专利名称：：齐墩果酸在制备治疗皮肤瘢痕药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是齐墩果酸在制备治疗皮肤瘢痕药物中的应用。
背景技术：
：瘢痕是创伤修复的必然产物，凡涉及真皮层的伤口几乎都以瘢痕愈合而告终。过度增生的瘢痕常会破坏人体表面的完整性或伴有各种程度的功能障碍，给病人带来精神和身体上的双重痛苦。皮肤瘢痕发病率高，但目前临床应用的药物或疗效不够理想，或副作用较多，或有效成分不明确难以大量推广应用。齐墩果酸(Oleanolicacid,OA)为白色针状结晶，是中药女贞子中的主要有效成分。熔点309°C，可溶于甲醇、乙醇、苯、乙醚、丙酮和氯仿，几乎不溶于水，对酸碱均不稳定。其结构式如下。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>HsCCHs齐墩果酸齐墩果酸的植物来源来源于木樨科植物齐墩果OleaeuropaeaL.叶，女贞LigustrumlucidumAit.果实，龙胆科植物青叶胆SwertiamileensisT.N.HeetW.L.Shi全草。广泛分布于自然界中。齐墩果酸具有肝保护、抗癌、抗突变的作用以及对免疫系统和心血管的作用。在实验研究中发现，OA可使变性坏死的肝组织恢复正常来减轻丙氨酸活力下降、肝组织炎症反应减弱、血中丙种球蛋白下降，并能促进肝细胞再生，使坏死区迅速修复，从而抑制胶原纤维增生，使肝硬变难以形成(李志梅，孙志勇，刘华庆.齐墩果酸对大鼠肝损伤的保护作用[J]·贵州医药，2004，28(7):582)。有研究认为，OA对结肠癌细胞系HCT15产生影响的作用机制是通过阻断肿瘤细胞的细胞周期而抑制肿瘤细胞的增殖(LiJ，GuoWJ,YangQY.EffectsofursolicacidandoleanolicacidonhumancoloncarcinomacelllineHCT15[J],WorldJGastroenterol,2002,8(3):493.)。动物实验结果表明OA对II、III、IV型变态反应具有明显抑制作用(王立新，韩广轩，刘文庸，等.齐墩果酸的化学与药理研究.药学实践杂志，2001，19(2):10)。齐墩果酸对心血管疾病的作用是齐墩果酸药理作用研究的新发现。SomowtLO等首次提出OA具抗高血压及强心活性。研究指出，OA对实验性高血压大鼠无直接降压作用，但有直接的强心作用。当大鼠长期(6wk)服用OA60mg/kg后，能有效抑制严重高血压的发展，且OA的降血脂及抗氧化活性比熊果酸高(SomovaL0,NadarA,RammananP，etal.Cardiovascular,antihyperlihpidemicandantioxidanteffectsofoleanolicandursolicacidsinexperimentalhypertension[J].Phytomedicine,2003，10(23):115-121.)。但至今未见有关齐墩果酸促进瘢痕成纤维细胞凋亡的报导。
发明内容本发明对齐墩果酸提供一种制备治疗瘢痕药物的新用途。经过体外细胞实验和动物实验，表明齐墩果酸能显著促进瘢痕成纤维细胞凋亡，抑制兔耳瘢痕增生。所以，齐墩果酸可以用于制备治疗瘢痕的药物。图1为齐墩果酸对人增生性瘢痕细胞活力(0D值)的影响2为齐墩果酸对瘢痕成纤维细胞凋亡的流式二维点3为齐墩果酸对瘢痕成纤维细胞caspase-3活性的影响4为齐墩果酸抑制兔耳瘢痕增生的瘢痕指数5为齐墩果酸抑制兔耳增生性瘢痕组织I型胶原6为齐墩果酸升高兔耳增生性瘢痕组织MMPl7为齐墩果酸抑制兔耳增生性瘢痕组织TGF-β1图具体实施例方式齐墩果酸诱导人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞凋亡实验(一)试剂1.胎牛血清(FBSHyclone)2.磷酸缓冲液(PBSHyclone)3.二甲基亚砜(DMS0Sigma)4.甲基四唑蓝(MTTAmresco)，用PBS配制成0.5%MTT5.0.25%胰酶、0.25%胰酶(不含EDTA)(Sigma)6.DMEM细胞培养液(Sigma)7.齐墩果酸(中国药品生物制品检定所，批号110709-200505)8.细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物技术发展有限公司)9.凯基Caspase-3分光光度法检测试剂盒(南京凯基生物技术发展有限公司)10.兔I型胶原酶联免疫试分析试剂盒(上海朗顿生物技术有限公司)11.兔基质金属蛋白酶1(MMPl)酶联免疫试分析试剂盒(上海朗顿生物技术有限公司)12.兔转化生长因子β1(TGF-β1)酶联免疫分析试剂盒(上海朗顿生物技术有限公司)(二)制备人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞取16-30岁病人皮肤增生性瘢痕，在无菌条件下，去除表皮和皮下组织，生理盐水反复冲洗后剪切成0.5-1.Omm3的组织块，接种于一次性培养瓶壁上，组织块间距0.3-0.5mm，加入FBS适量，按常规在细胞培养箱内倒置培养2h后，加入含20%FBS的DMEM培养液(含青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)5ml继续培养，每周换液2次。待原代细胞生长基本融合成片时，吸除培养液，PBS液漂洗2次后加入0.25%胰酶消化约lmin，倒置显微镜下见胞质回缩、细胞间隙增大时，吸弃胰酶，加入含10%FBS的DMEM培养液终止消化，吸管轻轻吹打瓶壁细胞使呈细胞悬液，按13比例分装传代，使用第3-6代细胞进行以下实验。(三)齐墩果酸对瘢痕成纤维细胞活力影响实验MTT比色实验是一种检测细胞存活和生长的方法。酶联免疫检测仪所测得的光吸收值间接地反映了细胞活力。本实验将齐墩果酸用DMEM配制成浓度分别为0、10、20、40、80μg/ml溶液。其中0μg/ml组即为空白对照组。取对数生长期的瘢痕成纤维细胞，用含10%FBS的DMEM培养液配制成5XIO4个/ml的细胞悬液，以每孔100μ1分别接种于3块96孔培养板，置CO2培养箱培养24h后，吸弃培养液，用PBS洗一遍，加入DMEM100μ1，做细胞饥饿处理12h。然后，吸弃DMEM，每块板分别加入上述配制的不同浓度的齐墩果酸溶液100μ1/孔，每组10个平行孔，继续培养，3块板分别于12h、24h加入0.5%MTT20μ1染色，继续培养4h，吸弃培养液，每孔加DMSO150μ1，振荡10-15min，自动酶标仪测定OD值(波长570nm)，分别测得不同浓度齐墩果酸培养不同时间的细胞活力(细胞活力=实验组吸收值/空白对照组吸收值X100%)，重复做三批细胞实验，结果见图1。由图1可见，在12h、24h不同的时间点，齐墩果酸各剂量组与空白对照组相比，细胞活力均有显著下降，且呈明显的量效和时效关系。特别是>20μg/ml剂量组对成纤维细胞增殖抑制非常明显，与空白对照组相比有显著性差异。说明齐墩果酸能明显抑制瘢痕成纤维细胞的增殖。(四)齐墩果酸对增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响实验流式细胞术可以研究细胞的各种功能状态，包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等。本实验将齐墩果酸用DMEM配制成浓度分别为0和40μg/ml溶液。其中0μg/ml组即为空白对照组。将对数生长期的瘢痕成纤维细胞，用含10%FBS的DMEM培养液配制成1.5XIO5个/ml的细胞悬液，以每孔2ml分别接种于1块6孔培养板，置CO2培养箱培养24h后，吸弃培养液，用PBS洗一遍，加入2ml的DMEM培养液，饥饿12h。然后，吸弃DMEM，分别加入上述配制的不同浓度的齐墩果酸溶液2ml/孔，继续培养12h后，吸弃培养液，0.25%胰酶(不含EDTA)消化，1500rpm离心5min,PBS缓冲液洗涤2次，分别加入500μ1的BindingBuffer悬浮细胞，加入AnnexinV-FITC和PropidiumIodide各5μ1，混勻；室温避光反应5-15min，流式细胞仪分析细胞凋亡率。其凋亡二维点图可分为四个象限，左上为死亡细胞；左下为活细胞；右上为晚期凋亡和死亡细胞；右下为早期凋亡细胞；凋亡率为右上部分与右下部分凋亡和死亡细胞百分率之和；结果见图2。由图2可见，齐墩果酸作用12小时后，细胞凋亡明显，随给药浓度增加，凋亡率显著增加。给药组早期和晚期凋亡率分别为71.09%和19.28%，显著高于空白对照组的6.08%和5.56%。说明齐墩果酸能显著抑制瘢痕成纤维细胞的增殖且能诱导其凋亡。(五)齐墩果酸对瘢痕成纤维细胞caspase-3活性的影响Caspase(Cysteine-requiringAspartateProtease)是一个在细胞调亡过禾呈中起重要作用的蛋白酶家族。本实验将齐墩果酸用DMEM配制成浓度分别为0、10、20、40μg/ml溶液。其中Oyg/ml组即为空白对照组。将对数生长期的瘢痕成纤维细胞，用含10%FBS的DMEM培养液配制成1.5XIO5个/ml的细胞悬液，以每孔2ml分别接种于1块6孔培养板，置CO2培养箱培养24h后，吸弃培养液，用PBS洗一遍，加入2ml的DMEM培养液，饥饿12h。然后，吸弃DMEM，分别加入上述配制的不同浓度的齐墩果酸溶液2ml/孔，继续培养12h后，吸收细胞培养基，用胰酶消化并收集细胞；用PBS洗涤细胞两次(离心2000rpm，5min)收集35XIO6个细胞，尽量去除PBS上清；在收集的沉淀细胞中加入50μ1冰冷LysisBuffer(注意使用前每50μ1LysisBuffer加入0.5μ1DTT)，吹打均勻；置冰上裂解20min，其间涡旋振荡34次，每次IOs；4°C，离心(10，OOOrpm)Imin；小心吸取上清(含裂解的蛋白质)转移至新的管中，并放置冰上待用；取少量上清(12μ1)，按常规方法(Braford法)测定其中的蛋白浓度。再吸取50μ1含100200μg蛋白的细胞或组织裂解上清；如体积不足50μ1，则用LysisBuffer补足至总体积50μ1(各组均采用同样的蛋白量进行测定禾口比较)；力口入50μ1的2XReactionBuffer；力口入5μ1Caspase-3Substrate并于37°C避光孵育4小时；用酶标仪或分光光度计(100μ1的比色皿)在λ=405nm测定其吸光值。通过计算OD诱导剂/OD阴性对照(50μ1LysisBuffer+50μ12XReactionBuffer)的倍数来确定凋亡诱导剂组Caspase-3活化程度。结果见图3。由图3可见，齐墩果酸作用12小时后，caspase-3显著高于空白对照组。说明齐墩果酸能够明显诱导增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡。齐墩果酸对兔耳增生性瘢痕的抑制实验本实验分成4组(1)模型对照组，(2)齐墩果酸低剂量组，(3)齐墩果酸中剂量组，(4)齐墩果酸高剂量组。上述药物均为膏剂，其第1-4组的药物组成及其重量百分比如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>取新西兰兔4只，雌雄不拘，清洁级，兔龄3-4个月，体重2.2-2.6kg。由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。饲养室温度18-22°C，相对湿度60%-75%，人工混合饲料喂养。动物分笼适应性饲养3天后，按常规用药25%乌拉坦静注，麻醉。兔耳75%酒精消毒后，用圆形钻刀在兔耳腹侧面中线沿长轴避开血管两侧作直径为7mm的圆形切口，完整切除全层皮肤，去除软骨膜，保留软骨。每耳6处，间隔2cm。术后创面涂抹金霉素软膏防止感染。术后第7天，将48个瘢痕创面随机分成4组，即齐墩果酸软膏高、中、低剂量组和模型对照组，每组12个创面，分别外涂相应的药物软膏，并轻揉直到药物吸收。每天1次，每处瘢痕给药约50mg，造模后第5天开始连续外用给药24天。第29天，用游标卡尺测量兔耳瘢痕厚度和瘢痕边沿正常耳厚度，瘢痕指数=(瘢痕厚度+正常耳厚度)/正常耳厚度。测得各组瘢痕指数，进行比较，结果见图4。由图4可见，中、高剂量组药效明显，与模型对照组相比，兔耳瘢痕指数明显减小，具有显著性差异。实验结果表明，齐墩果酸能显著抑制皮肤瘢痕成纤维细胞增殖和诱导其凋亡，能减小瘢痕指数，因此，可用于制备治疗皮肤瘢痕的药物。齐墩果酸对兔耳增生性瘢痕I型胶原、MMPl和TGF-β1表达影响实验将测定完瘢痕指数的兔耳增生性瘢痕组织切下，加入一定量的PBS，ΡΗ7.4。用液氮迅速冷冻保存，标本融化后保持2-8°C的温度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用勻浆器将标本充分勻浆。离心20分钟(2000-3000rpm)。仔细收集上清。I型胶原检测1.标准品的稀释在包被有兔I型胶原抗体的酶标包被板上设标准品孔10孔，先在第一、第二孔中各取出标准品100μ1，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μ1，混勻；然后从第一孔、第二孔中各取100μ1分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μ1，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μ1弃掉，再各取50μ1分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50μ1，混勻；混勻后从第五、第六孔中各取50μ1分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μ1，混勻后从第七、第八孔中分别取50μ1加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分别加标准品稀释液50μ1，混勻后从第九、第十孔中各取50μ1弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μ1，浓度分别为30μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2.5μg/L)。2.加样分别设空白对照孔、待测样品孔，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步骤操作同待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μ1，然后再加待测样品10μ1(样品最终稀释浓度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混勻。3.温育用封版膜封版后置37°C温育30分钟。4.配液将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。5.洗涤小心揭掉封版膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶每孔加入兔I型胶原酶标试剂50μ1，空白对照孔除外。7.温育操作同3。8.洗涤操作同5。9.显色每孔先加入显色剂A50μ1，再加入显色剂B50μ1，轻轻震荡混勻，37°C避光显色15分钟。10.终止每孔加终止液50μ1，终止反应(此时蓝色转变为黄色)。11.测定以空白对照孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(0D值)。结果见图5。兔MMPl和TGF-β1的测定方法如上，仅将标准品和酶标试剂换为相应的标准品和酶标试剂。结果见图6和图7。实验结果表明，连续用药28天，齐敦果酸剂量依赖地显著降低兔耳瘢痕组织I型胶原含量和TGF-β1水平，升高MMPl水平。权利要求齐墩果酸在制备治疗皮肤瘢痕药物中的应用。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，是齐墩果酸用于制备治疗皮肤瘢痕药物的新用途。经体外人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞凋亡实验和兔耳增生性瘢痕的抑制实验，齐墩果酸能显著抑制皮肤瘢痕细胞增殖和诱导其凋亡，并能减小瘢痕增生指数，因此，可用于制备治疗皮肤瘢痕的药物。齐墩果酸来源广泛、制备方法简便，价格低廉，本发明为皮肤瘢痕的治疗提供了新的药物来源。文档编号A61K31/56GK101797256SQ20101011034公开日2010年8月11日申请日期2010年2月10日优先权日2010年2月10日发明者吴建国,张宏,张巧艳,杜渐,秦路平,韩婷,魏艳洁,黄宝康申请人:中国人民解放军第二军医大学