专利名称：一种新的体外研究减轻瘢痕愈合的方法
技术领域：
本研究利用Smad3基因剔除的小鼠及其成纤维细胞对皮肤创伤愈合过程中的瘢痕形成进行了研究，并对减轻瘢痕形成的机制作了进一步的探索。
目前，已知有众多的细胞因子参与创伤组织修复过程，其中包括血小板衍生生长因子(PDGF)(2)、转化生长因子α(TGF-α)(3)、酸性或碱性成纤维细胞生长因子(FGFs)(3)、上皮细胞生长因子(EGF)(4)、胰岛素样生长因子(IGF1)(5)等。转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)是这其中重要的一员(6)。
TGF-β是一个由分泌型的多肽信号分子构成的细胞因子超家族，包括TGF-βs、活化素(activins)、抑制素(inhibins)、骨形态形成蛋白(bonemorphogenetic proteins，BMPs)等(7)。TGF-β在创伤愈合过程中是起关键作用的活性分子。但到目前为止，TGF-βs具体的作用机制尚不完全清楚。目前的研究表明，TGF-βs在创伤愈合过程中具有趋化作用、削弱瘢痕形成、改变伤口愈合进度、控制纤维化等作用(8)。
创伤修复是个复杂、渐进的过程，其最终结果是闭合创面，恢复组织结构的完整性。在无法完全恢复时，即形成瘢痕。瘢痕形成过程涉及的因素很多。在创伤修复早期，主要以胶原蛋白、弹力纤维、纤维连接蛋白、层蛋白的胞外基质的合成与分泌的过程为主，以分解基质的酶类合成为辅。其主要功能是填补组织缺损、封闭创面。而在愈合的晚期，ECM逐渐机化融合，分解基质的酶类合成较为活跃，降解部分多余的ECM，形成瘢痕。所以瘢痕的形成就取决于ECM的沉积和降解这两个进程的关系。已知具有降解ECM功能的酶种类有很多，主要的是被称为基质金属蛋白酶(MMP)的一类蛋白酶(9)。
基质金属蛋白酶因为可以降解ECM、其活性中心部位含有Zn++、Ca++等金属离子而得名，不同的MMP作用底物虽不尽的相同，但相互之间有广泛的交叉。其中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)，又称明胶酶A，是胶原酶的一种，其作用底物为明胶、IV型、V型、VII型、X型和XII型胶原、弹性纤维、玻连蛋白、层蛋白以及可聚蛋白多糖(10)。MMP-2在正常组织中可以检测到，主要功能在于维持ECM的自稳平衡。但在一些病理过程中，MMP-2则参与胶原分解、组织重建、血管发生以及肿瘤转移等重要病理生理过程。
本发明的第一个方面，提供了一种在实验动物体外研究减轻瘢痕愈合的方法。包括步骤3.1.1 利用同源重组技术产生Smad3基因缺失小鼠、Smad3基因杂合子小鼠和Smad3基因野生型小鼠。3.1.2 利用3.1.1中产生的Smad3基因杂合子小鼠并交配，取14天的小鼠胚胎，提取成纤维细胞并进行基因型鉴定。3.1.3 将步骤3.1.2获得的Smad3不同基因型的小鼠胚胎成纤维细胞进行传代培养。3.1.4 将步骤3.1.2获得的Smad3不同基因型的小鼠胚胎成纤维细胞体外培养并检测细胞培养液基质金属蛋白酶的活性。3.1.5 将步骤3.1.2获得的Smad3不同基因型的小鼠胚胎成纤维细胞体外培养并检测细胞中基质金属蛋白酶mRNA的表达情况3.1.6 将步骤3.1.2获得的Smad3野生型小鼠成纤维细胞转染Smad3 cDNA的显性负效片段pFlag-CMV2-Smad3Rev，用以阻断Smad3基因mRNA的表达。3.1.7 将步骤3.1.6获得的成纤维细胞进行培养，检测细胞培养液中基质金属蛋白酶的活性。3.1.8 将步骤3.1.6获得的成纤维细胞进行培养，检测细胞MMP-2 mRNA表达情况。3.1.9 将步骤3.1.2获得的Smad3基因缺失的小鼠成纤维细胞转染野生型Smad3基因pFlag-CMV2-Smad3，使其瞬时表达野生型Smad3。3.1.10 将步骤3.1.9获得的成纤维细胞进行培养，检测细胞培养液中MMP-2的活性。3.1.11 将步骤3.1.9获得的成纤维细胞进行培养，检测细胞MMP-2的mRNA表达情况。
本发明的第二个方面，提供了一种在实验动物体内验证减轻瘢痕愈合的方法。包括步骤3.2.1 利用同源重组技术产生Smad3基因缺失小鼠和Smad3基因野生型小鼠。3.2.2 将3.2.1产生的小鼠按基因型分组，作皮肤缺失性创伤，依不同时间段收集皮肤创伤组织作病理学分析。3.2.3 将3.2.1产生的小鼠依据基因型不同分组，作皮肤缺失创伤，依不同时间段收集皮肤创伤组织作免疫组织化学分析。3.2.4 将3.2.1产生的小鼠依据基因型进行分组，取血清检测，比较其中MMP-2的活性。
具体实施方式
本发明人采用分子生物学方法，应用不同的Smad3基因型小鼠及其成纤维细胞进行创伤愈合瘢痕形成的研究。在创伤愈合的主要效应细胞一成纤维细胞中可见Smad3的缺失增加MMP-2的表达。主要表现为Smad3抑制MMP-2的活性及mRNA表达。在Smad3基因缺失的实验动物—小鼠中可见皮肤创伤愈合后瘢痕形成轻。同时实验动物血清中MMP-2活性的增高。这为研究减轻创伤愈合后瘢痕的形成提供了一个方法，即利用各种方法，阻断Smad3在创伤愈合局部的表达或者提高局部的MMP-2的活性可以减轻创伤愈合后的瘢痕形成。
4.1 Smad3基因剔除小鼠成纤维细胞培养液中MMP-2活性增高。
4.2 Smad3基因剔除小鼠成纤维细胞MMP-2的mRNA表达量升高。
4.3 在成纤维细胞水平阻断Smad3野生型的成纤维细胞Smad3 mRNA的表达增加细胞表达MMP-2并提高细胞培养液中MMP-2的活性。
4.4 在成纤维细胞水平补偿Smad3缺失的成纤维细胞Smad3 mRNA表达抑制细胞表达MMP-2并降低细胞培养液中MMP-2的活性。
4.5 Smad3基因剔除小鼠创伤愈合瘢痕形成减轻。
4.6 Smad3基因剔除小鼠创伤局部MMP-2表达量增高。
4.7 Smad3基因剔除小鼠血清中MMP-2活性增高。
参考文献1.王德文.创伤修复的病理学.见付小兵，王德文主编.现代创伤修复学.北京人民军医出版社，1999.17～302.Steenfos，H.H.″Growth factors and wound healing.″Scand.J.Plast.Reconstr.Surg.Hand Surg.1994，28(2)95-1053.Robinson，C.J.Growth factorstherapeutic advances in wound healing.Ann.Med.1993，25(6)535-384.Chen，J.D.et al.Epidermal growth factor(EGF)promotes humankeratinocyte Iocomotion on collagen by increasing the alpha 2 integrinsubunit.Exp.Cell Res.1993，209(2)216-235.Gartner，M.H.，J.D.Benson，and Caldwell，M.D.Insulin-like growthfactors I and II expression in the healing wound.J.Surg.Res.1992，52(4)389-946.Martin P，Wound healing-Aiming for perfect skin regeneration.Scinece，1997，27675-817.Kingsley D.M.The TGF-βsuperfamilynew members，new receptors andnew genetic tests of function in different organisms.Genes Dev，1994，8133-1468.毛春明，杨晓，TGF-β在创伤愈合中的作用.军事医学科学院院刊.2001，25(3)232-2359.Gearing A.J.H.，Beckett P.，Christodoulou M.，et al.Processing of tumournecrosis factor-α)precursor by metalloproteinases.Nature1994，374555-55710.Oikarinen A.，Kylmaniemi M.，Autio-Harmainen H.，Autio P.，Salo T.，Demonstration of 72-kDa and 92-kDa forms of type IV collagenase inhuman skinVariable expression in various blistering diseases，inductionfuring re-epithelization and decrease by topical glucocorticoids.J InvestDermatol 1993，101205-210
权利要求
1.一种体外研究创伤愈合机制的方法，其特征在于通过同源重组和成纤维细胞体外培养技术获得Smad3双等位基因剔除、单等位基因剔除和野生型等三种Smad3基因型的成纤维细胞。
2.一种刺激成纤维细胞中MMP-2活性的方法，其特征在于通过剔除Smad3基因增强成纤维细胞培养液中MMP-2的活性。
3.一种刺激成纤维细胞中MMP-2活性的方法，其特征在于利用显性负效原理将反义Smad3cDNA导入Smad3野生型成纤维细胞中阻断Smad3 mRNA翻译以增加MMP-2的活性。
4.利用如权利要求1所述的成纤维细胞进行MMP-2活性分析，寻找抑制Smad3活性的分子。
5.利用如权利要求1所述的成纤维细胞进行MMP-2活性分析，寻找刺激MMP-2活性的分子。
6.利用如权利要求1所述的成纤维细胞进行MMP-2活性分析，寻找MMP-2功能类此物。
7.利用如权利要求1所述的成纤维细胞进行减轻瘢痕形成的药物筛选。
8.利用如权利要求1所述的成纤维细胞进行减轻瘢痕形成的药物的评价。
9.利用如权利要求2所述的方法进行减轻瘢痕形成的药物设计。
10.利用如权利要求3所述的方法进行减轻瘢痕形成的药物设计。
全文摘要
本发明提供了一种利用抑制Smad3基因增强基质金属蛋白酶－2(MMP－2)的活性以减轻创伤后瘢痕愈合的方法。包括步骤1)获得不同Smad3基因型的成纤维细胞并进行基因型鉴定；2)构建Smad3显性负效表达载体；3)通过显性负效方法抑制成纤维细胞的Smad3 mRNA的翻译使MMP－2mRNA的表达升高及MMP－2活性增加；4)将野生型Smad3导入到Smad3缺失的成纤维细胞中可抑制MMP－2的活性和mRNA的表达。本发明还提供了研究创伤愈合瘢痕形成的机理以及用于研制减轻瘢痕形成的分子与药物的方法。以及利用Smad3基因剔除的成纤维细胞研究减轻瘢痕形成的分子机制，为获得可应用于临床的减轻瘢痕形成的分子或药物提供理论基础与研究方向，即利用各种方法，阻断Smad3在创伤愈合局部的表达或者提高局部的MMP－2的活性可以减轻创伤愈合后的瘢痕形成。
文档编号C12Q1/02GK1451743SQ0211740
公开日2003年10月29日 申请日期2002年4月19日 优先权日2002年4月19日
发明者杨晓, 黄翠芬, 毛春明, 吕娅歆, 周江 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所