专利名称：：黄芩总黄酮苷元提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种传统中药的有效部位提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，具体为中药黄芩中的有效部位一黄芩总黄酮苷元提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：月市(间质)纤维化(Pulmonaryfibrosis,PF)又称肺间质疾病(Interstitiall皿gdisease,ILD)，是多种原因引起的急慢性肺部疾病的共同结局。病因复杂，现认为可能与遗传易感性、病毒感染、免疫功能异常、环境污染、药物及化学品、放射线有关。在ILD中约有50%为特发性肺间质纤维化(Idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF)，因其进展快、死亡率高而被世界卫生组织(WHO)列为肺系疑难疾病，也是遍及全世界的疾病。其发病率为7-20例AO万人，确诊后中位生存期为3年，或出现症状后5年。目前拥有的治疗肺纤维化的手段，只能减轻患者的症状，不能使患者的生存率有所改善。肺纤维化的病理特点主要是长期肺部炎症导致肺泡持续性损伤，肺内间质细胞增生及细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的大量沉积和广泛的肺实质重建。各种因素损伤肺泡上皮细胞和血管内皮细胞后，均可引起肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润，炎症细胞及其释放的细胞因子介导了早期的肺损伤，损伤的存在和反复将改变肺组织的微环境，特别是肺泡腔，从而导致修复程序的失调，最终形成肺纤维化。近年来，自由基损伤、脂质过氧化成为肺纤维化研究的热点之一。正常情况下，肺的抗氧化能力与机体不断产生自由基的氧化能力之间处于动态平衡。研究证实，超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，SOD活性高低直接反映了机体清除自由基的能力。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，氧自由基能攻击生物体中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化代谢产物，如醛基(丙二醛malondialdehyde,MDA)、酮基、羟基(OH)、新的自由基等。因此，体内MDA的含量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。机体氧化应激存在时，通过一氧化氮合酶(N0S)形成一氧化氮(N0)，进而与超氧阴离子(*02-)结合，形成过氧亚硝酸盐阴离子(0N00-)，从而产生肺毒性。胶原纤维是细胞外基质的重要组成部分，其生化成份是胶原蛋白(collagen,简称胶原)，羟脯氨酸(hydro邓roline,HYP)是机体胶原蛋白的主要成分之一，约占其氨基酸总量的13.4%，组织中HYP含量可作为其胶原组织代谢、衡量胶原含量及反映间质胶原纤维沉积的重要指标。成纤维细胞增生聚集是肺间质纤维化的一个重要特征，成纤维细胞参与人体各种组织和器官的损伤、修复和再生。众多研究结果证实，与其它器官纤维化一样，肺纤维化是ECM过度沉积的过程，涉及到细胞、细胞因子、ECM等因素的相互作用，信号分子途径之间可能相互影响，存在多条旁路途径，是多种因素、多个环节参与的缓慢的错综复杂的过程，因而目前尚缺乏可作用于多途径、多环节特异有效的防治肺纤维化药物。中药具有多成份、多靶点、多途径的作用特点，在慢性纤维化疾病治疗中显示了一定的优势。目前发现对肺纤维化有一定治疗效果的中药研究，主要集中于(l).抗自由基损伤；(2).抑制炎症因子的释放，发挥抗炎性损伤作用；(3).影响胶原代谢过程，从而减少纤维蛋白形成；(4).影响机体免疫系统功能，降低应激效应程度。(杨裙，潘强，王世岭，等。中国药业，2004，13(8):21-24)研究发现黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化、抗变态反应、抗菌、抗病毒等多方面的药理作用。中药黄吝为唇形科植物黄吝(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，黄芩同科植物有滇黄芩、粘毛黄芩、丽江黄芩，同属植物有甘肃黄芩及川黄芩。黄芩总黄体酮苷元是从黄芩根中提取获得的黄芩总黄酮类化合物的前体物质，是黄芩的有效部位，由黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A及其他苷元组成。近期报导"黄芩总黄酮苷元提取物预防肾纤维化具有剂量关系。"(张永熠等一种黄芩总黄酮苷元提取物制备方法及应用，申请号200810204811.8，公元日2009年6月17日)，但是，迄今为止，尚未见黄吝总黄酮苷元提取物应用于防治肺纤维化的文献报导。
发明内容本发明要解决的技术问题是研究黄芩的有效部位——黄芩总黄酮苷元提取物在制备抗肺纤维化药物中的应用，尤其是从中药中提取分离防治肺纤维化的有效成份，以便制备疗效好、毒副作用小、价格低廉、服用方便，可长期使用的抗肺纤维化药物。为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案黄芩总黄酮苷元提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用本发明的技术方案是通过气管内注入博莱霉素A5(bleomycinA5，BLMA5)制备小鼠肺纤维化动物模型，该模型的病理过程与人类特发性肺间质纤维化(IPF)相似，作为肺纤维化的经典动物模型而被广泛应用。本发明首要目的是首次选用黄芩总黄酮苷元提取物作为治疗药物，观察黄芩总黄酮苷元提取物对肺纤维化动物模型血清及肺组织有关生化指标的干预作用，以及对肺组织病理形态学的影响，从而为黄芩总黄酮苷元提取物防治肺纤维化提供实验依据。本发明所用的黄芩总黄酮苷元提取物(总黄酮苷元含量^50%，批号090424)是由本所植化室采用现有技术提取，也可商业购得。本发明人在研究黄芩总黄酮苷元提取物对肺纤维化动物的防治作用时发现实验以BLM诱导小鼠肺纤维化，造模后第二天，开始灌服黄芩总黄酮苷元提取物，连续给药28天后，给药组小鼠体重明显增加(P〈0.01)(实施例一)；肺系数明显减轻(P〈0.01)(实施例一)；血清中过氧化物岐化酶(SOD)活性增强或明显增强(P<0.05，P<0.01)，丙二醛(MDA)含量降低(P<0.05);抑制羟自由基(OH)能力亦增强或明显增强(P<0.05，P<0.01)(实施例二)；肺组织中SOD活性增强，MDA含量减少或明显减少(P<0.05，P<0.01)，总抗氧化能力(T-AOC)增强(P<0.05)(实施例三);总一氧化氮合成酶(T-NOS)活性降低或明显降低(P<0.05，P〈0.01)，而抑制羟自由基能力增强或明显增强(P<0.05，P<0.01)(实施例四)；羟脯氨酸(HYP)含量减少或明显减少(P<0.05，P<0.01)(实施例五)。病理学观察结果，黄芩总黄酮苷元提取物给药组肺纤维化小鼠肺组织结构较完整清晰，肺泡壁轻度增厚，肺泡间隔成纤维细胞轻度增多，少量炎症细胞浸润，肺泡炎程度减轻或明显减轻(P<0.05，P<0.01)，肺纤维化程度减轻(P<0.05)(实施例六)。这些实验结果证明黄吝总黄酮苷元提取物具有抗肺纤维化作用，其抗肺纤维化机理与增加体重、抗炎症反应、增强机体抗氧化能力、抑制自由基生成、增强清除自由基功能、减少细胞间胶原生成、沉积及成纤维细胞增生等方面有关。由鉴于此，按本发明所制备的黄芩总黄酮苷元提取物有可能作为潜在的候选药物，被用于肺阻塞性疾病，特别是肺纤维化的预防和治疗。因此，本发明的目的是提供一种传统中药黄芩总黄酮苷元提取物用于防治肺阻塞性疾病，特别是肺纤维化疾病。本发明的再一个目的是提供含有本发明制备的黄芩总黄酮苷元提取物及一种或多种原药上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。本发明的药物组合物除含有本发明制各的黄芩总黄酮苷元提取物外，还可含有一种或多种具有相同或相似作用的其他天然或化学合成的活性成分。可以按照工作中已知的方法将本发明的药物制成片剂、胶囊剂、丸剂、粉末剂、栓剂、膏剂及溶液剂和悬浮剂。其中优选的是适用于胃肠道给药的胶囊剂和片剂。在制备适用于口服给药的胶囊齐U、片齐U、丸剂和粉末剂时，可以使用蔗糖、乳糖、玉米淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素作为载体或赋形剂。此外，也可以使用制药工业中已知的方法和辅助成分将本发明的药物制成适于口服给药的溶液剂和悬浮剂。为了制备适于胃肠道外途径给药的溶液剂或悬浮剂，可以使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如l-100mM)磷酸盐缓冲液(PBS)作为载体或稀释剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠等作为防腐剂。在这些剂型中还可以含有其他适当的增溶剂、崩解剂、润滑剂、着色剂、分散剂或表面活性剂。—般说来，本发明药物组合物的口服给药剂量为0.l-100mg/Kg体重/天，较好为0.l-50mg/Kg体重/天，最好为l-10mg/Kg体重/天。然而，更确切的用药剂量应根据待治疗的疾病或病例状况性质、严重程度、患者的年龄、体重、待治疗患者所用药的敏感性及给药方式等因素由医生决定。本发明基于黄芩总黄酮苷元提取物组成的药物，成份单一，疗效确切，使用方便，可广泛应用于制备防治肺纤维化及相关疾病的药物中。本发明的优点是1.本发明首次将传统中药黄芩的有效部位——黄芩总黄酮苷元提取物(总黄酮苷元含量^50%)应用于国内外公认的且而被广泛应用的肺纤维化动物模型，进行防治肺纤维化的实验研究。2.本发明发现黄芩总黄酮苷元提取物可明显地增加模型小鼠体重、降低模型小鼠的肺系数，病理观察显示可有效地减轻肺组织肺泡炎和肺纤维化程度，提示黄芩总黄酮提取物具有防治肺纤维化作用。3.本发明发现黄芩总黄酮苷元提取物的抗纤维化作用机制与其抗炎症反应、增强机体抗氧化能力、抑制自由基产生及增强自由基清除、减少胶原生成及成纤维细胞增生有5关。4.黄芩药材丰富、价格低廉、黄芩总黄酮苷元提取工艺成熟、疗效确切、服用方便，可长期使用。以下实施例旨在进一步举例证明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则前提下，对本发明的技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范围内。下面结合附图对本发明作进一步描述图1为黄芩总黄酮苷元提取物对正常组小鼠肺组织病理学观察结果(HEX100)，肺泡结构清晰，肺泡壁完整菲薄，肺泡腔透亮，极少数炎性细胞浸润，无成纤维细胞增生，无肺间质纤维化形成；图2为黄芩总黄酮苷元提取物对模型组小鼠肺组织病理学观察结果(HEX100)，肺泡壁明显增厚，肺泡腔变窄或消失，大片肺泡结构塌陷并实变，血管壁增厚，肺泡腔及肺间质内见多量炎性细胞浸润及成纤维细胞增生，部分区域胶原纤维明显沉积；图3为黄芩总黄酮苷元提取物对醋酸泼尼松组小鼠肺组织病理学观察结果(HEX100)，肺泡壁轻度增厚，肺间质内较多炎性细胞浸润，少量成纤维细胞增生，少量胶原纤维沉积；图4为黄芩总黄酮苷元提取物对黄芩总黄酮苷元提取物大剂量组小鼠肺组织病理学观察结果(HEX100)，肺泡结构清晰，肺泡壁尚完整，部分区域肺泡壁稍增宽，较少炎性细胞浸润，较少成纤维细胞增生，未见明显纤维化形成；图5为黄芩总黄酮苷元提取物对黄芩总黄酮苷元提取物中剂量组小鼠肺组织病理学观察结果(HEX100)，肺泡结构较清晰，肺泡壁较完整，部分区域肺泡间隔稍增厚，少量炎性细胞浸润及少量成纤维细胞增生、胶原沉积；图6为黄芩总黄酮苷元提取物对黄芩总黄酮苷元提取物小剂量组小鼠肺组织病理学观察结果(HEX100)，肺泡结构较清晰，部分区域肺泡壁轻度增厚，少量炎性细胞浸润及成纤维细胞增生，少量胶原沉积。实施例11.1实验目的观察黄芩总黄酮苷元提取物对BLM诱导的肺纤维化小鼠体重及肺系数的影响1.2实验材料实验动物昆明种小鼠90只，早、$兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007。实验药物黄吝总黄酮苷元提取物(总黄酮苷元含量^50%)，批号090424，棕黄色粉末，本研究所植化室根据现有技术提取，4t:冰箱保存，临用前用5X羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;醋酸泼尼松片，规格5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，产品批号32022681;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生6产，国药准字H13020657;4%水合氯醛。实验仪器电子天平，PL203型，MettlerToledoGroup生产。1.3实验方法动物分组昆明种小鼠90只，早、$兼有，随机分为6组，即正常对照组、模型组、醋酸泼尼松(6.67mg.kg—1,d—0组、黄芩总黄酮苷元提取物大剂量(200mg.kg—1,d—0组、中剂量(lOOmg.kg—1,d-0组及小剂量(50mg.kg—1,d-0组，每组小鼠15只。模型制备实验小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，固定头部及四肢，无菌条件下切开颈部皮肤，钝性分离肌肉组织，充分暴露气管，经气管缓慢注人BLMA5(5mg/kg)，缝合后立即将小鼠直立左右摇晃35min，尽量使药液在肺内均匀分布。对照组在相同条件下经气管注入等体积生理盐水。造模当天及以后3天所有小鼠连续肌肉注射青霉素80万单位(0.05ml/只)。给药方案实验动物经气管内滴注BLM第二天起，醋酸泼尼松组及黄芩总黄酮苷元提取物各给药组开始灌服给药，对照组及模型组给与等体积5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，每天一次，连续给药28天。实验动物称重，无菌条件下取出肺脏并称重，按以下公式计算肺系数肺系数=肺重(mg)/体重(g)。肺系数是反映肺泡炎和肺纤维化程度的一项客观指标。1.4统计方法采用SPSS12.0软件处理系统，实验数据以；±s表示，计量资料采用t检验比较组间差异性，P<0.05，有统计学意义。1.5实验结果与正常组小鼠相比，模型组小鼠体重明显降低(P<O.Ol)，肺系数明显升高(P<0.01);黄芩总黄酮苷元提取物各剂量组小鼠与模型组小鼠相比，体重明显增加(P<0.01)，肺系数降低或明显降低(P<0.05，P<0.01);阳性对照药醋酸泼尼松组小鼠体重较模型组高(P<0.05)，肺系数较模型组小，但无统计学差异，见表1。表1黄芩总黄酮苷元提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠体重及肺系数的影响(；±s，n=15)组另IJ齐懂(mg/kg)体重(g)肺系数(mg/g)正常组(lOml/kg)38.25±2.455.15±0.27模型组(lOml/kg)24.08±5.05"11.87±2.15=i醋酸泼尼松组6.6727.08±2.06*10.51±2.29总黄酮苷元提取物大剂量组20030.17±3.83**9.20±1.79*屮剂量组10031.92±2.27"9.08±1.38"小剂量组5031.50±1.98"9.19±2.17"##P<0.Olvscontrol;*P<0.05，**P<0.Olvsmodel1.6结论:模型组小鼠体重明显下降，肺系数明显升高；黄芩总黄酮苷元提取物可使肺纤维化小鼠体重明显增加，且可明显降低肺纤维化小鼠的肺系数；阳性对照药醋酸泼尼松组小鼠体重较模型组高，肺系数降低不明显。以上结果提示黄芩总黄酮苷元提取物可明显增加肺纤维化小鼠体重，且可明显降低肺系数，可能具有一定的抗肺纤维化作用。实施例22.1实验目的观察黄吝总黄酮苷元提取物对BLM诱导的肺纤维化小鼠血清SOD活性、MDA含量及抑制OH能力的影响1.2实验材料实验动物昆明种小鼠90只，早、$兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007。实验药物黄吝总黄酮苷元提取物(总黄酮苷元含量^50%)，批号090424，棕黄色粉末，本研究所植化室根据现有技术提取，4t:冰箱保存，临用前用5X羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;醋酸泼尼松片，规格5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，产品批号32022681;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657;4%水合氯醛。试剂及仪器超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羟自由基(OH)测定试剂盒(批号20090529)，均购自南京建成生物工程研究所。紫外可见分光光度计，T6新世纪型，北京普析通用仪器有限责任公司生产；高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。2.3实验方法动物分组昆明种小鼠90只，早、$兼有，随机分为6组，即正常对照组、模型组、醋酸泼尼松(6.67mg.kg—1,d—0组、黄芩总黄酮苷元提取物大剂量(200mg.kg—1,d—0组、中剂量(lOOmg.kg—1,d-0组及小剂量(50mg.kg—1,d-0组，每组小鼠15只。模型制备实验小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，固定头部及四肢，无菌条件下切开颈部皮肤，钝性分离肌肉组织，充分暴露气管，经气管缓慢注人BLMA5(5mg/kg)，缝合后立即将小鼠直立左右摇晃35min，尽量使药液在肺内均匀分布。对照组在相同条件下经气管注入等体积生理盐水。造模当天及以后3天所有小鼠连续肌肉注射青霉素80万单位(0.05ml/只)。给药方案实验动物经气管内滴注BLM第二天起，泼尼松组及黄芩总黄酮苷元提取物各给药组开始灌服给药，对照组及模型组给与等体积5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，每天一次，连续给药28天。血清的制备各组小鼠眼眶静脉取全血后3500r/min离心10min，小心取上清置于1.5ml离心管内，转移后的上清再次3500r/min离心10min。制备好的血清液-8(TC冰箱保存，以备血清中生化指标的测定。SOD活性、MDA含量及抑制OH能力的测定步骤均按照试剂盒说明书进行操作。2.4统计方法采用SPSS12.0软件处理系统，实验数据以；±s表示，计量资料采用t检验比较组间差异性，P<0.05，有统计学意义。2.5实验结果模型组小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活性明显弱于正常组(P<0.01)，脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)含量明显高于正常组(P<0.01)，而抑制羟自由基(*0H)的能力明显弱于正常组(P<0.01);与模型组相比，黄芩总黄酮苷元提取物组小鼠血清SOD活性增强或明显增强(P<0.05，P<0.01)，MDA的含量降低(P<0.05)，抑制*0H能力增强或明显增强(P<0.05，P<0.01);阳性对照药醋酸泼尼松组小鼠血清中SOD活性较模型组明显增强(P<0.01)，抑制OH能力较模型组增强(P<0.05)，MDA含量较模型组降低(P<0.05)，见表2。表2黄吝总黄酮苷元提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠血清中SOD活性、MDA含量、抑制OH能力的影响(;±s，n=15)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>##P<0.Olvscontrol;*P<0.05，**P<0.Olvsmodel2.6结论模型组小鼠血清超氧化物歧化酶活性明显减弱，丙二醛含量明显升高，抑制羟自由基能力明显减弱；黄芩总黄酮苷元提取物可明显增强肺纤维化小鼠血清超氧化物歧化酶活性，明显降低血清丙二醛的含量，明显增强血清抑制羟自由基能力；阳性对照药醋酸泼尼松组小鼠血清超氧化物歧化酶活性及抑制羟自由基能力较模型组明显增强或增强，而丙二醛含量较模型组降低。以上实验结果提示黄芩总黄酮苷元提取物可能通过增强小鼠血清清除氧自由基作用及减少羟自由基的产生，从而减轻自由基对肺纤维化小鼠肺组织的保护作用。实施例三3.l实验目的观察黄吝总黄酮苷元提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠肺组织中SOD活性、MDA含量、T-AOC的影响3.2实验材料实验动物昆明种小鼠90只，早、$兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007。实验药物黄吝总黄酮苷元提取物(总黄酮苷元含量》50%)，批号090424，棕黄色粉末，本研究所植化室根据现有技术提取，4t:冰箱保存，临用前用5X羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;醋酸泼尼松片，规格5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，产品批号32022681;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657;4%水合氯醛。试剂及仪器超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T_A0C)测定试剂盒(批号20090529)，均购自南京建成生物工程研究所。紫外可见分光光度计，T6新世纪型，北京普析通用仪器有限责任公司生产；高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。3.3实验方法动物分组昆明种小鼠90只，早、$兼有，随机分为6组，即正常对照组、模型组、醋酸泼尼松(6.67mg.kg—1,d—0组、黄芩总黄酮苷元提取物大剂量(200mg.kg—1,d—0组、中剂量(lOOmg.kg—1,d-0组及小剂量(50mg.kg—1,d-0组，每组小鼠15只。模型制备实验小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，固定头部及四肢，无菌条件下切开颈部皮肤，钝性分离肌肉组织，充分暴露气管，经气管缓慢注人BLMA5(5mg/kg)，缝合后立即将小鼠直立左右摇晃35min，尽量使药液在肺内均匀分布。对照组在相同条件下经气管注入等体积生理盐水。造模当天及以后3天所有小鼠连续肌肉注射青霉素80万单位(0.05ml/只)。给药方案实验动物经气管内滴注BLM第二天起，泼尼松组及黄芩总黄酮苷元提取物各给药组开始灌服给药，对照组及模型组给与等体积5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，每天一次，连续给药28天。肺组织匀浆的制备及生化指标的测定取适量肺组织，加入冰生理盐水，体积为所取肺组织质量的9倍，内切式组织匀浆器制成10%肺组织匀浆，然后按试剂盒说明书操作步骤进行肺组织SOD活性、MDA含量、T-AOC的测定。3.4统计方法采用SPSS12.0软件处理系统，实验数据以；±s表示，计量资料采用t检验比较组间差异性，P<0.05，有统计学意义。3.5实验结果与正常组相比，模型组小鼠肺组织超氧化物歧化酶(SOD)活性明显减弱(P<0.01)，丙二醛(MDA)含量明显升高(P<O.Ol)，总抗氧化能力(T-AOC)明显减弱(P<0.01);与模型组小鼠相比，黄芩总黄酮苷元提取物组小鼠肺组织中SOD活性增强或明显增强(P<0.05，P<0.01)，MDA含量降低或明显降低(P<0.05，P<0.01)，T-AOC增强(P<0.05);阳性对照药醋酸泼尼松组小鼠肺组织的SOD活性较模型组增强(P<0.05)，MDA含量较模型组降低(P<0.05)，而T-AOC与模型组相比，未见明显差异，见表3。表3黄吝总黄酮苷元提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠肺组织中SOD活性、MDA含量、T-AOC的影响(；±s，n=15)组另u齐U量(mg/kg)SOD(U/mgprot)MM(nmol/mgprot)T-AOC(U/mgprot)正常组52.44±7.984.59±0.482.55±0.48模型组44.57±5.12"5.86±1.07"2.13±0.28=醋酸泼尼松组6.6750.83±10.89s4.91±0.87*2.26±0.39总黄酮苷元提取物大剂量组20050.55±5.12"4.64±0.34"2.40±0.35"中剂量组10048.06±2.72*4.76±0.23"2.40±0.52*小剂量组5047.96±9.175.09±0.70"2.29±0.40*##P<0.Olvscontrol;*P<0.05，**P<0.Olvsmodel3.6结论模型组小鼠肺组织超氧化物歧化酶活性明显减弱，丙二醛含量明显升高，总抗氧化能力明显减弱；黄芩总黄酮苷元提取物可明显增强肺纤维化小鼠肺组织超氧化物歧化酶10活性，明显降低肺组织中丙二醛含量，明显增强肺组织总抗氧化能力；与模型组相比，阳性对照药醋酸泼尼松组小鼠肺组织的超氧化物歧化酶活性增强、丙二醛含量降低，总抗氧化能力未见明显差异。以上实验结果提示黄芩总黄酮苷元提取物通过增强清除氧自由基能力、降低脂质过氧化程度，提高机体总抗氧化能力从而对实验性肺纤维化小鼠肺组织具有保护作用。实施例四4.l实验目的观察黄吝总黄酮苷元提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠肺组织T-NOS活性及肺组织抑制0H能力的影响4.2实验材料实验动物昆明种小鼠90只，早、$兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007。实验药物黄吝总黄酮苷元提取物(总黄酮苷元含量^50%)，批号090424，棕黄色粉末，本研究所植化室根据现有技术提取，4t:冰箱保存，临用前用5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;醋酸泼尼松片，规格5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，产品批号32022681;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657;4%水合氯醛。试剂及仪器总一氧化氮合酶(T-NOS)、羟自由基(*0H)测定试剂盒(批号20090529)，均购自南京建成生物工程研究所。紫外可见分光光度计，T6新世纪型，北京普析通用仪器有限责任公司生产；高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。4.3实验方法动物分组昆明种小鼠90只，早、$兼有，随机分为6组，即正常对照组、模型组、醋酸泼尼松(6.67mg.kg—1,d—0组、黄芩总黄酮苷元提取物大剂量(200mg.kg—1,d—0组、中剂量(lOOmg.kg—1,d-0组及小剂量(50mg.kg—1,d-0组，每组小鼠15只。模型制备实验小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，固定头部及四肢，无菌条件下切开颈部皮肤，钝性分离肌肉组织，充分暴露气管，经气管缓慢注人BLMA5(5mg/kg)，缝合后立即将小鼠直立左右摇晃35min，尽量使药液在肺内均匀分布。对照组在相同条件下经气管注入等体积生理盐水。造模当天及以后3天所有小鼠连续肌肉注射青霉素80万单位(0.05ml/只)。给药方案实验动物经气管内滴注BLM第二天起，泼尼松组及黄芩总黄酮苷元提取物各给药组开始灌服给药，对照组及模型组给与等体积5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，每天一次，连续给药28天。肺组织匀浆的制备及生化指标的测定取适量肺组织，加入冰生理盐水，体积为所取肺组织重量的9倍，内切式组织匀浆器制成10%肺组织匀浆，然后按试剂盒说明书操作步骤进行肺组织T-NOS活性及抑制OH能力的测定。4.4统计方法采用SPSS12.0软件处理系统，实验数据以；±s表示，计量资料采用t检验比较组间差异性，P<0.05，有统计学意义。4.5实验结果与正常组相比，模型组小鼠肺组织总一氧化氮合酶(T-N0S)的活性明显增强(P<0.01)，而肺组织抑制羟自由基(*0H)能力明显减弱(P<0.01);与模型组相比，黄芩总黄酮苷元提取物各剂量组小鼠肺组织T-NOS活性减弱或明显减弱(P<0.05，P<0.01)，而肺组织抑制OH能力增强或明显增强(P<0.05，P<0.01);阳性对照药醋酸泼尼松组小鼠肺组织T-NOS活性减弱(P<0.05)，而抑制OH能力与模型组相比未见明显差异，见表4。表4黄吝总黄酮苷元提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠肺组织中T-NOS活性及抑制.OH能力的影响(;±s，n=I5)组别剂量(rag/kg)T-NOS(U/mgprot)抑制OH能力(U/tngprot)正常组0.42±0.05107.33±17.27模型组0.50±0.10==85.15±13.40K醋酸泼尼松组6.670.44±0.07*91.24±22.54总黄酮苷元提取物大剂量组2000.43±0.06"104.79±17.56"中剂量组1000.44±0.03*95.51±13.94*小剂量组500.45±0.0995.16±26.24*##P<0.Olvscontrol;*P<0.05，**P<0.Olvsmodel4.6结论造模28天，与正常组相比，模型组小鼠肺组织总一氧化氮合酶的活性明显增强，而肺组织抑制羟自由基能力明显减弱；给药28天，黄芩总黄酮苷元提取物各剂量组小鼠肺组织总一氧化氮合酶活性减弱或明显减弱，肺组织抑制羟自由基能力增强或明显增强；阳性对照药醋酸泼尼松组小鼠肺组织总一氧化氮合酶活性减弱，而抑制羟自由基能力与模型组相比未见明显差异。以上实验结果提示黄芩总黄酮苷元提取物通过抑制一氧化氮生成及羟自由基产生，从而减轻一氧化氮及羟自由基对实验性肺纤维化小鼠肺组织的损伤作用。实施例五5.1实验目的观察黄吝总黄酮苷元提取物对BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中HYP含量的影响5.2实验材料实验动物昆明种小鼠90只，早、$兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007。实验药物黄芩总黄酮苷元提取物(总黄酮苷元含量^50%)，批号090424，棕黄色粉末，本研究所植化室根据现有技术提取，4t:冰箱保存，临用前用5X羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;醋酸泼尼松片，规格5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，产品批号32022681;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657;4%水合氯醛。12试剂及仪器羟脯氨酸(HYP)测定试剂盒(批号20090529)，购自南京建成生物工程研究所。紫外可见分光光度计，T6新世纪型，北京普析通用仪器有限责任公司生产；高速低温冷冻离心机，5417R型，德国艾本德股份公司生产；电热恒温水浴锅，H.H.S6型，上海浦东荣丰科学仪器有限公司出品。5.3实验方法动物分组昆明种小鼠90只，早、$兼有，随机分为6组，即正常对照组、模型组、醋酸泼尼松(6.67mg.kg—1,d—0组、黄芩总黄酮苷元提取物大剂量(200mg.kg—1,d—0组、中剂量(lOOmg.kg—1,d-0组及小剂量(50mg.kg—1,d-0组，每组小鼠15只。模型制备实验小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，固定头部及四肢，无菌条件下切开颈部皮肤，钝性分离肌肉组织，充分暴露气管，经气管缓慢注人BLMA5(5mg/kg)，缝合后立即将小鼠直立左右摇晃35min，尽量使药液在肺内均匀分布。对照组在相同条件下经气管注入等体积生理盐水。造模当天及以后3天所有小鼠连续肌肉注射青霉素80万单位(0.05ml/只)。给药方案实验动物经气管内滴注BLM第二天起，泼尼松组及黄芩总黄酮苷元提取物各给药组开始灌服给药，对照组及模型组给与等体积5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，每天一次，连续给药28天。肺组织匀浆的制备取适量肺组织，加入冰生理盐水，体积为所取肺组织质量的9倍，内切式组织匀浆器制成10%肺组织匀浆，然后按试剂盒说明书操作步骤进行肺组织HYP的测定。HYP的测定步骤将冷冻保存的小块肺组织放入带刻度的玻璃试管内，准确滴加碱水解液0.lml，混匀，加盖后沸水浴水解20min，之后将各试管pH值调至6.5左右，加适量活性炭混匀，3500r/min离心10min，取上清0.6ml，依次加入3种试剂后混匀，6(TC水浴15min，3500r/min离心10min，取上清，于紫外可见分光光度计550nm处，lcm光径下测定各管的吸光度，按照说明书公式计算肺组织中HYP的含量。5.4统计方法采用SPSS12.0软件处理系统，实验数据以；±s表示，计量资料采用t检验比较组间差异性，P<0.05，有统计学意义。5.5实验结果与正常对照组相比，模型组小鼠肺组织羟脯氨酸(HYP)含量明显增加(P<0.01);与模型组相比，黄芩总黄酮苷元提取物各剂量组小鼠肺组织中HYP含量减少或明显减少(P<0.05，P<0.01);阳性对照药醋酸泼尼松组小鼠肺组织中HYP含量减少(P<0.05)，见表5。表5黄吝总黄酮苷元提取物对BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中HYP含量的影响(x±s，n=15)13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>##P<0.Olvscontrol;氺P<0.05，氺氺P<0.Olvsmodel5.6结论肺纤维化模型组小鼠肺组织羟脯氨酸含量明显增加；黄芩总黄酮苷元提取物可明显减少肺纤维化小鼠肺组织中羟脯氨酸的含量；阳性对照药醋酸泼尼松组小鼠较模型组相比，肺组织中羟脯氨酸的含量减少。以上结果提示黄芩总黄酮苷元提取物通过减少羟脯氨酸的产生从而减少胶原在肺组织的沉积而发挥抗肺纤维化作用。实施例六6.1实验目的观察黄芩总黄酮苷元提取物对BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织肺泡炎及肺纤维化程度的影响6.2实验材料实验动物昆明种小鼠90只，早、$兼有，体重18-22克，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。实验动物使用许可证号SYXK(苏)2007-0035。实验动物生产许可证号SCXK(苏)2007-0007。实验药物黄芩总黄酮苷元提取物(总黄酮苷元含量^50%)，批号090424，棕黄色粉末，本研究所植化室根据现有技术提取，4t:冰箱保存，临用前用5X羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶解；博莱霉素A5(BLMA5)，白色冻干粉末，15mg/支，由日本化药株式会社生产，产品批号640110，药品进口注册证号H20040205;醋酸泼尼松片，规格5mg/片，江苏徐州平光制药有限责任公司，产品批号32022681;注射用青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657;4%水合氯醛。实验仪器OLYMPUSCX31型光学显微镜，日本OLYMPUS公司生产。6.3实验方法动物分组昆明种小鼠90只，早、$兼有，随机分为6组，即正常对照组、模型组、醋酸泼尼松(6.67mg.kg—1,d—0组、黄芩总黄酮苷元提取物大剂量(200mg.kg—1,d—0组、中剂量(lOOmg.kg—1,d-0组及小剂量(50mg.kg—1,d-0组，每组小鼠15只。模型制备实验小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，固定头部及四肢，无菌条件下切开颈部皮肤，钝性分离肌肉组织，充分暴露气管，经气管缓慢注人BLMA5(5mg/kg)，缝合后立即将小鼠直立左右摇晃35min，尽量使药液在肺内均匀分布。对照组在相同条件下经气管注入等体积生理盐水。造模当天及以后3天所有小鼠连续肌肉注射青霉素80万单位(0.05ml/只)。给药方案实验动物经气管内滴注BLM第二天起，泼尼松组及黄芩总黄酮苷元提取物各给药组开始灌服给药，对照组及模型组给与等体积5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，每天一次，连续给药28天。肺组织病理染色取右肺下叶，置于10%中性甲醛溶液中充分固定24h，常规石蜡包埋，4ym厚切片，经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后行HE染色，二甲苯透明l-2h，中性树胶封片，待干燥后在光学显微镜下观察结果。肺组织肺泡炎和肺纤维化程度参照Sza叩iel等方法进行半定量评分。肺泡炎程度分为四级0分无肺泡炎；1分轻度肺泡炎，表现为局部淋巴细胞浸润，使肺泡隔增宽，受累面积小于全肺的20%，肺泡结构正常；2分中度肺泡炎，淋巴细胞数目增多，浸润范围扩大，受累面积为20%_50%;3分重度肺泡炎，受累面积大于50%，偶见肺泡腔内有淋巴细胞及出血，局部肺组织实变。肺纤维化程度亦分为四级0分无明显病理改变，无纤维化形成；l分轻度病理改变，较少成纤维细胞增殖，较少胶原纤维沉积，肺泡间隔因细胞浸润而增宽，病变范围局限于全肺的20%;2分中度病理改变，少量胶原纤维沉积，肺泡结构紊乱，病变范围占全肺的20%-50%;3分重度病理改变，大量胶原纤维沉积，呈弥漫性分布，肺泡融合，形成大小不等的囊气腔，肺实质结构紊乱，病变范围占全肺的50%以上。6.4统计方法采用SPSS12.0软件处理系统，实验数据以；±s表示，计量资料采用t检验比较组间差异性，P<0.05，有统计学意义。6.5实验结果与正常组相比，模型组小鼠肺组织肺泡炎程度明显加重(P<0.01)，肺纤维化程度明显加重(P<0.01);与模型组相比，黄芩总黄酮苷元提取物各剂量组小鼠肺组织肺泡炎程度减轻或明显减轻(P<0.05，P<0.01)，肺纤维化程度减轻(P<0.05);阳性对照药泼尼松组小鼠与模型组相比，肺泡炎程度减轻(P<0.05)，肺纤维化程度减轻(P<0.05)，见表6，图16。表6黄吝总黄酮苷元提取物对BLM诱导肺纤维化小鼠病理形态学影响G士s，n=15)组另u剂量(mg/kg)肺泡炎评分肺纤维化评分正常组0.47±0.520.33±0.49模型组1.40±0.51;=1.73±0.59"泼尼松组6.670.93±0.59*1.13±0.83*总黄酮苷元提取物大剂量组2000.73士0.46"1.07±0.88*中剂量组1000.80±0.56"1.13±0.64*小剂量组500.87±0.74*1.27±0.59*##P<0.Olvscontrol;氺P<0.05，氺氺P<0.Olvsmodel6.6结论肺纤维化模型组小鼠肺组织肺泡炎程度及肺纤维化程度明显加重；黄芩总黄酮苷元提取物可减轻或明显减轻肺纤维化小鼠肺组织肺泡炎程度及肺纤维化程度；阳性对照药泼尼松组小鼠较模型组相比，可减轻肺纤维化小鼠肺组织肺泡炎及肺纤维化程度。以上结果提示黄芩总黄酮苷元提取物具有抗炎症反应及抗肺纤维化形成的作用。权利要求一种黄芩总黄酮苷元提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用。2.根据权利要求1所述黄芩总黄酮苷元提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述黄芩总黄酮苷元提取物中总黄酮苷元的含量为^50%。3.根据权利要求1所述制备防治肺纤维化药物中的应用，其特征在于所述药物为含有有效量的黄芩总黄酮苷元提取物可与药学上可接受的载体结合制备药物。全文摘要本发明公开了一种黄芩总黄酮苷元提取物在制备防治肺纤维化药物中的应用，本发明技术方案通过气管内滴注博莱霉素A5(BLMA5)复制小鼠肺纤维化动物模型，首次选用黄芩总黄酮苷元提取物(总黄酮苷元含量≥50％)作为治疗药物，观察黄芩总黄酮苷元提取物对肺纤维化动物模型血清及肺组织有关生化指标的干预作用，以及对肺组织病理形态学的影响，从而为黄芩总黄酮苷元提取物治疗肺纤维化疾病提供实验依据。所述的药物为含有治疗有效量的黄芩总黄酮苷元提取物可与药学上可接受的载体结合制备药物。文档编号A61P11/00GK101732412SQ20101011042公开日2010年6月16日申请日期2010年2月9日优先权日2010年2月9日发明者周忠继,蒋小岗,郅玲然,郭次仪,顾振纶申请人:苏州中药研究所