具有脂肪酶活性的酯酶的制作方法

专利名称：具有脂肪酶活性的酯酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂肪酶和酯酶在生物转化过程中作为催化剂的应用。它特别涉及在这些过程中昆虫酯酶和脂肪酶，及其突变体的应用。本发明可以应用于包括水解、酯化、酯基转移(transesterification)、酯交换(interesterification)或酰化反应的任意过程中。本发明还可以应用于化合物的酶分解反应从而得到旋光化合物，并且特别的，但不是唯一的用于具有疏水部分如拟除虫菊酯和脂肪酸酯的底物。
背景技术：
脂肪酶和酯酶的工业上的潜力包括它们的水解、酯化、酯基转移以及酰化活性。Kazlauskas和Bornscheuer(1998)，Phythian(1998)，Anderson et al.(1998)，Jaeger和Reetz(1998)，Pandey et al.(1999)以及Villeneuve et al.(2000)中综述了脂肪酶和酯酶所催化的工业反应，这些参考文献每一篇所公开的内容在此以其全文并入参考。
主要涉及脂肪酶和酯酶水解活性的应用包括许多底物，如甘油三酯，脂肪族的、酯环族的、二环的和芳香族的酯以及甚至是基于有机金属夹心(organometallic sandwich)化合物的酯。传统应用包括家用和工业用洗涤剂。其它工业应用包括制革(leather tanning)、食品加工(包括果汁、焙烤食品、蔬菜发酵和强化奶(dairy enrichment))以及清除造纸工业所生产出的纸浆中的树脂(pitch)。现在也应用于制药和类药剂营养品(neutraceuticai)部门，包括多种肥胖病的治疗。也应用于生物传感器，特别是用于医学领域以及食品和饮料工业中确定三酰甘油特别值得关注的是近来在多种生物转化中利用脂肪酶或酯酶的水解能力获得用于精细化工、制药工业和农用化学品工业的新的和/或手性的结构单元或产品。在这些工业产品中，对区域(regio)纯度和手性纯度的要求日益增加。在1995年，治疗总的销售额估计达到1500亿美元，其中的600亿美元来自手性化合物。销售额超过10亿美元的手性药物包括羟氨苄青霉素(一种抗生素)、卡托普利(captopril)(一种血管紧张素转化酶抑制剂)和促红细胞生成素(造血生长因子)。通常，在所给的药物或农业化学化合物中，仅有一种对映体具有所需要的作用，但是管理权威机构对所有有潜力新药物中两种/所有手性形态的评价的关注正日益增加。有时可选择的形态实际上可能具有非所需的副作用，就象现在已经出现的萨力多胺(thalidomide)的例子。在20世纪90年代，只有大约25％的医药品是对映体纯的(enantiomerically pure)，但是在下一个十年，半数以上的新产品的工业设计都需要是手性纯的。
在考虑这些酶水解活性下的一个应用实例是包括拟除虫菊酯杀虫剂的农用化学品的手性生物转化，其中这些羧酸酯杀虫剂中必需数量的醇和酸结构单元可以通过对映体特异性水解从外消旋起始原料以高产率和高纯度产生(Hirohara和Nishizawa，1998；Liese和Filho，1999)。这种应用实例在美国专利No’s 5,180,671、4,985,364和6,207,429中也有描述。精细化学或制药工业中酯酶和脂肪酶能够用于酯外消旋物的动力学拆分的其它实例包括苯基缩水甘油酯(地尔硫卓(diltiazem)，一种心血管药物的前体)，缩水甘油丁酸酯，和用于合成Trinems型β-内酰胺抗生素的(1S-2S)-反-2-甲氧基环己醇。美国专利No.6,187,936中记载了一种通过酶催化的氨基醇酯交换反应而进行的3-苯基缩水甘油酸酯酶动力学拆分的方法，所述公开内容并入交叉参考。美国专利No.5,571,704公开的内容并入参考，其描述了在一种动物或微生物来源的脂肪酶以及一种与使酸酯化的醇不同的醇存在的条件下，通过将一种酯的对映体混合物进行对映体酶酯基转移反应而制备(2R，3S)-3-(4-甲氧苯基)-环氧丙酸的酯。美国专利No.5,750,382，它所公开的内容也并入参考，其描述了一种在酰基供体存在的条件下，利用脂肪酶对一种醇的外消旋混合物进行处理而生产旋光2-烷氧基环己醇衍生物的方法。
值得关注的是水解作用的手性特异性能够通过改变例如有机溶剂的使用和其它反应条件而被改变。因此，一种特定的脂肪酶可以被用在完全不同手性特异性的反应中(Rubio et al.(1991)；Kazlauskas和Bornscheuer，(1998)；Villeneuve et al.(2000)，以及Berglund(2001))。
此外，对有机溶剂的条件进行适当处理，正向的水解反应被抑制，同时逆向的酯化反应占主导(参见，Villeneuve et al.，2000；Berglund2001)。根据酶和反应条件，这种逆向反应可能会也可能不会是区域-或手性特异的，并且对于选择性的和非选择性的酯化反应有着重要应用。
作为非区域-选择性酯化的例子，白色念珠菌(Candida albicans)β-脂肪酶(CALB)用于制备均相(homogeneous)甘油三酯特别有效。这是因为它能够酰化甘油的仲羟基和伯羟基从而得到例如长链ω-3型多不饱和脂肪酸甘油三酯。另一种需要纯系产物的应用包括通过多种短链醇与多种脂肪酸进行酯化反应而生成生物柴油(biodiesel)。见例如，专利No’s5,697,986和5,288,619，其内容并入作为交叉参考。
然而，最近大多数注意集中在脂肪酶和酯酶在化学、区域和立体选择性酯化反应中的应用。这种选择性合成对于制药和类药剂营养品精细化学以及农用化学品工业的重要性记载在上述关于酯酶和脂肪酶介导的水解反应的讨论中。对于它们的酯化反应是同样正确的。对映体选择性酯化对于使用手性底物和动力学拆分外消旋体都很重要。值得注意的是，尽管在酯化和水解反应中单独的酶类物质通常倾向相同的前手性基团，但是这两种反应能够用来生成相反的对映体。例如，通过一些脂肪酶进行2-苄甲基甘油的乙酰化反应生成(S)-一乙酸酯，而通过相同的酶进行双乙酸酯的水解反应生成(R)-一乙酸酯，即使在这两种情况下它们均在前-R位发生反应(Kazlauskas和Bornscheuer(1998)及其参考文献)。
使用正反应或逆反应动力学拆分外消旋体的主要局限性在于最大可能的转化率为50％。然而，这些方法的效率正在逐步提高。在下面的内容中将描述基于诱变改善选择性的改进以及用于增强有机溶剂中的活性和稳定性的新固定技术。另一个改良包括动态动力学拆分在，其中使用第二催化剂以诱导不被酶接受的对映体的外消旋化。在一些情形中，使用了必须与脂肪酶/酯酶相容的过渡金属催化剂。
酯基转移是指在酯和酸(酸解)，酯和另一种酯(酯交换)，或酯和醇(醇解)之间交换酰基的过程。在商业上相当值得关注的是酯酶和脂肪酶催化的酯基转移生产，例如贵重的食品。一个例子包括让浓缩的牛奶和奶油产生奶香味。另一个例子包括利用酯的交换改进蔬菜油使其达到高工业品质。Lever/Unilever已经就脂肪和甘油酯的酯交换获得了一系列的专利，例如美国专利No’s 4,275,081和4,863,860，其内容并入参考。这种方法所生成的酯交换的脂肪适合用于乳状液和其它基于脂肪的食品如人造黄油、人造奶油和冰淇淋。
涉及聚合物的生产的脂肪酶/酯酶的一系列值得关注的应用是开发它们的水解、酯化或酯基转移的能力。例如，聚酯可以通过连续的双官能酯和醇的酯化和酯基转移、双官能单体的自缩合以及内酯的开环聚合生产(Chaudhary et al.1997及其参考文献)。美国专利No.5,478,910，其全文并入参考，它描述了一种生产聚酯的方法，所述方法包括一种有机二醇与有机二酯或有机二羧酸在超临界流体和固体酯酶(优选脂肪酶)存在的条件下发生反应。并入参考的美国专利No.5,962,624描述了一种通过多羟基化合物在有效量的脂肪酶存在的条件下反应来制备线性聚酯的方法，所述多羟基化合物包括至少两个伯醇基及至少一个仲醇或氨基基团和一个二羧酸或一个二羧酸酯。多羟基化合物部分的二级OH或氨基未发生反应。
酯酶和脂肪酶作为酰化剂的潜力来自于它们的两步涉及一种酰化酶中间体的反应机制。在正反应(水解)中，反应仅是水酰化。对于逆反应(酯化)，它是一种醇的酰化。然而许多酶在不必含氧的情况下酰化亲核体而不是水，或者酯化酰基供体而不是醇。然而过去的焦点一直集中在作为酰基供体的前手性醇，现在所关注的是更大范围的化合物包括二醇、α-和β-羟基酸以及许多其它化合物。
白色念珠菌β-脂肪酶说明了许多关于交替酰化(alternativeacylation)的潜力。因而，它接受氨基、过氧羟基和硫醇基团作为亲核体，而不是水或醇，并且它能够用于制备旋光酰胺或溶解手性胺。使用这种酶的方法已经被描述用于制备纯β-氨基酸和R-胺。该酶催化羧基酯、甘油三酯、芳香酯、β-酮酸酯、α-β不饱和酯和丙烯酸酯(acryl ester)的氨解。已经制备了N-酰基氨基酸和N-酰基氨基酸酰胺，而且也有极大的可能制备出碳酸盐和氨基甲酸盐。特别是后者对制药工业具有极大价值。然而当前的化学合成包含一些明显毒性的试剂，脂肪酶介导的合成使用，例如乙烯基碳酸盐或碳酸肟。
酰化方法的例子是美国专利No.5,210,030，其描述了通过使用固定化脂肪酶、酰基供体和干燥的非羟基有机溶剂进行免疫霉菌素(immunomycin)的选择性酰化；美国专利No.5,387,514，其描述了通过使用乙烯酯和一种固定在聚苯乙烯树脂上的脂肪酶对醇进行酰化的方法；美国专利6,261,813，其描述了一种衍生具有羟基基团的化合物的方法，所述方法是使用双官能酰基供体在脂肪酶存在的条件下通过背对背(back to back)酰化来形成活化的酰基酯或碳酸盐，随后其在脂肪酶存在的条件下来被用于酰化一种亲核体；以及美国专利No.5,902,738，其描述了在酰化剂、有机溶剂和脂肪酶存在的条件下通过酰化一种化合物来制造用于生产维生素A的前体的方法。
许多关于酶的有用的反应特别依赖于使用有机溶剂，在这些溶剂中催化速度能够被减慢。对此问题的解决包括在无机基质如硅胶上的固定。它能够通过吸附或共价交联来完成。用于固定的另外方案包括交联的酶晶体、逆胶束和脂质或表面活性物质包被的酶。多种可选方案记载在(Kazlauskas和Bornscheuer，1998；Villeneuve et al.2000；以及Berglund 2001)。
除了操纵处理反应条件(’溶剂工程’(solvent engineering))，还可能通过遗传工程来改变对映选择性。两种不同的方法已经被测试；定点诱变和体外进化。前者依赖于蛋白质结构和底物的交互作用的现有经验或推论知识从而得到预知效果的突变。这通常称为推理方案(rationaldesign)，而且在酯酶和脂肪酶的方案中，超过一打的相关羧基/胆碱酯酶和脂肪酶的三级结构的经验信息很有帮助。后者不必使用这样的现有信息，但是需要通过多种突变的选择积累来提高所需要的效果，无论在靶基因/酶系统或其区域中。现在有一些新的影响酯酶/脂肪酶对映特异性(enantiospecificity)的两种方法的实例(参见Villeneuve et al.2000；Svendsen 2000；以及Berglund 2001作为回顾)。
通过推理方案改变对映特异性的最好的证据包括在sn-1(3)区域选择性米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶(ROL)的活性位点之内的一个底物结合位点(Scheib et al.1998)。容纳sn2取代基的ROL疏水部分(hydrophobic patch)中的258残基被证实对于triradylglycerols水解的立体专一性非常重要，而在同样疏水部分的254残基的作用很小。在这个例子中，突变体的经验行为与经过推理方案原理的预知行为十分一致。然而在另一个定点诱变的实例中，经验行为与预知的不同。在包括来源于洋葱伯克霍尔德氏菌(Pseudomonas cepacia)脂肪酶PS的例子中(Hirose et al.1995)，尽管没有一个单独突变有显著的作用，但是1，4-二氢吡啶水解的立体专一性在一种221、266和287位点的三元突变体中发生反转。
通过体外进化来改变对映特异性的进一步证据包括一种铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)脂肪酶(PAL)，其与上述的脂肪酶PS十分相关(Liebeton et al.2000)。经过四轮进化之后，突变体被挑选出来，其已经为模型底物2-甲基癸酸p-硝基苯酚酯的水解而充分改变了对映特异性。突变体酶具有五种不同的突变，所有突变均远离酶的底物结合位点和结合的底物的立构中心。相反，它们位于、或接近环，该环参与位于活性位点边缘的从“关闭的”到开放“盖(lid)”构型的酶的转换。
现在，一些酯酶和较多的脂肪酶应用在工业上，然而直到本发明问世，它们没有一个涉及昆虫酯酶或脂肪酶的这种应用。
双翅目昆虫α-羧基酯酶簇(carboxyl esterase cluster)是羧基/胆碱酯酶多基因家族中的一组系统发育相关基因，其还通常在基因组中物理的紧密连接(Oakeshott et al.，1999)。来自果蝇(Drosophila)，绿蝇(Lucilia)和苍蝇(Musca)属的更高级的双翅目物种中的这个簇的分子特征已经明确。由于突变带来了簇对OP杀虫剂的抗性图谱，所以它在过去十年倍受关注(Newcomb et al.，1997；Campbell et al.，1998；Claudianos et al.，1999)。它在羧基/胆碱酯酶多基因家族(附图1)系统发育分析中形成了一种不同的副进化枝(sub-clade)。至今为止的鉴定的进化枝上仅有的其它成员是其它昆虫羧酸酯酶突变体，这些突变体也暗示具有OP抗性中(附图1)。这些包括了低等双翅目(蚊)、半翅目(蚜虫)和膜翅目(黄蜂)的基因/酶类。因此，很有可能这种与果蝇α-酯酶簇具有至少大约30％同一性的羧酸酯酶的进化枝存在于整个昆虫纲除了被广泛用作判断羧酸酯酶活性的能够在体外水解简单的、水溶性的、合成的酯如丁酸甲酯和乙酸萘酯，人们很少知道这些羧酸酯酶的天然(即非OP杀虫剂)底物。它们的羧酸酯酶活性在已经获得OP水解酶活性的突变体中被严重破坏。
本发明已经令人惊讶地发现，昆虫酯酶和脂肪酶如α-羧酸酯酶进化枝中的那些及其突变体，也具有抗包括脂肪酸酯，例如4-甲基伞形酮棕榈酸酯(4-methyl umbelliferyl palmitate)以及非脂肪酸疏水分子例如拟除虫菊酯的多种大的和疏水的羧酸酯的活性。
发明概述第一方面，本发明提供了一种基于酶的生物催化方法，其中酶是一种昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体。
脂肪酶通常被认为通过简单酸部分(simple acid moieties)和复合醇部分亲近(favour)底物，而酯酶通常被认为是通过复合酸和简单醇(simple alcohol moieties)部分来亲近底物(参见，例如，Phythian，1998)。昆虫酯酶或脂肪酶如α-羧酸酯酶进化枝中的那些及其突变体在容纳简单或复合酸或醇部分时是与众不同的。因此，上述的昆虫酯酶和其突变体可以被认为是酯酶或脂肪酶。
此外，象一些其它的脂肪酶和酯酶，这些昆虫酯酶和脂肪酶显示出高度的区域和立体特异性。而且，它们的区域和立体特异性能够通过简单的氨基酸变化而在性质上发生改变。这些突变能够改变其酸和醇基团的立体特异性。因此它们有潜在的广泛用途，现在正在开发用于基于脂肪酶或酯酶的生物催化作用。
在第一方面优选的实施方案中，昆虫酯酶或脂肪酶是酶的羧基/胆碱酯酶多基因家族中的一员。更优选地，昆虫酯酶或脂肪酶来源于这个多基因家族中的α-羧酸酯酶进化枝(Oakeshott et al.，1999)。甚至更优选地，昆虫酯酶或脂肪酶是在这个多基因家族中形成副进化枝的α-羧酸酯酶簇中的一员(Oakeshott et al.，1999)(图1)。形成这种副进化枝的酯酶或脂肪酶至少包括可以分离自双翅目、半翅目和膜翅目种类的α-羧酸酯酶。在这种副进化枝中发现的特定的酶包括，但不限于，E3、EST23或E4酯酶或脂肪酶。然而，来自于其它昆虫种类的E3、EST23或E4的定向同源物(orthologous)也可以用于本发明的方法中。
优选地，α-羧酸酯酶可以从双翅目中分离得到。更优选地，a-羧酸酯酶簇来自包括果蝇、绿蝇和苍蝇属的更高级的双翅目(Oakeshott etal.，1999)。因此，用于本发明的优选的α-羧酸酯酶是E3酯酶(SEQ IDNO1)，其分离自铜绿蝇(Lucilia cuprina)，或EST23酯酶(SEQ ID NO2)，其分离自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。
在更优选的实施方案中，突变体昆虫酯酶或脂肪酶具有发生在活性位点的氧离子空穴(oxyanion hole)、酰基结合口袋(acyl binding pocket)或阴离子位点区域或其组合的突变。
在更优选的实施方案中，突变体α-羧酸酯酶选自由E3G137R，E3G137H，E3W251L，E3W251S，E3W251G，E3W251T，E3W251A，E3W251L/F309L，E3W251L/G137D，E3W251L/P250S，E3F309L，E3Y148F，E3E217M，E3F354W，E3F354L和EST23W251L组成的组中。优选地，突变体α-羧酸酯酶是E3W251L，E3F309L，E3W251L/F309L或EST23W251L。
在第一方面另一个优选的实施方案中，a-羧酸酯酶，或其突变体，具有选自由下列序列组成的组中的序列i)如SEQ ID NO1所示的序列，ii)如SEQ ID NO2所示的序列，iii)如SEQ ID NO3所示的序列，及iv)一种序列，其与与i)至iii)的任意一种至少40％相同，其能够水解疏水酯。更优选地，该多肽与与i)至iii)中任意一种至少50％相同，更优选至少60％相同，更优选至少70％相同，更优选至少80％相同，更优选至少90％相同，更优选至少95％相同，甚至更优选至少97％相同本发明的生物催化方法由下列反应式组成或包括下列反应式 其中
R，R2和R3是相同的部分Z，或R是部分Z的立体异构体的混合物，R2是部分Z的立体异构体，R3是富含另一种部分Z的立体异构体的立体异构体的混合物；R1，R4和R5是相同的部分Y，或R1是部分Y的立体异构体的混合物，R5是该部分的一种立体异构体及R4是富含另一种部分Y的立体异构体的立体异构体的混合物；Z和Y，可以相同也可以不同，可以是任何烃部分；和X是一种亲核基团。
Z和Y可以选自由下列组成的组中取代的或未取代的，饱和的或不饱和的直链或有支链的无环烃或任意被一个或多个杂原子阻断的无环烃；取代的或未取代的，饱和的或不饱和的稠合多环烃；取代的或未取代的，饱和的或不饱和的桥烃；取代的或未取代的，饱和的或不饱和的螺环烃；取代的或未取代的，饱和的或不饱和的集合环；取代的或未取代的，饱和的或不饱和的，桥或非桥杂环系统；和取代的或未取代的，饱和的或不饱和的，螺环或非螺环，桥或非桥的稠合杂环系统。
Z和Y非限制实例是αβ不饱和羰基、酮、醛、酸、芳香基、酚、氰基-s环氧化物、α羟基酸、氨基、多羟基化合物和氨基酸。
因为存在一个平衡，因此可以选择其中正反应或逆反应占主导的条件。
本发明的方法可以在正反应占主导的条件下进行。
在此情况下，本发明的方法可以用于化学的-、区域的或立体的选择性水解反应。例如，本方法可以用于从羧酸酯立体异构体混合物中拆分一种立体异构体。这些立体异构体可以是对映体或位置立体异构体。
在一个特殊的实施方案中，本发明的方法可以用于旋光拆分一种(R)-酯化合物和一种(S)-酯化合物的混合物，包括以下步骤
(a)将一种昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体，与该混合物接触以通过立体选择性水解(R)酯化合物和(S)酯化合物中的一种而获得一种旋光化合物或一种旋光醇化合物；以及(b)回收一种旋光化合物，该化合物选自由未被水解的旋光酸化合物、旋光醇化合物和旋光酯组成的组中。
该方法可以在逆反应占主导的情况下进行，在此情况下，本发明的方法可以用于酰化一种化合物R5XH，其中R5和X如上述。
在这种情况下，本发明的方法可以用于化学的-、区域的-或立体选择性的酯化反应。例如，它可以利用纯的起始化合物或起始化合物的外消旋混合物，即酯和R5XH来生产一种旋光酯。该立体异构体可以是对映体或位置立体异构体。
本发明的方法还可以是酯基转移反应，例如，一般表述如下 或 本发明的方法可以是酯交换反应(酯基互换(ester interchange))，例如，一般表述如下
该方法可以在底物上进行，该底物是一种具有亲水和/或疏水部分的酯。该酯可以是一种疏水羧基酯。疏水部分可以在酯中的酸和/或醇残基中。疏水部分可以是，例如C3到C36或更多的烃。疏水部分可以是包含疏水环基如一个或多个碳环的部分，其可以是饱和的或不饱和的。这种疏水部分可以是拟除虫菊酯醇的残基。
本发明的方法可以用于从一种光学异构体混合物中生产一种旋光酸或醇。在酸的旋光拆分的情况下，底物可以是酸的单酯，如酸的C1-C4烷基酯。在醇的旋光拆分的情况下，底物可以是醇的单酯，如醇的C1-C4烷基酯。酸可以是一种取代的或未取代的环丙烷羧酸。醇可以是取代或未取代的苯氧苄醇。例如，本发明的方法可以用于生产用于合成拟除虫菊酯杀虫剂的拟除虫菊酯酸或拟除虫菊酯醇的旋光异构体。拟除虫菊酯是产自除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)的花的天然除虫菊酯的合成类似物。对它们结构的修饰所得到的化合物保留了天然产物本身的适度的脊椎动物毒性，同时成为更稳定及更有效的杀虫剂。拟除虫菊酯可以是I型拟除虫菊酯或II型拟除虫菊酯，I型拟除虫菊酯化合物(如苄氯菊酯(permethrin))不同于II型拟除虫菊酯化合物，因为II型化合物在苯氧苄基部分的α-碳原子上有一个氰基。
拟除虫菊酯的例子包括，但不局限于这些化合物；苄氯菊酯，cyloprothrin，，氰戊菊酯，顺式氰戊菊酯，氟氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，d-fenothrin，cyfenothrin，丙烯菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯，四溴菊酯，胺菊酯，苄呋菊酯和氟氯氰菊酯。
本发明的方法具有广泛的应用，这些应用在前面的“发明背景”中已经描述过，其中昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体用作催化剂。
因此使用酯酶或脂肪酶的本发明方法的应用包括家用或工业用洗涤剂；制革；食品加工(包括果汁，焙烤食品，蔬菜发酵和强化奶)；清除造纸工业所生产出的纸浆中的树脂；制药和类药剂营养品部门以及在生物传感器方面的应用也显现出来，特别是用于医学领域以及食品和饮料工业确定三酰甘油；在精细化工、制药和农用化学品工业中，利用生物转化获得新的和/或手性的结构单元或产品，特别是那些基于区域-和手性纯度的产品；农用化学品工业的手性生物转化，包括拟除虫菊酯杀虫剂，其中需要一定数量的这些羧基酯杀虫剂的醇和酸的结构单元；酯酶和脂肪酶催化的酯基转移反应，用于生产例如贵重的食品，包括浓缩的牛奶和奶油中的乳品香料；利用酯交换(ester exchange)去修饰蔬菜油使其达到高工业品质，包括适合用于乳剂和其它基于脂肪的食品如人造黄油、人造奶油和冰淇淋的酯交换的脂肪；聚合物的生产，例如，聚酯可以通过连续的双官能酯和醇的酯化和酯基转移、双官能单体的自缩合作用以及内酯的开环聚合生产；生产包括生物柴油的生物燃料；和酰化反应。
优选的是，该方法是在含有液体的环境中进行。
昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体，可以通过任何适宜的方式提供。这包括在有或没有载体或赋形剂等的情况下直接提供昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体。昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体，也可以以宿主细胞的形式提供，如转化的原核生物或真核生物细胞，典型的是微生物如细菌或真菌，该宿主细胞表达了一种编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的多核苷酸。
昆虫酯酶或脂肪酶或其突变体也可以以在一种聚合海绵体或泡沫的形式提供，该泡沫或海绵体包含被固定在一种聚合的多孔载体上的昆虫酯酶或脂肪酶或其突变体。
优选的多孔载体包含聚氨基甲酸酯。
在一个优选的实施方案中，海绵体或泡沫进一步包含植入多孔载体或与多孔载体整合成一体的碳。
值得注意的是，在本发明的方法中使用表面活性剂可以释放出潜在的底物，特别是那些来源于任何例如样品沉积物的疏水性物质。从而提高本发明方法的效率。因此在另一个优选的实施方案中，该方法包含表面活性剂。更优选的是，该表面活性剂是生物表面活性剂。
在另一个方面，本发明提供了一种用于生成和选择能够水解疏水酯的酶的方法，该方法包括(i)将一种或多种突变引入到昆虫酯酶或脂肪酶，或者已经发生了突变的昆虫酯酶或脂肪酶中，并且(ii)确定突变体昆虫酯酶或脂肪酶水解疏水酯的能力。
优选地，疏水酯是一种脂肪酸酯。
优选地，一种或多种突变能够提高酯酶或脂肪酶的水解活性和/或改变酯酶或脂肪酶的立体专一性。
优选地，昆虫酯酶或脂肪酶是一种α-羧酸酯酶。
优选的，α-羧酸酯酶具有一种序列，所述序列选自由下列序列组成的组中i)如SEQ ID NO1所示的序列，ii)如SEQ ID NO2所示的序列，iii)如SEQ ID NO3所示的序列，和iv)一种序列，其与i)至iii)的任意一种至少40％相同。更优选地，该序列与i)至iii)中任意一种至少50％相同，更优选至少60％相同，更优选至少70％相同，更优选至少80％相同，及更优选至少90％相同，更优选至少95％相同，甚至更优选至少97％相同。
优选地，一种或多种突变发生在酯酶或脂肪酶选自由氧离子空穴、酰基结合口袋和阴离子位点的区域内。
优选地，所述突变是点突变。
优选地，已经被突变的昆虫酯酶或脂肪酶选自由E3G137R，E3G137H，E3W251L，E3W251S，E3W251G，E3W251T，E3W251A，E3W251L/F309L，E3W251L/G137D，E3W251L/P250S，E3F309L，E3Y148F，E3E217M，E3F354W，E3F354L，和EST23W251L组成的组中。
在另一个方面，本发明提供了一种用于生成和选择能够水解酯的昆虫α-羧酸酯酶的方法，该方法包括(i)将一种或多种突变引入昆虫α-羧酸酯酶，或者已经发生了突变的昆虫α-羧酸酯酶中，并且(ii)确定昆虫突变体α-羧酸酯酶水解酯的能力。
优选地，一种或多种突变提高昆虫α-羧酸酯酶的水解活性和/或改变昆虫α-羧酸酯酶的立体专一性。
更进一步，本发明提供一种通过前两方面所述方法得到的酶。
在下文中，通过非限制性的实施例以及


描述本发明。
附图简要说明图1羧基/胆碱酯酶多基因家族的系统发育(Oakeshott et al.1999)。经过分析的140蛋白质的大多数的序列都能够在Pfam，C.elegans(http://www.sanger.ac.uk/Projects/C_elegans/blast_server.shtml)和COG NCBI数据库中找到。关键性的参考来自Oakeshott et al.(1999)。序列是采用Genetics Computer Group(GCG)的Pileup程序排列的，默认设置为(间隙分量(gap weight)3.0和间隙长度分量(gap length weight)0.1)。通过(●)显示含有多重旁系同源(multiple paralogous)序列的终端谱系(terminal lineages)。C.elegans数据库中关于49序列的系统发育的全部描述在Oakeshott et al.(1999)中也已经给出。CE＝羧酸酯酶。脊椎动物CES1-CES4族就是Satoh和Hosokawa(1998)所述的那些。
图2E3(SEQ ID NO1)和加利福尼亚电鳗(Torpedo californica)乙酰胆碱酯酶(SEQ ID NO4)的氨基酸序列对比。围绕活性位点丝氨酸和残基Gly137、Trp251和Phe309的序列为粗体并加了下划线。
图3所提出的酰化反应中LcE3羧酸酯酶的活性位点的构型。
图4在含有杆状病毒表达的酯酶的细胞提取物中进行的典型的滴定实验的结果。
图51R/S顺式和反式苄氯菊酯、1R/S顺式和反式NRDC157和顺式溴氰菊酯的四种立体异构体的分子结构。
图6利用E3W251L水解顺式和反式苄氯菊酯(0.5μM)。
序列表索引SEQ ID NO1-铜绿蝇E3α-羧酸酯酶氨基酸序列SEQ ID NO2-黑腹果蝇EST23α-羧酸酯酶氨基酸序列。
SEQ ID NO3-桃蚜(Myzus persicae)E4α-羧酸酯酶氨基酸序列。
SEQ ID NO4-加利福尼亚电鳗乙酰胆碱酯酶的部分氨基酸序列。
发明详述普通技术除非另外说明，本发明所使用的重组DNA技术是本领域技术人员熟知的标准操作。这些技术在下列文献中均有描述和解释，如J.Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)，J.Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编者)，Essential Molecular BiologyA Practical Approach，Volumes 1和2，IRL Press(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编者)，DNA CloningA Practical Approach，Volumes 1-4，IRL Press(1995和1996)，以及F.M.Ausubel et al.(编者)，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括至今为止的所有更新)，并且这些文献并入参考。
定义在本说明书中，术语“取代”包括被一种基团取代，该基团可以被或可以不被一个或多个基团进一步取代，所述一个或多个基团选自烷基，环烷基，链烯基，炔基，芳香基，芳香烃(arylalkyl)，卤素，卤烷基，卤炔基，羟基，烷氧基，链烯氧基，卤代烷氧基，卤代链烯氧基，硝基，氨基，硝基烷基，硝基烯基，硝基炔基，硝基杂环，烷基氨基，二烷基氨基，烯基胺，炔基氨基，酰基，烯酰基(alkenacyl)，炔酰基，酰氨基，二酰基氨基，酰氧基，烷基磺酰氧基，杂环，杂环氧基，杂环氨基，卤代杂环，烷基磺酰基，烷氧羰基，硫代烷基，硫代酰基，含磷基团如膦酰基和氧膦基。
本文所用的术语“烷基”的含义是指直链烷基如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基等等。烷基基团可以任意地被一个或多个基团取代，所述这些基团选自烷基，环烷基，烯基，炔基，卤素，卤代烷基，卤代炔基，羟基，烷氧基，链烯氧基，卤代烷氧基，卤代链烯氧基，硝基，氨基，硝基烷基，硝基烯基，硝基炔基，硝基杂环，烷基氨基，二烷基氨基，烯基胺，炔基氨基，酰基，烯酰基(alkenoyl)，炔酰基，酰氨基，二酰氨基，酰氧基，烷基磺酰氧基，杂环，杂环氧基，杂环氨基，卤代杂环，烷基磺酰基，烷氧羰基，硫代烷基，硫代酰基，含磷基团如膦酰基和氧膦基。
本文所用的术语″烷氧基″表示直链或有分枝的烷氧基，优选C1-10烷氧基。例如包括甲氧基，乙氧基，正-丙氧基，异丙氧基和不同的丁氧基异构体。
本文所用的术语″烯基″表示形成自直链，有支链的或单-或多环烯烃和聚烯烃的基团。取代基包括如前面所述的单-或聚-不饱和烃基或环烷基，优选C2-10烯基。烯基的例子包括乙烯基，烯丙基，1-甲基乙烯基，丁烯基，异丁烯基，3-甲基-2-丁烯基，1-戊烯基，环戊烯基，1-甲基-环戊烯基，1-己烯基，3-己烯基，环己烯基，1-庚烯基，3-庚烯基，1-辛烯基，环辛烯基，1-壬烯基，2-壬烯基，3-壬烯基，1-癸烯基，3-癸烯基，1，3-丁间二烯基，1-4，戊二烯基，1，3-环戊二烯基，1，3-己二烯基，1，4-己二烯基，1，3-环己二烯基，1，4-环己二烯基，1，3-环庚二烯基，1，3，5-环庚三烯基，或1，3，5，7-环辛四烯基。
本文所用术语″卤素″表示氟，氯，溴或碘，优选溴或氟。
本文所用术语″杂原子″表示O，N或S。
或单独或在化合物词组如″酰氧基″，″酰硫基″，″酰氨基″或“二酰氨基″中使用的术语″酰基″表示一种脂肪族酰基和一种含有杂环的被称作杂环酰基的酰基，优选C1-10烷酰基。酰基的例子包括氨基甲酰基；直链或有支链的烷酰基，如甲酰基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，2-甲基丙酰基，戊酰基，2，2-二甲基丙酰基，己酰基，庚酰基，辛酰基，壬酰基，癸酰基；烷氧羰基，如甲氧羰基，乙氧羰基，t-丁氧羰基，t-戊氧羰基或庚氧羰基；环烷羰基如环丙烷羰基，环丁烷羰基，环戊烷羰基或环己烷羰基；烷基磺酰基，如甲烷磺酰基或乙烷磺酰基；烷氧磺酰基，如甲氧磺酰基或乙氧磺酰基；杂环烷羰基；杂环烷酰基，如吡咯烷基乙酰基，吡咯烷基丙酰基，吡咯烷基丁酰基，吡咯烷基戊酰基，吡咯烷基己酰基或噻唑烷基乙酰基；杂环链烯酰基如杂环丙稀酰基，杂环丁烯酰基，杂环戊烯酰基或杂环己烯酰基；或杂环乙醛酰基，如噻唑烷基乙醛酰基或吡咯烷基乙醛酰基。
昆虫酯酶、脂肪酶及其突变体多肽的相同百分率通过gap creation penalty＝5，和gap extensionpenalty＝0.3的GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)来确定。被测序列(query sequence)在长度上有至少15个氨基酸，而且GAP分析排列出覆盖至少15个氨基酸区域的两个序列。更优选，被测序列在长度上有至少50个氨基酸，而且GAP分析排列出覆盖至少50个氨基酸区域的两个序列。更优选，被测序列在长度上有至少100个氨基酸，而且GAP分析排列出覆盖至少100个氨基酸区域的两个序列。更优选，被测序列在长度上有至少250个氨基酸，而且GAP分析排列出覆盖至少250个氨基酸区域的两个序列。甚至更优选的，被测序列在长度上有至少500个氨基酸，而且GAP分析排列出覆盖至少500个氨基酸区域的两个序列。
本文所用的术语“其突变体”是指天然昆虫酯酶或脂肪酶的突变体，与其所来源的天然昆虫酯酶或脂肪酶相比，它们至少保持了一些能够对此处所述的含酯化合物的水解活性。优选的是，与其来源的天然昆虫酯酶或脂肪酶相比，突变体具有增强的活性和/或改变了的立体专一性。
天然昆虫酯酶或脂肪酶氨基酸序列的突变体能够通过在本发明的核酸中引入适当核苷酸变化或通过体外合成所需的多肽而制备得到。这些突变体包括，例如，在氨基酸序列中残基的缺失、插入或取代。假如最终的蛋白质产品具有所需要的性质，可以结合使用缺失、插入或取代以得到最终的构建体。
在设计氨基酸序列突变体中，突变点的定位和突变的性质依赖于改进的特性。在特别优选的实施方案中，天然昆虫酯酶或脂肪酶发生突变以增强它们水解如此处所述的含酯化合物的能力。突变点可以单独地或连续地改变，如通过(1)首先用选择的保守氨基酸取代，然后根据结果用更多基本选择取代，(2)缺失靶残基，或(3)在邻近位点插入其它残基。这些突变体包括E3G137R，E3G137H，E3W251L，E3W251S，E3W251G，E3W251T，E3W251A，E3W251L/F309L，E3W251L/G137D，E3W251L/P250S，E3F309L，E3Y148F，E3E217M，E3F354W，E3F354L，和EST23W251L。
用于本发明方法的突变体也能够通过使用DNA改组技术(DNAshuffling technique)(Patten et al.，1997)得到。DNA改组是一种递归(recursive)重组和突变的方法，其首先通过相关基因库任意分裂，随后通过primerless PCR进行片段重组而实现。通常，DNA改组提供了一种产生多核苷酸文库的方式，在本申请中，此文库能够被用于选择或筛选多核苷酸，这种多核苷酸编码能够水解一种如此处所述的含酯化合物的酶。被选择的酶的立体专一性也能够被筛选。
通常，氨基酸序列缺失范围从大约1到30个残基，更优选大约1到10个残基，典型的大约1到5个相邻残基。
取代突变体在多肽分子中至少有一个氨基酸残基被去掉而在这个位置有一个不同的残基插入。取代诱变中最感兴趣的位点包括被确定为活性或结合位点的点。其它感兴趣的位点是那些在其中能够从多种菌株或种类中获得相同的特殊残基的位点。这些位置可能对生物活性很重要。这些位点，特别是那些落在至少有三个其它相同的保守位点的序列中的那些位点，都能够以一种相对保守的方式被取代。这种保守取代显示在表1标题为“示范取代”一栏中。
此外，假如需要，非天然的氨基酸或化学氨基酸相似物也能够被作为一种取代或添加引入到昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体中。这些氨基酸包括，但不局限在，普同氨基酸的D-异构体，2，4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，6-氨基己酸，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，半胱磺酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟-氨基酸，设计的氨基酸(designer amino acid)，通常如β-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，和氨基酸类似物。
表1
在合成过程中或合成后经过差异修饰的昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体也包括在本发明的范围内，所述修饰例如通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、通过已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白酶剪切、与一种抗体分子或其它细胞配体的连接等来实现。这些修饰可增加本发明多肽的稳定性和/或生物活性。
昆虫酯酶，或脂肪酶，或其突变体，能够通过多种方法制备得到，包括生产和回收天然蛋白质、生产和回收重组体蛋白质，以及化学合成蛋白质。在一个实施方案中，编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的分离多肽通过在可有效的生产此多肽的条件下培养可表达此多肽的细胞，并回收此多肽来制备。一种优选的用于培养的细胞是一种本发明的重组细胞。有效的培养条件包括，但并不局限于，允许蛋白质生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧环境。有效培养基是指任何培养基，在其中细胞被培养用于生产本发明的多肽。这些培养基典型地包含一种含水介质，其中含有可同化碳、氮和磷酸盐源，以及适当的盐、矿质、金属和其它养分，如维生素。生产昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的细胞能够在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定培养皿和平皿中培养。可以在适合重组细胞的温度、pH和含氧量下进行培养。这些培养条件是在本领域技术人员的专业知识范围内的。
重组载体重组载体能够用于表达昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体，以用于本发明的方法。此外，本发明的另一个实施方案包括一种重组细胞载体，它包括至少一个编码昆虫酯酶或脂肪酶或其突变体的分离多核苷酸，其被插入到任何可以传递多核苷酸分子到宿主细胞的载体中。这种载体含有异源多核苷酸序列，这种多核苷酸序列并非天然邻近于编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的多核苷酸，并且它优选来源于不同于酯酶或脂肪酶来源的物种。这种载体既可以是RNA也可以是DNA，既可以是原核的也可以是真核的，典型是病毒或质粒。
一种类型的重组载体包含一种编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体、并被可操纵连接到表达载体上的多核苷酸。短语可操纵连接是指多核苷酸分子以某种方式插入到表达载体中，因此此分子当转化到宿主细胞中时能够被表达。本文所用的表达载体是一种DNA或RNA载体，它能够转化宿主细胞并能够影响特定的多核苷酸分子的表达。优选地，表达载体也能够在宿主细胞中复制。表达载体既可以是原核的也可以是真核的，典型地是病毒或质粒。本发明的表达载体包括在本发明的重组细胞中发挥功能(即直接的基因表达)的任何载体，包括在细菌、真菌、内寄生物、节肢动物、其它动物和植物细胞中。本发明优选的表达载体能够在细菌、酵母、节肢动物和哺乳动物细胞中，更优选在这里公开的细胞类型中直接进行基因表达。
本发明的表达载体含有调节序列，如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点，和其它与重组细胞相容的调节序列，以及其它控制本发明多核苷酸分子表达的调节序列。特别地，包含编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的多核苷酸的表达载体包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的开始、延长和终止的序列。特别重要的转录控制序列是那些控制转录开始的序列，如启动子、增强子、操纵子和抑制子序列。适合的转录控制序列包括任何能够在至少一个本发明重组细胞中发挥功能的转录控制序列。本领域技术人员已知多种这样的转录控制序列。优选的转录控制序列包括在细菌、酵母、节肢动物和哺乳动物细胞中发挥作用的那些，例如，但不局限于，tac，lac，trp，trc，oxy-pro，omp/lpp，rrnB，噬菌体λ，噬菌体T7，T71ac，噬菌体T3，噬菌体SP6，噬菌体SP01，金属硫蛋白，α-交配因子，Pichia醇氧化酶，α病毒次基因组启动子(如辛德比斯病毒(Sindbis virus)次基因组启动子)，抗生素抗性基因，杆状病毒，玉米夜蛾(Heliothis zea)昆虫病毒，牛痘病毒，疱疹病毒，浣熊痘病毒，其它痘病毒，腺病毒，巨细胞病毒(如中间体早期启动子)，猿猴病毒40，逆转录病毒，肌动蛋白，逆转录病毒长末端重复序列，劳氏肉瘤病毒，热激，磷酸盐和硝酸盐转录控制序列以及其它能够控制原核或真核细胞基因表达的序列。另外适合的转录控制序列包括组织-特异性启动子和增强子。
编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的多核苷酸也可以(a)含有分泌信号(即信号片段核酸序列)从而使被表达的昆虫酯酶或脂肪酶或其突变体能够从生产多肽的细胞中被分泌出来，和/或(b)含有融合序列。合适的信号片段包括任何能够指引昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体分泌的信号片段。优选的信号片段包括，但不局限于，组织纤溶酶原激活物(t-PA)，干扰素，白细胞介素，生长激素，组织相容性和病毒包膜糖蛋白信号片段，以及天然信号序列。此外，编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的多核苷酸可以结合一种能够指引编码的蛋白到达蛋白体的融合片段，如遍在蛋白融合片段。
宿主细胞本发明另一个实施方案包括一种重组细胞，该重组细胞中包含被一个或多个编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的多核苷酸转化的宿主细胞。多核苷酸分子进入细胞的转化能够通过任何多核苷酸分子能够被插入细胞的方法来实现。转化技术包括，但不局限于，转染，电穿孔，显微注射，脂质转染，吸附和原生质体融合。重组细胞能够保持单细胞或可以生长为一种组织，器官或一种多细胞生物。被转化的编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的多核苷酸能够保持位于染色体外，或者能够整合到转化(即重组体)细胞染色体中的一个或多个位点上，如此一来，它们被表达的能力就被保留下来。
用于转化的合适的宿主细胞包括任何可以被编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的多核苷酸所转化的细胞。本发明的宿主细胞既可以是内源性(即天然)产生昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体，也可以是在被至少一个编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的多核苷酸分子转化之后产生这些蛋白质。本发明的宿主细胞可以是任何能够产生至少一种昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的细胞，并且包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生物、节肢动物、动物和植物细胞。优选的宿主细胞包括细菌、分枝杆菌、酵母、节肢动物和哺乳动物细胞。更优选的细胞包括沙门氏菌(Salmonella)，埃希氏菌(Escherichia)，芽孢杆菌(Bacillus)，利斯特氏菌(Listeria)，酵母(Saccharomyces)，夜蛾(Spodoptera)，分枝杆菌(Mycobacteria)，夜蛾(Trichoplusia)，BHK(幼仓鼠肾)细胞，MDCK细胞(用于犬科疱疹病毒培养的正常狗肾细胞系)，CRFK细胞(用于猫科疱疹病毒培养的正常猫肾细胞系)，CV-1细胞(用于例如培养浣熊痘病毒的非洲猴肾细胞系)，COS(例如COS-7)细胞和Vero细胞。特别优选的宿主细胞是大肠杆菌，包括大肠杆菌K-12衍生物；伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)；鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，包括减毒株；草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)；BHK细胞；MDCK细胞；CRFK细胞；CV-1细胞；COS细胞；Vero细胞；和非致瘤小鼠成肌细胞G8细胞(如，ATCC CRL 1246)。其它适合的哺乳动物细胞宿主包括其它肾细胞系，其它成纤维细胞系(如人，鼠和鸡胚成纤维细胞系)，骨髓瘤细胞系，中国仓鼠卵巢细胞，小鼠NIH/3T3细胞，LMTK细胞和/或HeLa细胞。
重组DNA技术能够通过操纵，例如，多核苷酸分子在宿主细胞中的拷贝数，多核苷酸分子能够被转录的功效，所得转录物被翻译的功效，以及翻译后修饰的功效，而用于改进被转化的多核苷酸分子的表达。用于增强编码昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的多核苷酸的表达的重组技术包括，但并不局限于，将多核苷酸分子可操纵连接到高拷贝数质粒中，将多核苷酸分子整合到一个或多个宿主细胞染色体中，在质粒中加入载体稳定序列，取代或修饰转录控制信号(例如启动子，操纵子，增强子)，取代或修饰翻译控制信号(例如，核糖体结合位点，Shine-Dalgarno序列)，修饰本发明多核苷酸分子使其符合宿主细胞的密码子选择，以及删除使转录物不稳定的序列。
组合物可用于本发明的方法，或含有昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的组合物包括本文称为“可接受载体”的赋形剂。赋形剂可以是任何适合在本发明方法中使用的物质。这些赋形剂包括水，盐水，林格溶液，葡萄糖溶液，Hank’s溶液和其它含水的生理平衡盐溶液。也可以使用非水性载体，如固定油，芝麻油，乙基油酸盐或甘油三酯。其它有用的配方包括含有粘性增强剂的悬浮液，如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，或葡聚糖。赋形剂也能够含有少量添加剂，如增强等参性和化学稳定性的物质。缓冲液包括磷酸盐缓冲液，碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，同时防腐剂包括乙基汞硫代水杨酸钠或o-甲酚，福尔马林和苯甲醇。赋形剂也能够用于增加组合物的半衰期，例如，但不局限于，聚合的控释载体(controlledrelease vehicles)，可生物降解的植入体，脂质体，细菌，病毒，其它细胞，油，酯和二醇。
此外，昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体，能够用在增加生物催化速度和/或程度，或增加多肽稳定性的组合物中。例如，昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体可以被固定在一种聚氨基甲酸酯基质上(Gordon et al.，1999)，或包囊在适当的脂质体中(Petrikovics et al.2000a和b)。昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体，也可以整合到含有一种泡沫的组合物中，所述泡沫如消防中常规应用的那些泡沫(LeJeune et al.，1998)。
令本领域技术人员赞赏的是，昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体可以很容易的用在WO 00/64539公开的海绵或泡沫中，所述内容在此以其全文并入参考。
需要产生有效生物催化的昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体，(或表达昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的宿主细胞)的浓度依赖于许多因素，包括所进行的反应本身的性质，以及组合物的配方。可通过实验容易地测定组合物中昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体，(或表达昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体的宿主细胞)的有效浓度，这是本领域技术人员所理解的。
表面活性剂值得注意的是，本发明方法中使用表面活性剂可以自，例如样品沉积物中释出潜在的底物，特别是那些疏水的。因此提高本发明方法的效率。
表面活性剂是既有亲水又有疏水部分(通常为烃)的两性分子，它优先在各液相和不同程度极性和氢键结合之间的界面，如油/水或空气/水界面处分隔开。这些性质致使表面活性剂能够降低表面和界面张力并形成微乳，在此烃能够溶解在水中或水能够溶解在烃中。表面活性剂具有许多有用的性质，包括分散特性。
生物表面活性剂是一组由微生物合成的结构多样的表面活性分子。这些分子降低水溶液和烃混合物中表面和界面张力。生物表面活性剂相比于化学表面活性剂具有多种优点，如更低毒性，更高生物可降解性，更好的环境相容性，更高的起泡性，在极度温度、pH和盐度的高选择性和特异性，以及可以利用可再生资源合成的能力。
在本发明生物转化方法中有用的生物表面活性剂包括，但不局限于糖脂如鼠李糖脂(来源于，如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、海藻糖脂(来源于，如红串红球菌(Rhodococcus erythropolis))、槐糖脂(来源于，如Torulopsis bombicola)和纤维素二糖脂(cellobiolipids)(来源于，如Ustilago zeae)；脂肽和脂蛋白，如serrawettin(来源于，如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens))、枯草菌表面活性剂(来源于，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、枯草杆菌蛋白酶(来源于，如枯草芽孢杆菌)、短杆菌肽(来源于，如短芽孢杆菌(Bacillus brevis))和多粘菌素(来源于，如多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa))；脂肪酸，中性脂质和磷脂；聚合的表面活性剂，如乳化胶(来源于，如乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus))、biodispersan(来源于，如乙酸钙不动杆菌)、甘露聚糖-脂质-蛋白质(来源于，如热带假丝酵母(Candida tropicalis))、脂乳化剂(来源于，如解脂假丝酵母(Candida lypolytica))、蛋白质PA(来源于，如铜绿假单胞菌)；以及微粒生物表面活性剂，如来源于如乙酸钙不动杆菌的泡囊和菌毛。
实施例
实施例1构建突变体图2中给出了E3酶氨基酸序列与一种脊椎动物乙酰胆碱酯酶氨基酸序列(TcAChE，已知三维结构；Sussman et al.，1991)的对比。利用Stratagene的QuickChangeTM定点诱变试剂盒(Site-DirectedMutagenesis Kit)构建E3和EST23的突变体，并依照发生改变的残基的数目以及改变的性质来命名。例如，突变体E3W251L是一种E3突变体，其中野生型酶(即E3WT)的251位上的Trp残基突变成Leu。
利用Newcomb et al.(1997)中所描述的杆状病毒表达系统表达E3和EST23酶，但使用HyQ SFX昆虫无血清培养基(HyClone)来进行增强表达。通过在pH为7.0、包含0.05％Triton X-100的0.1M的磷酸盐缓冲液中，裂解浓度为108细胞ml-1的细胞制备细胞提取物。然后在通过二乙基香豆磷酸盐(dECP)进行酶的磷酸化时，应用基于香豆素(一种荧光化合物)初始释放的荧光测定法，来滴定提取物从而确定酯酶分子的数目。
图3说明了在酰化反应中所提及的E3活性位点的构造(基于脊椎动物AchE的三维结构)。我们已经检测了在与已知的AchE活性位点的三个明显的次位点相对应的区域中的7个E3残基的突变。这些是氧离子空穴(E3残基137)，阴离子位点(E3残基148，217和354)和酰基结合口袋(acyl binding pocket)(E3残基250，251和309)。阴离子位点和酰基结合口袋与Jarv(1984)命名中的p1和p2次位点相对应。
在氧离子空穴中的突变在TcAChE氧离子空穴中包含Gly118，Gly119和Ala201，其与E3中的Gly136，Gly137和Ala219相对应。在整个羰基/胆碱酯酶多基因家族中，这些残基是高度保护的(Oakeshott et al.，1999)，并且通过一些胆碱酯酶和脂肪酶的X-射线结晶研究，已有实验证据证明氧离子空穴结构的保守性(Cygler和Schrag，1997)，虽然在一些脂肪酶的界面活化过程中，此结构发生改变(Derewenda et al.，1992)。但也有其功能的实验性结构证据证明其稳定了在催化过程中作为第一过渡态的羧酸酯底物的羰基氧形成的氧阴离子(Grochulski et al.，1993；Martinez et al.，1994)。通过肽链中这三个关键残基的酰胺基连接形成的氢键网络而获得这种稳定(Ordentlich et al.，1998)。最近，Koellner et al.(2000)也已经显示AChE氧离子空穴中的两个Gly残基与内埋的“结构”水分子形成氢键，其可以在催化过程中保留，并被认为作为润滑剂促进活性位点中底物和产物的交换。
除在OP抗性的铜绿蝇中天然形成的G137D之外，在E3的Gly137上形成三种进一步的突变。首先，在G137E位，Glu被其它酸性氨基酸取代。突变体G137H也被构建，因为在中性pH下，His也是非质子化的(对于Asp和Glu，pKa大约6.5 cf 4.4)，并且当在其氧离子空穴中取代任一Gly时，发现在人丁酰胆碱酯酶上出现某些OP水解作用(Broomfield etal.，1999)。最后，为测定可能的最强的碱性取代的作用，在137位上取代Arg(pKa约12)。
酰基结合口袋的突变在结构上表现胆碱酯酶特性的酰基结合口袋主要通过四个非极性残基形成，其中的三个通常是芳香基。它们共同产生一种强疏水袋以容纳结合底物的酰基部分。TcAChE中的四个残基是Trp233，Phe288，Phe290和Va1400，对应于E3中的Trp251，Val307，Phe309和Phe422。疏水残基的相似排列在于大多数羧基/胆碱酯酶的相应位点是保守的(Oakeshott et al.，1993；Robin et al.，1996；Yao et al.，1997；Harelet al.，2000)。特别地是，在233/251残基上，Trp是非常保守的，并且虽然在一些脂肪酶和少数羧酸酯酶中290/309为Leu或Ile，但在胆碱酯酶和大多数羧酸酯酶中290/309是Phe。对应于TcAChE Phe288的残基在优选长链酯如丁酰胆碱的胆碱酯酶中典型地是一种支链脂肪族氨基酸。这包括哺乳动物丁酰胆碱酯酶和一些昆虫乙酰胆碱酯酶，其具有一种类似于丁酰胆碱酯酶的底物特异性。支链脂肪族氨基酸在酰基结合口袋中提供一个更大的空间以容纳较大的酰基。
在一些胆碱酯酶中288/307和290/309突变的研究证实它们在确定与酰基特异性相关的底物特异性方面的重要作用。在人类AchE中，在任一位置用一个小的残基如Ala对Phe进行的取代增强了此酶对底物的动力学，所述底物如丙基-或丁基-(硫代)胆碱，其具有的酰基大于天然乙酰(硫代)胆碱底物(Ordentlich et al.，1993)。在来源于黑腹果蝇和家蝇，Musca domestica的AchE中，等价于使靶位点具有OP抗性的巨大极性Tyr的290/309的天然突变对乙酰胆碱和OPs反应性较低(Fournieret al.，1992；Walsh et al.，2001)。对于黑腹果蝇AchE，用更小的Leu对Phe残基取代可以预期增强OP灵敏度，尽管用其它的小残基如Gly，Ser或Val进行取代没有此作用(Villatte et al.，2000)。
在胆碱酯酶突变研究中尽管很少注意Trp 233/251，但是我们对E3先前的工作显示再次使用更小的Leu残基的取代增强了对具有巨大酰基部分的羧酸酯底物或OPs的反应性(Campbell et al.，1998a，b；Devonshire et al.，2002)。在黄蜂，Anisopteromalus calandrae的同族体(homologue)中也已经发现了Gly的突变，其显示出增强的马拉硫磷羧酸酯酶(MCE)的动力学(Zhu et al.，1999)，同时在家蝇的同族体中已经发现了一种可能与马拉硫磷抗性有关的Ser(Claudianos et al.，2002)。关于OP水解酶活性，Devonshire et al.(2002)提出这种突变的特殊意义在于适应在反应过程中二级水解阶段(second hydrolysisstage)必定出现的磷的反转(inversion)。特别是，Devonshire et al.(2002)发现E3W251L的OP水解酶活性的Kcat比dMUP高一个数量级，其具有比dECP更小的二甲基磷酸基，其具有一个二乙基磷酸盐基。这就暗示了甚至在具有较大酰基口袋的突变体中仍存在对反转严格的空间约束。
我们已经突变了E3的W251和F309残基，以及与W251紧邻的P250。除先前描述的天然W251L突变之外，现在我们已经分析了在W251S，W251G，W251T和W251A中用四个其它小氨基酸的取代。一种W251L和P250S的双重突变体也被分析了，因为具有高MCE活性的家蝇的E3定向同源物(ortholog)的天然变体在250和251位置分别具有Ser和Leu。只有一个F309取代被检测，F309L，AchE结果显示其应该能够增强MCE和OP水解酶活性。单独和与W251L一起作为双重突变体时分析了F309L。
在阴离子位点的突变胆碱酯酶的阴离子位点有时被称为四价结合位点(对于乙酰胆碱中四价铵来说)，或在Jarv(1984)原始命名法中称为p1次位点(subsite)。它主要包括Trp 84，Glu 199和Phe 330，Phe 331和Tyr 130(TcAChE命名)也包括在内。因此除Glu 199之外，它是一种高度疏水的位点。Glu 199紧邻催化性Ser200。在胆碱酯酶中或较小的程度上在许多羧酸酯酶中这些关键残基高度保守(Oakeshott et al.，1993；Ordentlich etal.，1995；Robin et al.，1996；Claudianos et al.，2002)。除了Trp84(图2中的序列对比显示E3丢失了对应于AChE残基74-85的残基)之外，E3在相应位点(分别是217，354和148)具有和TcAChE相同的残基。有趣的是，在一些脂肪酶和某些羧酸酯酶中Glu 199的等价物是Gln，Phe 330的等价物是Leu，其底物已知具有小的离去基团(Thomas et al.，1999；Campbell et al.，2001；Claudianos et al.，2002)。
结构和突变研究已经详述了胆碱酯酶催化中阴离子位点的作用。关键残基在活性位点底部构成氢键网络的一部分，其中Tyr 130和Glu 199也共同与结构水分子接触(Ordentlich et al.，1995；Koellner et al.，2000)。当底物在位于活性位点峡(active site gorge)的边缘上与外围结合位点结合时，此阴离子位点发生一个构象改变，新的构象可容纳底物的胆碱(离去)基团，并促进它的羰基碳和催化性Ser 200的相互作用(Shafferman et al.，1992；Ordentlich et al.，1995；1996)。因此，该位点主要在反应的第一阶段酶酰化中起作用，特别是在非共价过渡态形成的阶段中(Nair et al.，1994)。因此关键残基的突变主要影响Km，而不是Kcat。与胆碱离去基团的相互作用主要由非极性和π-电子相互作用介导，特别包括Trp 84和Phe 330(Ordentlich et al.，1995)OP抑制剂的研究显示胆碱酯酶阴离子位点也容纳它们的离去基团，但是有一些证据提示部分位点(主要是Glu 199和Tyr 130，也可能是Ser226)可能也影响磷酸化酶的反应性(Qian和Kovach，1993；并另见Ordentlich et al.，1996；Thomas et al.，1999)。
这里几乎没有关于对应于AchE阴离子位点的羧酸酯酶位点的突变分析，但是一个有趣的例外是黑腹果蝇的EST6羧酸酯酶，它在相当于Glu199的位点有一个His。其中His被Glu取代的一种突变体对多种羧酸酯底物表现出减弱的活性，但是获得了一些乙酰硫代胆碱水解活性(Myerset al.，1993)。蚜虫，桃蚜(Myzus persicae)的E4羧酸酯酶在此位置具有一个Met，而且此酶通常不与OPs反应(Devonshive和Moores，1982)。然而，Met是否有助于OP水解酶活性还是未知的。同样地，Y148F取代是家蝇OP抗性品系(也即G137D)的E3定向同源物中记录的几个之一，但是这种变化是否直接有助于OP水解酶活性还是未知的(Claudianoset al.，1999)。
E3中的Y148，E217和F354残基现在已经被突变。E217M和Y148F突变被用于测试上述桃蚜和家蝇酶中相应的突变是否直接有助于它们的OP反应性。G137D双重突变体中的Y148F也被检测，因为这是在抗性家蝇中发现的组合。F354突变为较小的Leu残基和较大的Trp，通常在脂肪酶的这个位置上是Leu(见上述)。
实施例2酶滴定在小平板的1-4列中为每种所表达的酯酶建立4组100μl的反应板孔空白含有0.025％Triton X-100，0.1M磷酸盐缓冲液pH7.0；底物空白含有于0.025％Triton X-100中的100μM dECP，0.1M磷酸盐缓冲液pH7.0；
细胞空白含有以1∶1的比例与0.1M的磷酸盐缓冲液，pH7.0混合的50μl细胞提取物；滴定反应含有以1∶1的比例与含有200μM dECP的0.1M的磷酸盐缓冲液，pH7.0混合的50μl细胞提取物。
出来dECP，将所以组分(新鲜制备的，在缓冲液中浓度为200μM)加入到孔中。在一个板上，几种酶被同时测定，并且顺着一列将dECP同时加入到第二和第四个孔开始反应。第一次读数的时间间隔(典型的为1分钟)被记录下来用于随后的计算。
在进一步计算之前，所有读取的值中均减去板孔空白(A)的均值。多种细胞提取物的初步实验显示在460nm处它们具有荧光，并且将其加入分析产物，7-羟基香豆素溶液时焠灭了39(±7)％的荧光。因此在减去细胞提取物(c)固有的荧光之后，滴定反应(D)中的荧光值被这种焠灭效应校正。最后，将底物空白(B)，当作取自所有的在一个板上同时测定的均值，减去从而得到校正的由酯酶释放的香豆素所引起的荧光。这些校正对于在很低水平上(＜1pmol/μl提取物)表达酯酶的细胞系很重要。
全部的校正数据被绘制成为进度曲线(progress curve)，并且平衡斜率被外推回零时间，根据它与抑制剂(浓度为100μM的dECP，在10-20分钟内使所有酯酶的酯酶催化性位点完全饱和)的化学计量的相互作用确定酯酶的量。随着所有板上的反应的进行，绘制出7-羟基香豆素的标准曲线，并用于计算酶和形成产物的摩尔浓度。
图4显示了在含有杆状病毒表达的酯酶的细胞提取物中进行的代表性的滴定实验的结果实施例3苄氯菊酯水解实验对于酸性标记化合物使用放射分配分析(radiometric partitionassay)或对于在醇部分标记的那些使用基于TLC的分析(Devonshire和Moores，1982)测定被表达的酶的苄氯菊酯水解活性。这些分析的特征包括保持苄氯菊酯的浓度低于它公开的水溶液中的溶解度(0.5μM)，洗涤剂的浓度(用于从酶被表达的昆虫细胞中提取酶)低于临界胶束浓度(对于TritonX100，为0.02％)，并且快速地进行分析测定(即在10-30分钟之内)使粘附于试管壁(使用将粘着减少到最小的玻璃管)的底物减到最少。在这些苄氯菊酯的浓度下，酶不能被底物饱和，因此Km值无法确定。然而，用苄氯菊酯活性可精确地计算每种酶的特异性常数(Kcat/Km)，在低底物浓度下，可直接比较它们的效率。通过将苄氯菊酯分离成它的顺式和反式异构体来增强分析能力。
(a)分离苄氯菊酯的顺式和反式异构体苄氯菊酯的商业制品包含四种异构体1S顺式，1R顺式，1S反式，1R反式(图5)。在硅上使用制备薄层色谱法(TLC)将异构体分离成两个对映体对1S/1R顺式和1S/1R反式。不能进一步分离这些对映体。然后可以测定酶制剂对每个对映体对的水解。
(b)实验方案在酸部分中放射性标记的拟除虫菊酯这个方法(Devonshire和Moores，1982)用于苄氯菊酯异构体。它依赖于使用放射性标记的底物和被表达的酶的孵育，然后将未改变的底物提取到有机溶剂中之后，测定水相中的放射性环丙烷羧酸酯阴离子。基于先前的经验，最好的提取方案使用甲醇和氯仿为2∶1(体积比)的混合物。当按照适当比例混合等份实验孵育物时，所得到的缓冲液、甲醇和氯仿的混合物是单相的，它用于阻断酶反应并确保拟除虫菊酯完成溶解。随后加入过量的氯仿和缓冲液，超过甲醇将这些相保持在一起的容量，这样有机相能够被除去，并测定水相中的产物。详细方案如下。
磷酸盐缓冲液(0.1M，pH7.0)加到放射性标记的苄氯菊酯(在丙酮中50μM)中形成1μM溶液，然后加入等体积的在相同缓冲液中被适当稀释过的被表达的酯酶开始实验。初步工作已经确定孵育物中的洗涤剂(用于从收获的细胞中提取酯酶的Triton X-100)的浓度必须低于它的CMC(临界胶束浓度，0.02％)从而避免非常亲脂性的拟除虫菊酯分离到胶束中而不能得到此酶。典型地，实验的终体积是500-1000μl，底物和丙酮浓度分别为0.5μM和1％。在30秒到10分钟的时间间隔，温度为30°条件下，100μl等份孵育物被取出，加到含有300μl的2∶1的甲醇氯仿混合物的试管中并涡旋混和。然后在室温下放置试管直到混合物(abatch)在孵育结束的时候或长期的采样间隔中能够被进一步处理。在加入50μl缓冲液和100μl氯仿之后，混合物被涡旋混和，离心以及用500μl Hamilton注射器除去下层的有机相并丢弃。进一步加入100μl氯仿重复提取，然后取出200μl上层的水相(使用带细尖的移液管)用于闪烁计数。关键是避免带有任何有机相。由于水相最终的体积是260μl(包括一些甲醇)，因此在最初的100μl等份中产生的总的计数被相应的校正。
在醇部分中放射性标记的拟除虫菊酯i)I型拟除虫菊酯-苄氯菊酯的二溴类似物(NRDC157)在氯仿甲醇提取过程中，这些酯水解形成的3-苯氧基苯甲醇(3-phenoxbenzyl alcohol)没有分离到水相中。因此需要从通过硅TLC法从底物中分离这个产物(Devonshire和Mooers，1982)。具体方案如下。
对于这种酸标记的底物建立孵育物。在100μl取自孵育物的等分中，通过与200μl丙酮在-79°(固体CO2)立即混合，间断终止反应。然后将100μl这种混合物，连同3μl非放射性的3-苯氧基苯甲醇(在丙酮中2％)一起转移到LinearQ channeled硅F254板的加样区(Whatman)。在10∶3的甲苯(蚁酸饱和的)和乙醚的混合物中显影之后，底物和产品通过放射自显影术定位6-7天(确定产品与UV光下显示的冷却的标准3-苯氧基苯甲醇迁移率相同)。接着，用Neatan(Merck)浸渗TLC平板的这些区域，并干燥，然后将它们从玻璃支持物上剥离下来并转移到闪烁计数小瓶中。在硅上点样之前，利用丙酮对最初的100μl进行3-倍稀释液进行计数校正。
ii)II型拟除虫菊酯-溴氰菊酯异构体进行初步实验，其中孵育物通过上述的TLC分析，主要显示3-苯氧基苯甲酸的形成，符合文献中所述的初始的羟睛水解产物被迅速地非酶催化地转变成酸。由于TLC实验比氯仿-甲醇提取过程时间更长，所以后者如上述酸标记的拟除虫菊酯)被用于测定产自这些底物的3-苯氧基苯甲酸盐阴离子。
对于所有实验，产物的摩尔量通过已知的放射性标记底物的比活度(specific activity)来计算。早期的关于被表达的E3WT酯酶的实验显示水解速度与分析中密度至多为0.5μM的1RS顺式或1RS反式苄氯菊酯的浓度直接成比例，即没有米氏络合物(Michaelis complex)的堆积作用。当浓度高于0.5μM，接近已公开的苄氯菊酯的水溶解度时，实验显示出了不稳定的结果，因此影响Km和Kcat的测量。此外，应用外消旋底物时，一旦已经水解的底物接近50％，水解速度就突然变慢，标志着两种对映体(在外消旋混合物中等量的1R或1S)中只有一种易于水解，与早先公开的来自蚜虫酯酶的数据一致(Devonshive和Moores，1982)。因此实验条件被调整为测定每一对中更于易被水解的对映体的水解。用来源于OP抗性蚜虫(桃蚜)匀浆的E3WT和E4的反式苄氯菊酯进行连续孵育证实两者都优选选择1S反式对映体。在所有的例子中，由于不可能分离这些动力学参数，所以利用在0.5μM下(或外消旋底物的一种对映体为0.25μM)的水解速度，连同dECP滴定确定的酯酶的摩尔量来计算特异性常数(Kcat/Km)。关于底物溶解度和对其浓度反应的比例的考虑被假定适用于所有的酶和底物。
(c)特异性常数的计算图6提供了苄氯菊酯的反式和顺式异构体被E3W251L酶水解的实验结果。
由于苄氯菊酯异构体的水解速度与所用至多为0.5μM(即没有明显的米氏络合物形成)的底物的浓度直接成比例，所以不可能将Km和Kcat作为独立参数进行测定。当溶度恰好低于Km，米-曼氏方程(Michaelis-Mentenequation)反应式简化为V=kcatKm[S][E]]]>因此，特异性常数(即Kcat/Km)能够通过上面的方程，利用初始水解速度(pmol/min，通过已知的放射性标记底物的比活度计算得出)和实验中底物和酶的浓度来计算得到。特异性常数有限扩散(diffusion-limited maxium value)的最大值为108-109M-1秒-1(Stryer，1981)。
实施例4E3，EST23和蚜虫E4变体的苄氯菊酯水解活性表2总结了用顺式和反式苄氯菊酯作为底物所得到的十八个E3，三个EST23和五个MpE4变体的动力学数据。每种情况下，数据代表每个1S/1R顺式和1S/1R反式异构体对中被最快水解的对映体的水解作用(见上)。
从OP易感的大苍蝇中发现的E3WT酶，它的EST23黑腹果蝇定向同源物和MpE4WT酶显示出显著的苄氯菊酯水解活性水平，它对反式异构体是特异的。在E3酶活性位点的酰基结合口袋或阴离子位点区域的突变导致苄氯菊酯反式和顺式异构体活性均显著增强。
a)氧离子空穴突变E3G1 37D突变是造成绵羊大苍蝇(sheep blowfly)中二嗪农抗性的原因。在这种突变体中，在酶活性点位的氧离子空穴中非常小的，脂肪族的，中性的Gly残基被酸性的Asp取代，可使结合的oxon OP分子水解。然而，这种突变体(以及其黑腹果蝇定向同源物和相应的MpE4G113D突变体)已经降低了反式-苄氯菊酯的活性，特别是与野生型酶相比。这种活性不会通过His或Glu取代Gly-137来增强。然而，用Arg取代Gly-137不会明显影响顺式-或反式-苄氯菊酯的活性。Arg的线性本质意味着它容易折叠并且不会影响苄氯菊酯与活性位点的结合。
b)酰基结合口袋突变E3W251L突变，它在活性位点的酰基袋用较小的脂肪族的Leu取代了大的芳香族的Trp残基，导致反式-苄氯菊酯水解增强7倍并获得实质性的顺式-苄氯菊酯水解。EST23中W251L的作用与对E3的基本相同。但是MpE4中相应的W224L突变导致对顺式和反式苄氯菊酯的活性实质下降，这大概是由于蛋白主链的差异造成的。在E3中甚至用更小残基(尺寸依次减小的Thr，Ser，Ala和Gly)取代Trp-251也导致苄氯菊酯水解活性的增强，尽管这些突变体的活性不象E3W251L那么高。显然，在突变体活性中，空间排列因素并不是唯一需要考虑的因素。例如，Thr和Ser都包含羟基而且都是亲水的。此外，Ala既是脂肪族的也是疏水的(如Leu)甚至小于Leu，然而这种突变体对于苄氯菊酯的活性和W251L突变体一样。打开W251L突变体(即E3P250S/W251L)的氧离子空穴也减少它对顺式-和反式-苄氯菊酯的活性，尽管该活性依旧高于野生型的活性。有趣的是，与野生型相比，苄氯菊酯对所有E3中的W251突变体以及EST23中的W251L突变体的特异性常数的增加对于顺式异构体一律更为显著。然而野生型酶产生的反式顺式的比率至少为20∶1，这些比率对于W251突变体来说仅为2-6∶1。这些突变体提供的酰基袋中额外的空间显然最有利于水解更有疑问的顺式异构体。
在同一E3分子上的W251L和G137D的组合突变使此酶对顺式苄氯菊酯的活性增加超过野生型水平，但是减弱了对于反式苄氯菊酯的活性。然而，双重突变体的活性并不如只有E3W251L突变的突变体的活性强(即突变没有产生加合作用)。
已知在一些脂肪酶对应于铜绿蝇E3中Phe 309的位置上含有Leu残基。因此E3F309L突变体的构建就是为了产生对亲脂性的底物如拟除虫菊酯的活性。如表2中所示，对于两种异构体，E3F309L突变体更优于E3WT。对于反式-苄氯菊酯，它比E3W251L更具活性，虽然它对顺式异构体没有如此的活性。在同一E3分子上，F309L和W251L的组合突变增强了对于顺式苄氯菊酯的活性，但是对于反式苄氯菊酯的活性减弱到E3W251L的水平。换句话说，F309L突变对于W251L突变体对苄氯菊酯的活性几乎没有影响。
c)阴离子位点突变已知在一些脂肪酶对应于铜绿蝇E3中Phe 354的位置上具有Leu残基。然而，E3中Phe 354被取代为Leu不会明显增加它对苄氯菊酯的活性。另一方面，Phe 354被取代为更大的芳香族残基Trp，使对顺式和反式苄氯菊酯的活性增强3-4倍。令人惊讶的是，F354W，而非F354L对于亲脂性的苄氯菊酯的活性应该增强，由此可知在一些天然脂肪酶中是Leu取代了Phe。
Y148F突变对于苄氯菊酯动力学产生了巨大的影响并且这种影响与依赖于遗传背景的方向相反。与野生型相比，单突变体(single mutant)对于顺式和反式苄氯菊酯的活性增强了5-6倍。具有G137D的双重突变体(单个突变体的值远远低于野生型)，对反式苄氯菊酯的活性减少了大于两倍，并且几乎丧失了对顺式苄氯菊酯活性。后面的结果清楚的显示出在苄氯菊酯水解方面，Y148和氧离子空穴之间存在较强的相互作用。
Glu-217是紧邻催化性丝氨酸的残基，它被认为在水解反应中对于稳定过渡态中间体很重要。然而，将此残基突变为Met(E3E217M)，就象在蚜虫桃蚜酯酶E4中天然存在的那样，它对苄氯菊酯的活性几乎没有影响。然而，在MpE4的逆向突变(即MpE4M190E)中将MpE4酶对反式和顺式苄氯菊酯的活性降低了大约一半。这种突变与氧离子空穴突变组合(MpE4G113D/M190E)导致苄氯菊酯水解活性进一步实质性的降低(即两种突变对苄氯菊酯的活性的作用是加合的)。
表2铜绿蝇酯酶E3，黑腹果蝇EST23和蚜虫E4天然的和合成的变体对于苄氯菊酯顺式-和反式-异构体，以及苄氯菊酯的两种顺式-二溴乙烯类似物(NRDC157)的特异性常数。还显示对反式和顺式苄氯菊酯，以及1S顺式和1R顺式NRDC157的特异性常数的比率。
酶 特异性常数(Kcat/KmM-1sec-1)1S/1R反式 1S/1R顺式苄氯NRDC157 NRDC157 1R苄氯菊酯 菊酯(反式顺1S顺式 顺式(1S∶1R比率式比率) )E3WT 900003400(27∶1) 4700630(8∶1)氧离子空穴突变体E3G137D 9600 1800(5∶1) ND1NDE3G137R 850003900(22∶1) ND NDE3G137H 260001600(16∶1) ND NDE3G137E 2400 280(9∶1)ND ND酰基结合口袋突变体E3W251L 900000 460000(2∶1) 370000 5400(68∶1)E3W251S 140000 36000(4∶1) 35000 2900(12∶1)E3W251G 9500024000(4∶1) 27000 1700(16∶1)E3W251T 150000 24000(6∶1) 24000 900(26∶1)E3W251A 300000 72000(4∶1) 67000 1200(56∶1)E3F309L 1200000 48000(25∶1) 5700 8000(0.7∶1)E3W251L 810000 430000(2∶1) 26000 69100(0.4∶1)/F309LE3W251L 2400011000(2∶1) 12000 1100(11∶1)/G137DE3P250S 340000 110000(3∶1) ND ND/W251L阴离子位点突变体
E3Y148F 580000 17000(34∶1) ND NDE3Y148F 4100 47(87∶1)ND ND/G137DE3E217M 930004400(21∶1) ND NDE3F354W 350000 8800(40∶1) ND NDE3F354L 104400 2700(38∶1) ND NDEST23酶EST23WT 21000890(24∶1) 990330(3∶1)EST23W251L 260000 160000(2∶1) 72000 1200(60∶1)EST23G137D 2500 ND ND ND桃蚜E4酶MpE4WT 270000 2400(113∶1) ND NDMpE4G113D12000830(14∶1) ND NDMpE4W224L230001100(21∶1) ND NDMpE4M190E120000 1200(100∶1) ND NDMpE4G113D/ 6300 210(30∶1) ND NDM190E1、未确定的2、与对照细胞提取物获得的值没有实质性差别实施例5溴代苄氯菊酯类似物的水解表2中还概括了使用苄氯菊酯的两种顺式-二溴乙烯基类似物(NRDC157)获得的E3和EST23变体的动力学数据。苄氯菊酯二溴类似物的1S顺式异构体被除E3F309L和F309L/W251L之外的所有的酶水解，其效率与1R/1S顺式苄氯菊酯相似。这表明更大的溴原子未实质性阻断这种底物进入催化中心。尽管E3WT和EST23WT酶的活性对于异构体间进行显著性比较来说是太低了，但除了E3F309L和F309L/W251L，所有其它酶的水解示出1S异构体的10-100倍快的速度。在环丙烷环的C1位置的这种构型与先前在桃蚜中对1S反式苄氯菊酯发现的具有相同的倾向性(Devonshire和Moores，1982)。
F309L对NRDC157的动力学具有明显影响。单突变体与野生型对1S顺式的作用几乎没有差别，并且对于此异构体，具有W251L的双重突变体比单独的W251L显示更少的活性。然而，1S/1R优选倒置，在单突变体中的值为0.7∶1，在双重突变体中的值为0.4∶1。在所有数据集中，对1R顺式活性的结果是两个最高的值。实际上双重突变体的值约为任一单独突变体的10倍。
实施例6已表达的酶对II型拟除虫菊酯的水解表3概括了使用四种溴氰菊酯顺式异构体获得的E3和EST23变体的子集的动力学数据。除了E3W251L和E3F309L，溴氰菊酯的1R顺式异构体(αS或αR)的水解效率与1R顺式NRDC157相似(它能够被认为在特征上是苄氯菊酯和溴氰菊酯之间的中间体，因为它具有二溴乙烯基取代但是缺乏α氰基)。对1R顺式异构体的活性，αR构象总是大于αS构象。E3W251L和E3F309L对溴氰菊酯1R顺式异构体的效率明显小于对NRDG157相应异构体的效率。
表3四种溴氰菊酯顺式异构体的特异性常数
1、与对照细胞提取物获得的值没有实质性差别2、未确定的值得注意的是，具有最大溴氰菊酯活性的251突变体是W251S，然而五种251突变体中W251L(对于其它两种拟除虫菊酯最高)，和W251G给出最小的溴氰菊酯活性。它暗示对于有效的溴氰菊酯的水解，离去基团的α-氰基部分的存在可能是主要的阻碍，它足以阻止野生型E3产生的任何显著的水解。与其它底物相比，容纳底物需要明显不同的应用活性位点空间，这样较小残基在酰基袋中对W251的取代提供了有用的容纳，特别是对αR异构体来说。然而，重要的是，对空间要求的细节以及因此最有效地突变体与其它拟除虫菊酯的突变体不同。
所有的酶对溴氰菊酯1S顺式异构体的活性明显小于对缺少α-氰基的NRDC157的相应异构体的活性。α氰基的这种显著影响似乎是通过环丙烷基中C1位置的1S构象表现的。除了一些最小的活性突变体外，对1S顺式异构体的活性来说，αR构象的活性总是大于αS构象的活性。
实施例7 拟除虫菊酯实验的一般性讨论251系列突变体对苄氯菊酯和NRDC157的结果一起可有力而简单地推断出E3/EST23中的酰基结合的约束。总的说，251取代应该产生更大的酰基袋，它有利于这些底物的大酰基的容纳/稳定。这种取代有利于所有异构体的水解，这些异构体由环丙烷环的两个立构中心产生。反式异构体优选用野生型酶水解，而突变体也可水解至少混合相当好的部分顺式异构体。然而，在顺式异构体中，突变体的改进对1S顺式异构体更显著。对于所有野生型酶，1R顺式异构体是所有构型中最有问题的，它对突变体也是最有问题的。在突变体系列中，改良的动力学不能通过侧链尺寸的缩小进行简单的解释；最小的取代没有产生最大的活性。实际上，最好的动力学来自于W251L，尽管所有试验的取代物中Leu具有最大的侧链尺寸，这就暗示了亲脂性发挥重要作用。
和苄氯菊酯及NRDC157中相对简单和一致的模式相反，溴氰菊酯对251系列突变体的结果就十分复杂和难以解释。如预期它们增强其它底物的动力学那样，对于四种顺式溴氰菊酯异构体，它们显示出的活性全部好于野生型，尽管在用野生型时，它们绝对低于对其它底物的活性。然而，对于NRDC157，优选1S异构体甚于1R异构体，而在溴氰菊酯数据中这种优选最多是弱的。另一方面，所有突变体有一种明显的倾向，优选αR异构体甚于αS异构体。通常它仅约为2∶1，但是它与野生型EST23的倾向明显相反。首先不能预料到这些假定的酰基结合口袋取代将影响αR/αS立体优选性(stereopreferences)，因为后者用于底物(醇)离去基团中的α-氰基部分。
所有F309L的数据清楚的显示这个残基对于拟除虫菊酯水解动力学的主要影响。它与W251系列突变体的结果在一个平行的水平上，两个数据集均显示动力学得到提高，这与根据酰基结合口袋中提供更大的空间而期望的相一致。然而，也存在重要的不同，W251系列对苄氯菊酯顺式与反式异构体的活性不成比例，以及F309L对顺式NRDG157的1R与1S异构体的活性也不成比例。在这两个位点的取代也显示出较强的相互作用，这与它们赋予酰基结合口袋中共同的结构和功能相一致。例如，W251突变体对于顺式苄氯菊酯的不成比例的增加和F309L对于1R顺式NRDC157的不成比例的增加在双重突变体中均表现为显性特征。251和309突变体对于溴氰菊酯水解的活性和相同的立体专一性具有数量上相似的增强效果，而未观察到在更小的拟除虫菊酯中发现的立体专一的差别。然而，我们认为，它的离去基团中另外大多数α氰基部分需要活性位点上这种基团的空间再分配，以便掩盖(override)在较小的拟除虫菊酯中明显的立体专一性。
实施例8用荧光鉴定法确定脂肪酶活性脂肪酶活性实验应用荧光鉴定法测定昆虫酯酶或脂肪酶，和其突变体的脂肪酶活性。荧光底物提供了快速可再生测定酶活性的方法。4-甲基伞形酮荧光团的脂肪酸酯(酰化的)被用作鉴别脂肪酶活性的底物。这种方法采用荧光团4-甲基伞形酮棕榈酸酯(4-MU-棕榈酸酯)(结构如下)并且是用于分枝杆菌的快速定性和鉴别的Devonshire et al.(2002)的荧光法酯酶滴定实验和Hamid et al.(1994)方法的改良。
4-甲基伞形酮棕榈酸酯4-MU-棕榈酸酯被一种脂肪酶水解从而释放荧光4-甲基伞形酮(4-MU)，它能用荧光计测定。
随着滴定，绘制每个平板的4-MU的标准曲线。用2.475ml(3×825μl)乙醇稀释25μl 10-2M的dMU储存液(19.8mg/10ml，在100％乙醇中)，从而得到10-4M的溶液。这种10-4M的溶液被用于绘制在0.1M pH7.0磷酸盐缓冲溶液(假如存在于细胞提取物中，加0.05％或0.5％超纯TritonX-100(TX100))中从0到1.0μM的标准曲线。在试管中分配25μl，20μl，15μl，10μl，5μl，0μl(加乙醇到25μl)并加入2.475ml磷酸盐缓冲液(或是含有TX100的磷酸盐缓冲液，假如需要的话)，然后每个孔中加入100μl。这样获得在0.25％TX100中的0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μM的样品。
随着下面的滴定反应的进行，在Fluorostar荧光计(BMGLabTechnologies)上读取这些样品，该方法中所采用的基本设定为激发-355nm，发射-460nm，放大-0，每180秒10个循环，每一次循环前均振荡。
对于这个实验，将20μl 5×10-44-MU-棕榈酸酯(在100％丙酮中)加入需要底物的孔中(按下面表4中定义的II和III)，并风干。对于每一种要测定的酶来说，进行4组反应，首先分配缓冲液然后是细胞样品。细胞提取物是50μl细胞提取物或细胞上清液以及50μl磷酸盐缓冲液(0.1M)0.05％TX-100。在实验中，4-MU-棕榈酸酯的终浓度是10-4M。应该在读数开始前立即加入细胞提取物。
表4
通过下面的方程计算校正的荧光(Fcorrected)。
对于磷酸盐pH7.0Fcorrected＝[(FII-FI)/0.7]-FIII+2*FIV]对于pH7.0的磷酸盐中含0.05-0.5％TX100Fcorrected＝[(FII-FI)/0.6]-FIII+2*FIV]其中0.6和0.7是分别含有或不含TX100的108细胞/ml的细胞提取物的淬灭校正因子。
结果脂肪酶活性实验的结果显示在表5中。从这些数据中无法计算形式动力参数(formal kinetic parameters)，因为底物的溶解度是不确定的。简言之，数据最容易与Kcat进行比较。这样，所得到的这些值显示出所测试的酶具有良好的脂肪酶活性。
在4UMP活性中，这些酶至少有两个数量级的变化。然而，4UMP活性与多种酶的乙酸萘酯，马拉硫磷或任何拟除虫菊酯的水解活性之间没有明显的相关性。因此，数据进一步表明酶作为一个基团为不同范围的底物提供有用的活性的多功能性。
同绿蝇E3和果蝇EST23一样，两种野生型酶，蚜虫E4和果蝇αE2具有出相当高的4UMP活性。因此α羧酸酯酶副进化枝中广泛具有水解4UMP的能力。
在E3突变体的三个活性位点亚区的每一个亚区中至少有一个数量级差异，并且在所有三个亚区中，都存在突变体，它们明显好于野生型。对于其它的底物，在所有三个亚区的突变都具有改善脂肪酶活性的潜能。
显然，在蚜虫E4和果蝇EST23中，W251L取代明显具有较高的4UMP活性，但是有趣的是在绿蝇E3中没有。然而，在后者中，W251T是一种明显的改进。F309L，也在酰基袋系列中，它被制备出来是因为发现Leu处于一些脂肪酶的等效位置，同时它也明显优于野生型。
F354L，处于阴离子位点，它被制备出来是因为在一些脂肪酶中也具有它并且它也显示出较高的4UMP活性。对于设计增强脂肪酶活性的酶来说，比较基因组法(comparative genomics)似乎是一种有前景的方法。一些优选变化的组合可实质性改变酯酶/脂肪酶水解疏水性(或相反，亲水性)底物的能力。
表5铜绿蝇酯酶E3，黑腹果蝇EST23，桃蚜E4以及额外的果蝇羧酸酯酶的天然和合成的变体的酯酶和脂肪酶活性，分别用α-乙酸萘酯和4-甲基伞形酮棕榈酸酯测定。 (使用家庭用微波炉的加热预备试验)使用的装置 松下电器产业公司制NE-8500额定电压 100V额定消耗电力 990W额定高频输出 500W微波频率数2450MHz炉腔尺寸 宽300mm深305mm高195mm试验方法按质量比相对于废小瓶片100％添加聚丙二醇48.7％，再加入作为催化剂的氧化二丁锡0.3％，使用挤出机在260℃-290℃下进行解聚，得到废小瓶片低聚物。另外，把该废小瓶片低聚物350g与450g分别加到500mL玻璃烧杯中，使用上述装置进行微波照射。由此得到下述表4表示的升温数据。采用该方法的微波加热效率如下，说明作为上述反应物质体系的直接加热方法有效。即，作为加热效率，由初期呈现80％以上、升温后也呈现40％水平的值确认加热效率充分。此外，加热效率由下式定义。
加热效率＝被加热物接受的热能量/微波加热能量表4
1、重复实验的标准误差2、没有进行重复实验3、活性是可检测的，但太低而无法定量实施例9昆虫酯酶的细菌表达在GST融合载体pGEX4T-1；his-标记融合载体pET146；以及产生未标记蛋白质的载体pTTQ18和pKK223-3中，已证实可成功地进行E3的细菌表达。已在广泛的大肠杆菌菌株中观察到成功的表达，这些菌株包括DH10B，TG1和B121(DE3)。这些表达系统将被普遍用于所有的昆虫酯酶或脂肪酶，和其突变体，包括E3的突变体，因为对于野生型E3和5突变体已经证实是成功的。
在整个说明书中词语“包括”，将被理解暗示成包含规定的成分、整体或步骤，或是成分、整体或步骤组，但不排除任何其它的成分整体或步骤，或是成分、整体或步骤组。
上述所有的公开文献全部以全文并入参考。
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它很容易被本领域技术人员领会，如特定实施方案中所显示的一样，在广泛描述的本发明的指导思想或范围内，可以对本发明进行多种变化和修改。因此，现在的实施方案只能认为是说明性的而不是限制性的。
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序列表<110>联邦科学技术研究组织<120>具有脂肪酶活性的酯酶<130>500185<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>570<212>PRT<213>Lucilia cuprina<400>1Met Asn Phe Asn Val Ser Leu Met Glu Lys Leu Lys Trp Lys Ile Lys1 5 10 15Cys Ile Glu Asn Lys Phe Leu Asn Tyr Arg Leu Thr Thr Asn Glu Thr20 25 30Val Val Ala Glu Thr Glu Tyr Gly Lys Val Lys Gly Val Lys Arg Leu35 40 45Thr Val Tyr Asp Asp Ser Tyr Tyr Ser Phe Glu Gly Ile Pro Tyr Ala50 55 60Gln Pro Pro Val Gly Glu Leu Arg Phe Lys Ala Pro Gln Arg Pro Thr65 70 75 80Pro Trp Asp Gly Val Arg Asp Cys Cys Asn His Lys Asp Lys Ser Val85 90 95
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<210>2<211>572<212>PRT<213>Drosophila melanogaster<400>2Met Asn Lys Asn Leu Gly Phe Val Glu Arg Leu Arg Gly Arg Leu Lys1 5 10 15Thr Ile Glu His Lys Val Gln Gln Tyr Arg Gln Ser Thr Asn Glu Thr20 25 30Val Val Ala Asp Thr Glu Tyr Gly Gln Val Arg Gly Ile Lys Arg Leu35 40 45Ser Leu Tyr Asp Val Pro Tyr Phe Ser Phe Glu Gly Ile Pro Tyr Ala50 55 60Gln Pro Pro Val Gly Glu Leu Arg Phe Lys Ala Pro Gln Arg Pro Ile65 70 75 80Pro Trp Glu Gly Val Arg Asp Cys Ser Gln Pro Lys Asp Lys Ala Val85 90 95Gln Val Gln Phe Val Phe Asp Lys Val Glu Gly Ser Glu Asp Cys Leu100 105 110Tyr Leu Asn Val Tyr Thr Asn Asn Val Lys Pro Asp Lys Ala Arg Pro115 120 125Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Phe Ile Ile Gly Glu Ala Asn130 135 140Arg Glu Trp Tyr Gly Pro Asp Tyr Phe Met Lys Glu Asp Val Val Leu145 150 155 160Val Thr Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ala Leu Gly Phe Met Ser Leu Lys165 170 175Ser Pro Glu Leu Asn Val Pro Gly Asn Ala Gly Leu Lys Asp Gln Val180 185 190
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Val Ile Cys Pro Leu Met His Phe Val Asn Lys Tyr Thr Lys Phe Gly405 410 415Asn Gly Thr Tyr Leu Tyr Phe Phe Asn His Arg Ala Ser Asn Leu Val420 425 430Trp Pro Glu Trp Met Gly Val Ile His Gly Tyr Glu Ile Glu Phe Val435 440 445Phe Gly Leu Pro Leu Val Lys Glu Leu Asn Tyr Thr Ala Glu Glu Glu450 455 460Ala Leu Ser Arg Arg Ile Met His Tyr Trp Ala Thr Phe Ala Lys Thr465 470 475 480Gly Asn Pro Asn Glu Pro His Ser Gln Glu Ser Lys Trp Pro Leu Phe485 490 495Thr Thr Lys Glu Gln Lys Phe Ile Asp Leu Asn Thr Glu Pro Ile Lys500 505 510Val His Gln Arg Leu Arg Val Gln Met Cys Val Phe Trp Asn Gln Phe515 520 525Leu Pro Lys Leu Leu Asn Ala Thr Glu Thr Ile Asp Glu Ala Glu Arg530 535 540Gln Trp Lys Thr Glu Phe His Arg Trp Ser Ser Tyr Met Met His Trp545 550 555 560Lys Asn Gln Phe Asp Gln Tyr Ser Arg His Glu Asn Cys Ala Glu Leu565 570 57权利要求
1.一种基于酶的生物催化方法，其中酶是一种昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体。
2.权利要求1的方法，其中基于酯酶或脂肪酶的生物催化包含或包括下列反应式 其中R，R2和R3是相同的部分Z，或R是部分Z的立体异构体的混合物，R2是部分Z的立体异构体及R3是富含Z部分的另一种立体异构体的立体异构体的混合物；R1，R4和R5是相同部分Y，或R1是部分Y的立体异构体的混合物，R5是该部分的一种立体异构体及R4是富含部分Y的另一种立体异构体的对映异构体的混合物；部分Z和Y可以分别选自任选地由多个杂原子之一间断的取代或未取代的烃部分；和X是一种亲核基团。
3.权利要求2的方法，其中立体异构体是对映异构体或位置立体异构体。
4.权利要求2的方法，在正向反应占优势的条件下进行。
5.前述任一项权利要求的方法，用于至少一种酸性酯的化学、区域或立体选择性水解。
6.权利要求5的方法，其中酯是一种含有酯基团的杀虫剂。
7.权利要求6的方法，其中酯是拟除虫菊酯。
8.权利要求7的方法，其中拟除虫菊酯选自由苄氯菊酯，cyloprothrin，氰戊菊酯，顺式氰戊菊酯，氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，d-fenothrin，cyfenothrin，丙烯菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯，四溴菊酯，胺菊酯，苄呋菊酯和氟氯氰菊酯组成的组中。
9.权利要求5的方法，其中酯是脂肪酸酯。
10.权利要求5至9任一项的方法，用于从羧酸酯立体异构体的混合物中分离立体异构体。
11.前述任一项权利要求的用于旋光分离(R)-酯化合物和(S)-酯化合物的混合物的方法，包含以下步骤(a)将昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体与该混合物接触，通过立体选择性水解(R)-酯化合物和(S)-酯化合物中的一种而获得一种旋光酸化合物或一种旋旋光醇化合物；以及(b)回收一种旋光化合物，该化合物选自由未被水解的旋光酸化合物、旋光醇化合物和旋光酯组成的组中。
12.权利要求1或2的方法，用于生产旋光酸。
13.权利要求12的方法，其中旋光酸是拟除虫菊酯酸。
14.权利要求13的方法，其中拟除虫菊酯酸选自由苄氯菊酯，cyloprothrin，氰戊菊酯，顺式氰戊菊酯S，氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，d-fenothrin，cyfenothrin，丙烯菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯，四溴菊酯，胺菊酯，苄呋菊酯和氟氯氰菊酯组成的组中。
15.权利要求1或2的方法，其中旋光酸是环丙烷羧酸。
16.权利要求1或2的方法，用于生产一种旋光醇。
17.权利要求16的方法，其中旋光醇是拟除虫菊酯醇。
18.权利要求17的方法，其中拟除虫菊酯醇是一种选自由苄氯菊酯，cyloprothrin，氰戊菊酯，顺式氰戊菊酯，氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，甲氰菊酯，d-fenothrin，cyfenothrin，丙烯菊酯，氯氰菊酯，溴氰菊酯，四溴菊酯，胺菊酯，苄呋菊酯和氟氯氰菊酯组成的组中的拟除虫菊酯的醇。
19.权利要求1或2的方法，其是一种酯基转移或酯交换反应。
20.权利要求1或权利要求2的方法，用于改变植物油或脂肪从而适合用于乳剂和其它基于脂肪的食品。
21.权利要求20的方法，其中食品选自由人造黄油、人造奶油和冰淇淋组成的组中。
22.权利要求1或权利要求2的方法，用于生产一种聚合物。
23.权利要求22的方法，其中聚合物是一种聚酯。
24.权利要求23的方法，其中聚酯通过双官能的酯和醇的相继酯化和酯交换，双官能单体的自缩合作用以及内酯的开环聚合而得到。
25.权利要求1或权利要求2的方法，在逆反应主导的条件下进行。
26.权利要求25的方法，用于底物的酰化。
27.权利要求1至26任一项的方法，其中昆虫酯酶或脂肪酶是α-羧酸酯酶。
28.权利要求27的方法，其中突变体昆虫酯酶或脂肪酶是α-羧酸酯酶，并且在该酯酶或脂肪酶的活性位点的氧离子空穴、酰基结合口袋或阴离子位点区域，或其任意组合处具有突变。
29.权利要求28的方法，其中突变体昆虫酯酶或脂肪酶选自由E3G137R，E3G137H，E3W251L，E3W251S，E3W251G，E3W251T，E3W251A，E3W251L/F309L，E3W251L/G137D，E3W251L/P250S，E3F309L，E3Y148F，E3E217M，E3F354W，E3F354L，和EST23W251L组成的组中。
30.权利要求27或权利要求28的方法，其中α-羧酸酯酶，或其突变体，包含一种序列，该序列选自由下列序列组成的组中i)如SEQ ID NO1所示的序列，ii)如SEQ ID NO2所示的序列，iii)如SEQ ID NO3所示的序列，iii)一种与i)至iii)的任意一种至少40％相同的能够水解疏水酯的序列。
31.权利要求30的方法，其中所述序列与i)或ii)至少80％相同。
32.权利要求30的方法，其中所述序列与i)或ii)至少90％相同。
33.前述任一项权利要求的方法，其中昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体通过一种重组宿主细胞表达。
34.权利要求33的方法，其中宿主细胞是细菌细胞。
35.权利要求33的方法，其中宿主细胞是真菌细胞。
36.一种用于生成和选择水解疏水酯的酶的方法，该方法包括(i)将一种或多种突变引入昆虫酯酶或脂肪酶，或者已经被突变的昆虫酯酶或脂肪酶中，并且(ii)确定突变体昆虫酯酶或脂肪酶水解疏水酯的能力。
37.权利要求36的方法，其中疏水酯是脂肪酸酯。
38.权利要求36或权利要求37的方法，其中一种或多种突变能够提高酯酶或脂肪酶的水解活性和/或改变立体专一性。
39.权利要求36至38任意一项的方法，其中昆虫酯酶或脂肪酶是α-羧酸酯酶。
40.权利要求39的方法，其中α-羧酸酯酶具有一种序列，所述序列选自由下列序列组成的组中i)如SEQ ID NO1所示的序列，ii)如SEQ ID NO2所示的序列，iii)如SEQ ID NO3所示的序列，和iv)与i)至iii)的任意一种序列至少40％相同的序列。
41.权利要求40的方法，其中所述序列与i)至iii)的任意一种序列至少80％相同。
42.权利要求40的方法，其中所述序列与i)至iii)的任意一种序列至少90％相同。
43.权利要求36至42任意一项的方法，其中一种或多种突变位于酯酶或脂肪酶的选自以下一组的区域内氧离子空穴、酰基结合口袋和阴离子位点。
44.权利要求36至43任意一项的方法，其中突变是点突变。
45.权利要求44的方法，其中已经发生突变的昆虫酯酶或脂肪酶选自由E3G137R，E3G137H，E3W251L，E3W251S，E3W251G，E3W251T，E3W251A，E3W251L/F309L，E3W251L/G137D，E3W251L/P250S，E3F309L，E3Y148F，E3E217M，E3F354W，E3F354L，和EST23W251L组成的组中。
46.一种用于生成和选择能够水解酯的昆虫α-羧酸酯酶的方法，该方法包括(i)将一种或多种突变引入昆虫α-羧酸酯酶，或者已经被突变的昆虫α-羧酸酯酶中，并且(ii)确定突变体昆虫α-羧酸酯酶水解酯的能力。
47.通过权利要求36至46任意一项的方法获得的酶。
全文摘要
本发明涉及昆虫酯酶或脂肪酶，或其突变体在生物转化过程中作为催化剂的应用。本发明可以应用于包括水解、酯化、酯基转移、酯交换或酰化反应的任意方法中。本发明还可以应用于化合物的酶分解反应以得到旋光化合物，并且特别的，但不是唯一的应用于具有疏水部分如拟除虫菊酯和脂肪酸酯的底物。
文档编号C12N9/20GK1617931SQ02827889
公开日2005年5月18日 申请日期2002年2月6日 优先权日2002年2月6日
发明者约翰·格雷厄姆·奥克肖特, 艾伦·德文希尔, 克里斯托弗·韦恩·科平, 拉玛·黑达里, 苏珊·简·多里安, 罗宾·乔伊丝·拉塞尔 申请人:联邦科学技术研究组织