A和B，泳道2-7)以及集合组分12到14(图2 A和B，泳道8)的纯化HAV粒子的蛋白模式。在组分12-14(图2A，泳道3-5和8)中检测到病毒衣壳蛋白VP1，VP2和VP3。利用对VP0的特异性抗血清对各组分进行蛋白质印迹分析，揭示了缺乏VP0前体蛋白且仅仅有衣壳蛋白VP2存在于纯化制剂中(图2B，泳道3-5和8)。因此纯化组分仅仅含有获自细胞培养物上清液的成熟HAV病毒体。
B.通过抗VERO抗体检测纯化的HAV通过与特异性多克隆山羊抗VERO细胞蛋白抗体一起温育通过蛋白质印迹分析对病毒收集物以及每一纯化步骤后的样品进行分析来分析HAV抗原(附图3)。
通过蛋白质印迹分析对初始过滤过程的中间体进行分析清楚地显示了纯化方法的效果。图3显示了利用针对VERO细胞蛋白而产生的抗血清进行蛋白质印迹分析后的中间体样品的蛋白模式。可在纯化方法的原始材料和第一中间体中检测到广泛的多肽(附图3，泳道1-3)，而在蛋白酶处理以及渗滤之后仅留下细微的蛋白带(附图3，泳道4)。在通过例如0-65％蔗糖梯度的最终纯化之后，没有检测到VERO细胞的特异性蛋白(附图3，泳道5)。
纯化方法被证明在去除VERO细胞污染物方面是高效的。通过蛋白酶处理，高分子量的蛋白质被分裂成片段且通过之后的在初始纯化中的渗滤步骤，通过过滤而被除去。和灭活方法一样，通过最终纯化步骤能有效地去除来自核酸降解试剂和蛋白酶处理的残余污染物。
C.通过VERO细胞DNA的PCR鉴定纯化的HAV如US 5,858,658所描述的，对集合组分12到14的纯化成熟HAV粒子制剂进行分析，以分析来自VERO细胞培养物的污染核酸。对VERO核酸的计算显示有少于40pg的VERO核酸/100IU HAV抗原。因此，具有20IU HAV抗原/剂的抗原剂量将具有小于8pg的VERO细胞核酸。
实施例5纯化的成熟HAV粒子的HAV疫苗用磷酸盐缓冲盐水(PBS pH7.3)和用不同浓度的佐剂配制纯化的、灭活的成熟HAV病毒体制剂。作为一个实例，使用佐剂氢氧化铝。以0.05％，0.1％和0.2％(w/v)的最终浓度把氢氧化铝加到纯化的制剂中。测试制剂以测定佐剂对抗原的吸附。连续稀释测试的物质但不改变佐剂的浓度。给由10小鼠组成的测试组中的每一只皮下注射0.5ml的制剂，免疫该动物4周后分析血清的转化率(ED50有效剂量)、抗体滴度和中和活性。结果显示在表3和4中。
表3显示了在不同佐剂浓度时抗原制剂的血清转变比率和ED50值。令人惊讶地发现，在组合物中较低浓度(0.05％)的佐剂对于诱导较高的血清转变率比用较高浓度的佐剂(0.2％)更为有利。因此，对于本发明的成熟HAV粒子的纯化制剂，在低浓度佐剂存在下要使动物50％的血清发生转变只需较少的病毒抗原。
表3用不同浓度的HAV抗原和佐剂免疫小鼠时的血清转变比率和ED50值
表4用不同浓度的HAV抗原和佐剂免疫小鼠时的抗体滴度和中和抗体滴度
表4的结果表明，在免疫原性制剂中相同的抗原浓度依赖于佐剂浓度而诱导不同的抗体滴度。佐剂浓度较低时的抗体滴度高于佐剂浓度较高时的。在相同的HAV抗原浓度和不同佐剂的浓度时诱导的中和抗体滴度是相当的。因此，本发明的含有成熟HAV粒子的纯化制剂的免疫原性组合物在低浓度的佐剂时显示出增加的免疫原性。
含有低浓度的佐剂(0.05％)和不含有任何佐剂的HAV疫苗的比较免疫研究显示在豚鼠表5中。
表5用含有和不含有佐剂的HAV疫苗免疫动物
表3-5的实验结果表明，可显著地减少有效疫苗剂量中的抗原和佐剂浓度来诱导抗HAV感染的保护性免疫应答。甚至，没有任何佐剂的疫苗的免疫原性和效果与含有低浓度佐剂的疫苗的相当。
实施例6本发明的两种已被许可的HAV疫苗的比较A.免疫原性的比较比较本发明的两种已被许可的包含成熟的HAV病毒体的纯化制剂的疫苗与市售的疫苗，VAQTA50U(MERCK)和HAVRIX1440(Smithkline Beecham)的免疫原性，其中所述的成熟HAV病毒体具有15-20IU的HAV抗原含量和0.05％最终浓度的Al(OH)3。疫苗被连续稀释但不改变铝的浓度。用0.5ml的不同疫苗制剂通过皮下给药方式免疫测试组的小鼠。汇集每一组的血清并如实施例5所述测定抗体滴度和中和抗体。
表6显示了用不同疫苗诱导的抗体滴度和中和抗体滴度。当应用本发明的未稀释的疫苗时得到较高的抗体滴度。混合血清的抗体滴度为3541mIU/ml，用本发明疫苗得到的抗体滴度为15-20IU ml。未稀释的已被许可的疫苗VAQTA和HAVRIX能够分别诱导2541mIU/ml和691mIU/ml的滴度。对汇集的血清的中和活性进行的分析证明了用本发明的疫苗诱导了较高的中和抗体滴度。
表6不同疫苗的抗体滴度和中和抗体滴度的比较数据
尽管不同的市售疫苗的抗原含量没有标准化且每个种疫苗的生产具有其自己的测试系统，然而侯选疫苗和市售疫苗的免疫原性可通过免疫实验以及通过血清转变和抗体滴度测定的对免疫应答的有效诱导来进行比较。对比较数据的分析证明了15-20IU浓度的本发明的成熟HAV粒子的纯化制剂和低浓度的佐剂(或无佐剂)能够诱导有效的抵抗HAV的免疫应答。
B.疫苗中HAV粒子的比较通过用抗VP0、抗VP1和抗VP3抗体的单克隆抗体的混合物进行蛋白质印迹分析来比较本发明的HAV制剂与两种市售的疫苗VAQTA和HAVRIX。
如图4所示，本发明的制剂仅仅由成熟的HAV粒子组成，由于检测到VP2是通过蛋白水解裂解从前体多肽VP0获得的并且是成熟病毒体的一部分，而VP0仅仅存在于前病毒体和缺陷型病毒体中。市售疫苗同样包括前病毒体和前原病毒体(preprovirions)，然而其数量大于成熟粒子。这些观察被Armstrong等人的发现所证实(1993，J.Hepatol，820-26)VAQTAHAV疫苗含有3∶1的空的前病毒体和完全成熟的粒子。
实施例7由链霉蛋白酶纯化灰色链霉菌(Streptomyces griseus)胰蛋白酶
A.离子交换色谱将30g的链霉蛋白酶(Boehringer Ingelheim)溶于缓冲液A(0.02吡啶，pH5.0)中，最终浓度为40mg链霉蛋白酶/ml。将25ml的该溶液置于用缓冲液A平衡的CM琼脂糖凝胶C1 6B(Pharmacia)上进行阳离子交换层析。在室温下利用5倍柱体积的缓冲液A(0.02M吡啶)和缓冲液B(0.75M吡啶pH5.0)的线性梯度进行洗脱。
被通过以1∶10的比率混合组分的样品和大豆抑制因子，然后利用S2222进行色谱底物分析来测定所收集的组分抑制特性(例如，1mg大豆抑制因子/100μg蛋白)。结果被表示为每分钟的吸光度单位(ΔA/min)。进一步通过SDS-PAGE并用考马斯染色分析对大豆抑制因子具有最高抑制活性的组分。
通过利用N-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE，在Tris缓冲液中，pH8.0，20mM CaCl2，25℃)作为底物并测定每分钟的吸光率单位进行产色分析来测定胰蛋白酶活性。使用具有13×103U/mg比活度的猪胰蛋白酶溶液(1mg/ml)作为对照参考。比活度被定义为每毫克蛋白的胰蛋白酶酶活单位。结果被概括在表7中。
通过利用3-羧基甲氧基丙酰基-L-精氨酰基L-丙基-L-酪氨酸-对硝基苯胺盐酸盐(S-2586，Chromogenix)进行产色分析来测定糜蛋白酶活性。结果被表示为每分钟的吸光率单位(ΔA/min)。
表7通过离子交换色谱纯化链霉蛋白酶
n.d.未测定表7显示，包含具有类胰蛋白酶活性的蛋白的组分，通过用大豆抑制因子进行的抑制试验测定，可通过离子交换色谱法来纯化而具有比链霉蛋白酶高大约10倍的比活度以及具有大约70％的回收率。然而，蛋白是不稳定的且在SDS-PAGE上不显示为一个单一的条带，而是显示为不同的条带。这指示蛋白发生了断裂和自动裂解。
B.在固定化的苄脒上进行亲和层析在用缓冲液A(50mM Tris，0.5M NaCl pH7.0)平衡的苄脒琼脂糖6B速流(Pharmacia)柱上装载40ml的链霉蛋白酶溶液(75mg/ml，缓冲液A)。用缓冲液B(50mM Tris，0.5M NaCl pH7.0，10mM苄脒盐酸盐pH7.0)，缓冲液C(0.5M NaCl，0.6M精氨酸，pH5.5)或缓冲液D(0.5M NaCl，1M精氨酸，pH5.5)进行洗脱。
如实施例7A所述，利用大豆抑制因子测定所收集的组分的抑制特性，以及胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性。比活度被测定为每毫克蛋白的酶活力单位。
表8通过亲和层析在固定化的苄脒上纯化链霉蛋白酶以及用苄脒洗脱
概括在表8中的结果表明，通过用苄脒进行竞争性洗脱，60％的纯化的链霉蛋白酶的胰蛋白酶样活性得到回收并具有大约140U/μg蛋白的比活度。然而，优选将包含纯化的胰蛋白酶样蛋白酶的组分进一步纯化，且在应用于人的与细胞培养物培养或生物制品生产有关的方法之前除去苄脒。
表9通过亲和层析在固定化的苄脒上纯化链霉蛋白酶并用0.6M精氨酸和1M精氨酸洗脱
由表9的结果可见，当利用含有0.6M精氨酸的缓冲液时，约63％的链霉蛋白酶的初始胰蛋白酶类活性得到回收，而使用含有1M精氨酸的缓冲液时，约71％的活性得到回收。用精氨酸从苄脒亲合载体上洗脱下来的纯化SGT与通过离子交换色谱法或用苄脒从苄脒载体上洗脱下来的SGT相比同样具有较高的比活度。
此外，当使用含有增加的克分子浓度的精氨酸时获得了较高纯度和比活度的产物。
提供上述实施例用来说明本发明然而并非是对其范围的限制。其它对本发明的改变对本领域的普通技术人员来说将是显而易见的并且包括在所附的权利要求书中。所有在这里引用的出版物、专利和专利申请都被引入作为参考。
权利要求
1.一种生产完全的HAV粒子的方法，包括下列步骤用核酸降解试剂和蛋白酶处理来自HAV感染的细胞培养物的细胞培养物上清液的HAV制剂，以及分离所述的完全的HAV粒子的纯化制剂。
2.根据权利要求1的方法，它进一步地包括在用所述的核酸降解试剂和蛋白酶之前处理浓缩所述的细胞培养物上清液。
3.根据权利要求2的方法，其包括通过过滤来浓缩所述的细胞培养物上清液。
4.根据权利要求1到3中任意一项的方法，其中所述的核酸降解试剂是一种酶。
5.根据权利要求4的方法，其中所述的酶是一种脱氧核糖核酸酶。
6.根据权利要求1到5中任意一项的方法，其中所述蛋白酶是一种微生物蛋白酶。
7.根据权利要求6的方法，其中所述的蛋白酶是链霉蛋白酶或其酶促活性组分。
8.根据权利要求6的方法，其中所述的蛋白酶是纯化的灰色链霉菌胰蛋白酶。
9.根据权利要求1到8中任意一项的方法，其中所述的细胞培养物是一种VERO细胞培养物。
10.根据权利要求1到9中任意一项的方法，其中所述的细胞被培养在不含血清或不含血清和蛋白质的培养基上。
11.根据权利要求1到10中任意一项的方法，其中通过过滤来分离所述纯化的完全HAV粒子的制剂。
12.根据权利要求1到11中任意一项的方法，其中所述的完全HAV粒子的制剂具有小于大约30pg的污染核酸/IU HAV抗原。
13.根据权利要求1到12中任意一项的方法，其中所述的完全HAV粒子的制剂具有至少大约5000IU的HAV抗原/毫克蛋白。
14.根据权利要求1到13中任意一项的方法，它进一步包括用一种病毒灭活试剂处理完全HAV粒子的制剂的步骤。
15.根据权利要求1到14中任意一项的方法，它进一步包括从所述的完全HAV粒子的制剂中分离纯化的成熟HAV病毒体的步骤。
16.根据权利要求15的方法，其中所述的制剂基本上不含来自细胞或细胞培养基的污染蛋白。
17.根据权利要求15或16的方法，其中所述制剂具有小于大约0.5pg的污染核酸/IU HAV抗原。
18.根据权利要求15到17中任意一项的方法，它进一步包括用一种病毒灭活试剂处理纯化的HAV粒子的步骤。
19.一种不含HAV前体多肽和污染的细胞或细胞培养物蛋白的完全HAV粒子的制剂。
20.根据权利要求19的制剂，其中所述制剂具有小于大约30pg的污染核酸/IU HAV抗原。
21.根据权利要求19或20的制剂，其中所述制剂具有至少大约5000IU的HAV抗原/毫克蛋白。
22.根据权利要求19的制剂，它由灭活的、纯化的完全HAV粒子组成。
23.一种纯化的成熟HAV粒子的制剂，它不含有HAV前体多肽和污染的细胞或细胞培养物蛋白。
24.根据权利要求23的制剂，它不含HAV前病毒体。
25.根据权利要求23或24的制剂，其中所述制剂具有少于大约0.5pg的来自细胞或细胞培养物的的污染核酸/IU HAV抗原。
26.根据权利要求23或24的制剂，它由灭活的、纯化的成熟HAV粒子组成。
27.一种生产纯化的完全HAV粒子制剂的方法，它包括通过过滤从HAV感染细胞的细胞培养物的上清液中纯化完全的HAV粒子。
28.根据权利要求27的方法，它进一步地包括用一种病毒灭活试剂处理所述的制剂。
29.一种生产纯化的成熟HAV粒子制剂的方法，它包括通过过滤和离心从HAV感染的细胞的细胞培养物的上清液中纯化成熟的HAV粒子。
30.根据权利要求29的方法，它进一步地包括用一种病毒灭活试剂处理。
31.一种从HAV感染的细胞的不含细胞的细胞培养物上清液中分离完全的HAV粒子的方法，包括下列步骤用核酸降解试剂和蛋白酶处理获自HAV感染的细胞培养物的上清液的HAV制剂，以及分离所述的完全HAV粒子的纯化制剂。
32.根据权利要求31的方法，其中所述的制剂不含HAV前体多肽。
33.一种HAV感染的细胞的细胞培养物上清液的HAV收集物中分离成熟的HAV粒子的方法，包括下列步骤用核酸降解试剂和蛋白酶处理来自HAV感染的细胞培养物的上清液的HAV制剂，分离所述的完全HAV的纯化制剂，以及从所述的完全HAV粒子的制剂分离由成熟的HAV粒子组成的制剂。
34.一种用于生产HAV疫苗的方法，包括下列步骤用核酸降解试剂和蛋白酶处理来自HAV感染的细胞培养物的细胞培养物上清液的HAV制剂，分离所述的完全HAV粒子的纯化制剂，以及制备含有由纯化的、完全的HAV病毒体组成的制剂的免疫原性组合物。
35.一种用于生产HAV疫苗的方法，包括下列步骤用核酸降解试剂和蛋白酶处理来自HAV感染的细胞培养物的上清液的HAV制剂，分离所述的完全HAV粒子的纯化制剂并从所述的完全HAV粒子的制剂中分离纯化的成熟HAV病毒体，以及制备含有由纯化的、成熟HAV病毒体组成的制剂的免疫原性组合物。
36.根据权利要求35的方法，其中所述的疫苗基本上不含有来自细胞培养物的污染蛋白。
37.一种用于生产灭活的HAV疫苗的方法，包括下列步骤用核酸降解试剂和蛋白酶处理来自HAV感染的细胞培养物的上清液的HAV制剂，分离所述的完全HAV粒子的纯化制剂并从所述的完全HAV粒子的制剂中分离纯化的成熟HAV病毒体，以及制备含有制剂的免疫原性组合物，其中在分离成熟的HAV病毒体颗粒之前或之后用灭活试剂处理所述的HAV制剂。
38.一种含有宿主保护量的权利要求23到26中任意一项的成熟HAV粒子制剂的HAV疫苗。
39.根据权利要求38的疫苗，其中所述的制剂不含HAV前体多肽和HAV前病毒体。
40.根据权利要求38或39的疫苗，其中所述的宿主保护量是小于大约25IU的HAV抗原/剂。
41.根据权利要求38或39的疫苗，其中所述的宿主保护量为大约10至大约25IU的HAV抗原/剂。
42.根据权利要求38到41中任意一项的疫苗，它含有一种免疫刺激试剂。
43.根据权利要求38到42中任意一项的疫苗，它进一步含有乙型肝炎病毒抗原。
44.根据权利要求38到43中任意一项的疫苗，它进一步含有一种来自病毒或细菌性病原体的抗原。
全文摘要
本发明提供了从感染的细胞培养物的上清液中纯化甲型肝炎病毒以及制备纯化的HAV抗原制剂的方法。本发明也涉及一种包含一种制剂的HAV疫苗组合物，其中所述的制剂含有一定量的足以在哺乳动物中诱导保护性免疫应答的纯化的成熟HAV粒子。
文档编号C12N15/09GK1617741SQ02827827
公开日2005年5月18日 申请日期2002年12月10日 优先权日2001年12月10日
发明者C·陶尔, H·迈尔, A·米特雷尔, N·巴雷特 申请人:巴克斯特健康护理股份有限公司