专利名称：一种尖吻蝮蛇毒纤溶酶及其纯化方法
现有技术中，关于使用蝮蛇毒来提取抗血栓药物的报道较多，例如，中国医科大学学报，1989.18(专刊)中公开的“抗栓酶1、2、3号研制”一文；CN92102645.5(CN1065680.A)中公开的“提取尖吻蝮蛇蛇毒去纤酶技术”等，国外目前也有多种蛇制剂，例如Ancrod(英国)等。这些蛇毒类抗栓药物，是从蛇毒中提取的蛋白酶组分，从其作用机理上看，都是一种凝血酶样酶，存在着出血副作用，另一方面，由于分离纯化手段问题，使其制品不是高纯度的单一蛋白酶组分，而是多组分的混合物，从而造成了这类药物进一步推广使用的障碍。
本发明的目的在于改进分离纯化方法，从尖吻蝮蛇毒中提取对血栓有直接溶解作用的高纯度的纤溶酶。
本发明所述的纤溶酶，是从尖吻蝮蛇毒中提取并纯化含Ca++金属的蛋白酶溶液，其特征在于，其分子量为2.8-3.2万，氨基酸组分分析表明，该酶中天冬氨酸，谷氯酸含量均为2～5％，氨基酸序列分析表明，该酶的N末端为天门冬氨酸(ASP)，其纤溶活力为1-3纤溶活力单位/毫克蛋白，该酶对纤维蛋白有直接水解作用，但对酪蛋白无水解作用，具有较高的特异性，能对纤维蛋白原的A(α)链起作用。动物药效学实验表明，该酶能有效地溶解动、静脉血栓，能有效地防止血栓生成，降低血液粘度，改善微循环，同时该酶对凝血系统影响小，出血可能性小。与现有的其它蝮蛇蛇毒中提取的纤溶酶相比，该酶的分子量较低，纤溶作用明显提高，出血活性小。
本发明所述尖吻蝮蛇毒纤溶酶的纯化方法，包括(1)将粗蛇毒用缓冲液溶解，然后经离心沉淀，阴离子交换柱层析分离，洗脱粗分得到纤溶组分；(2)将该纤溶组分浓缩后经凝胶过滤层析得到精制的纤溶酶原液；(3)将该纤溶酶原液脱盐处理得到纯化的纤溶酶液，其特征在于a)在洗脱粗分中，所述缓冲液洗脱是同时进行缓冲液PH直线梯度洗脱和盐直线梯度洗脱，其中，缓冲液PH直线梯度为PH7.5-8.5至PH6.0-7.0，盐直线梯度为0-0.5M，洗脱速度为25-80ml/hr；b)全工序操作在4-10℃温度范围内进行。
在上述分离纯化过程中，首先取粗毒用适量缓冲液溶解，所述溶解及粗分洗脱用缓冲液是0.02M，PH7.5-8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)或0.02M PH7.5-8.5的磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液，所述阴离子交换柱层析中，所用的阴离子交换剂为弱酸性阴离子交换剂。例如DEAE sephadex A50，DEAE sepharose Fast Flow等，在所述的凝胶过滤层析中，所用的凝胶是用于分离分子量在5000～30万范围之内的物质的凝胶，例如Sephacryl_S-100HR、S-200HR、S-300HR、Sephadex G75等，所用凝胶过滤层析用缓冲液为0.05-0.30M的氯化钠(NaCl)溶液，所述脱盐是指对蒸馏水脱盐1-6小时，所述浓缩是指超滤浓缩，或者冷风吹干(样品置于透析袋中)，或者冷冻干燥。
与现有技术相比，本发明所述分离并纯化尖吻蝮蛇毒纤溶酶的方法简单，产品纯度高，由于同时进行PH直线梯度和盐梯度洗脱，缩短了工艺流程，尤其是十分明显地缩短了纯化周期，有利于提高工业化生产效率。
下面通过实施例对其纯化过程进一步描述实施例1。
(1)将皖南产尖吻蝮蛇毒3g溶于20ml的0.02M PH8.0 Tris-HCl缓冲液中，在3000转/分离心泵中离心15min，取上清液，沉淀用上述缓冲液5ml搅匀，再离心一次，取上清液，并与上次离心所得的上清液合并，置冰箱中4℃保存。
(2)将DEAE Sephadex A-50阴离子交换剂，经碱-酸处理后，用蒸馏水洗涤至中性，再用0.02M PH8.0的Tris-HCl缓冲液洗涤该胶至洗脱液PH值为8.0，再沸水浴2小时，以脱气、溶胀，冷却后装柱。
(3)取步骤(2)中处理好的胶装柱，柱体积为3×80cm3，平衡后，取步骤(1)中溶解蛇毒所得的上清液上样，直线梯度洗脱，贮瓶缓冲液为Tris-HCl 0.02M，PH6.3，含0.5M NaCl，梯度瓶缓冲液为0.02M，Tris-HCl缓冲液，PH8.0，流速42ml/hr，UV280nm检测洗脱液，上样48小时后用自动部分收集器收集，每管7ml，每小时6管，共洗脱12个峰，其中第6峰即为粗分的纤溶组分，约120ml，含酶量300mg。
(4)将上述粗分的纤溶酶液，装入透析袋中，冷风吹干至体积约为15ml左右，冰箱中4℃保存。
(5)取Sephacryl S-200HR为凝胶层析介质，装凝胶层析柱，柱体积为2.5×70cm3，用0.5M的NaCl溶液以99ml/hr的流速清洗1小时后，用0.15M的NaCl溶液平衡，取上述浓缩好的粗分的纤溶酶液上样，用0.15M NaCl溶液洗脱，流速为18ml/min，第2峰即为精制的纤溶酶原液，共70ml，酶量为170mg。
(6)取上述精制的纤溶酶原液装入透析袋中，对蒸馏水透析3小时，即得纯化的纤溶酶。酶量为170mg，经检测，该酶纤溶活力为1个活力单位/毫克蛋白(纤溶活力单位)，等电点为5.8，其分子量为3万，经检查无出血毒副作用。
实施例2(1)取皖南尖吻蝮蛇毒4.5g用0.02M，PH7.8的磷酸盐缓冲液溶解，其他操作同实施例(1)中步骤(1)，取上清液合并后，冰箱中4℃保存。
(2)同实施例(1)步骤(2)。
(3)取上述步骤处理好的胶装柱，柱体积增大至1600ml(4.6×100cm3)其它条件不变，层析后可得酶量460mg。
(4)将上述粗分纤溶酶液，装入透析袋中，冷风吹干至体积约为20ml左右；(5)取Sephacryl S-300HR为凝胶层析介质，装凝胶层析柱，柱体积为3.1×70cm3，用0.5M的NaCl溶液以99ml/hr的流速清洗1小时后，用0.2M的NaCl平衡，取上述浓缩好的样品上样，洗脱液为0.20M NaCl溶液，流速24ml/min，第2峰即为精制的纤溶酶原液，经脱盐处理得纯酶共100ml，酶量为280mg。
实施例3(1)取尖吻蝮蛇毒3g溶解，方法同实施例1步骤(1)。
(2)阴离子交换剂为DEAE sepharose Fast Flow，胶处理与装柱同实施例1步骤(2)，柱体积为3×80cm3，用0.02M PH8.0的Tris-HCl缓冲液以1.5ml/min的流速冲洗平衡，上样，直线梯度洗脱，洗脱液同实施例1步骤(3)，流速80ml/hr，收集可得酶量285mg。
(3)余下操作同实施例1，可得精制纤溶酶60ml，酶量160mg，经检查纤溶活力合格，无出血副作用。
权利要求
1.一种尖吻蝮蛇毒纤溶酶，是从尖吻蝮蛇蛇毒中提取并纯化的含Ca++的金属蛋白酶溶液，其特征在于其分子量2.8-3.2万，氨基酸组分分析表明，该酶中天冬氨酸、谷氨酸的含量均为2～5％；由氨基酸序列分析表明，该酶的N末端为天门冬氨酸(ASP)，其纤溶活力为1-3纤溶活力单位/毫克蛋白。
2.如权利要求1所述的尖吻蝮蛇毒纤溶酶的纯化方法，包括(1)将粗蛇毒用缓冲液溶解，然后经离子沉淀、阴离子交换柱层析分离，洗脱粗分得到纤溶组分；(2)将该纤溶组分浓缩后经凝胶过滤柱层析得到精制的纤溶酶原液；(3)将该纤溶酶原液脱盐处理得到纯化的纤溶酶液，其特征在于a)在洗脱粗分中，所述用缓冲液洗脱是同时进行缓冲液PH直线梯度和盐直线梯度洗脱，其中缓冲液PH直线梯度为PH7.5-8.5至PH6.0-7.0；盐直线梯度为0-0.5M，洗脱速度为25-80ml/hr。b)全工序操作在4-10℃温度范围内进行。
3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于所述溶解粗蛇毒及粗分洗脱缓冲液是0.02M，PH7.5-8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，或0.02M PH7.5-8.5的磷酸盐(Na2HPO4-NaH2PO4)溶液。
4.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于凝胶过滤层析所用胶是用于分离分子量在5000-30万范围的物质的凝胶；所用缓冲液为0.05-0.30M的氯化钠(NaCl)溶液。
5.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于在阴离子交换柱层析中，所用的阴离子交换剂为弱酸性阴离子交换剂。
6.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于所述对纤溶酶原液脱盐处理是指其对蒸馏水脱盐1-6小时。
7.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于所述对纤溶组分浓缩是指超滤浓缩，或冷风吹干(样品置透析袋中)，或冷冻干燥。
全文摘要
本发明涉及从尖吻蝮蛇毒中提取的抗血栓药物纤溶酶及其纯化方法，该纤溶酶的分子量2.8-3.2万，含有Ca
文档编号A61K38/48GK1120070SQ9510988
公开日1996年4月10日 申请日期1995年10月9日 优先权日1994年12月26日
发明者王淳, 黄婉治, 承新, 康莲娣, 罗丹 申请人:合肥兆峰科大药业有限公司