专利名称：猪细小病毒l株及在制备猪细小病毒病灭活疫苗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株新分离的病毒毒株，尤其涉及一株猪细小病毒毒L株，本发明还 涉及病毒L株在制备猪细小病毒病灭活疫苗中的用途，属于猪细小病毒病的防治领域。
背景技术：
猪细小病毒(PPV)可引起猪的繁殖障碍，主要表现为胎儿和胚胎的感染和死亡， 而母体通常并不表现临床症状。血清学阴性母猪主要在妊娠的前半期经口鼻感染病毒，结 果免疫机能不全的胎儿经胎盘受到感染，从而导致发病。经检查得知在世界各地的猪群中， 该病毒是普遍存在的，在大多数猪场呈地方性流行。此病流行很广，在欧、美、亚及大洋洲很 多国家均有报道。我国的各省市相继分离到猪细小病毒，血清阳性率很高。本病对养猪业 的危害极大。由于PPV目前尚无有效的药物治疗方法，因此，该病的预防免疫就显得更为重 要。近年来，公认使用疫苗是预防PPV、提高母猪繁殖率的唯一方法。到目前为止，世界 上已有美国、澳大利亚、日本、丹麦、西班牙、捷克、德国、原苏联和中国等10多个国家报告 研制了 PPV疫苗，其中除美国和日本有3个弱毒疫苗外，其余均为灭活疫苗，并都已成为商 品化生产苗，常用的灭活剂有AEI、BEI、甲醛溶液和丙内酯。美国的Mengeling(1979) 还报告生产应用了一种PPV和猪伪狂犬(PrV) 二联苗，效果较好。中国均普遍使用PPV灭活疫苗，使用的主要灭活剂有福尔马林、B2丙内酯 (B2PL)、N-乙酰乙烯亚胺(AEI)、二乙烯亚胺(BEI)等。有试验结果表明，PPV用福尔马林灭 活后做成的疫苗的保护效果不如用二乙烯亚胺灭活后做成的疫苗的保护效果好；用B-丙 内酯灭活的疫苗的保护力较好(潘雪珠等，1992)。免疫佐剂也是影响PPV灭活疫苗免疫效 果的重要因素。有试验结果表明，50%的氢氧化铝、顺丁烯乙酰(EMA)、油水乳剂、DDA分别 作为佐剂的疫苗，均诱导猪产生高滴度的抗体。但几种佐剂的混合物，如油佐剂、SDS、氢氧 化铝和油乳剂的混合物以及SDS、氢氧化铝的混合物作佐剂的疫苗产生的抗体滴度均较低 (Mo lito r等，1985)。目前国内有两种猪细小病毒灭活疫苗供预防本病。一种是猪细小病 毒灭活氢氧化铝疫苗，另一种是猪细小病毒灭活油佐剂苗。对于猪细小病毒应用二乙烯亚 胺灭活，并加入油佐剂配制而成双向油乳剂灭活苗，还未报道。
发明内容
本发明目的之一是提供一株新分离的猪细小病毒毒株；本发明的目的之二是将上述猪细小病毒毒株用于制备猪细小病毒病双向油乳剂 灭活疫苗；本发明目的之三是提供一种制备上述猪细小病毒病双向油乳剂灭活疫苗的方 法；本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一株新分离的猪细小病毒(PPV) L株，其微生物保藏号是CGMCC No. 3352 ；分类命名是猪细小病毒；保藏时间是2009年10月23日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所。本发明猪细小病毒(PPV)L株的分离方法，包括无菌采集取母猪死胎的肝、肠系膜淋巴结、肾、脑等组织。以1 10加入灭菌生 理盐水，研磨，制备组织悬液，经反复3次冻融后，2000r/min离心15min，收集上清液，再经 0. 2ul滤膜滤器过滤，将滤出液置-30°C冰箱冻结保存。取分离的毒株接种ST传代细胞上， 在C02 3 7°C条件下培养，每天对细胞病变效应(CPE)进行观察。形态结果显示细胞固缩， 突立聚集，颗粒增多，有的细胞融合，细胞脱落，出现空斑。本发明猪细小病毒L株电镜负染观察结果可观察到外观呈六角形或圆形，无囊 膜的病毒粒子，直径约为20nm。本发明猪细小病毒L株免疫荧光法检查结果标本感染ST传代细胞，细胞有病变， 在细胞核细胞质中，可见呈苹果绿色的特异性荧光，阴性对照无特异性荧光出现。病毒血凝活性检测收获含毒细胞培养液能凝集豚鼠红细胞，具有较高的血凝活 性，而且随着传代培养次数的增加，病毒对细胞的适应性增强，病毒血凝价有提高。本发明猪细小病毒L株的测序结果对PPV VP2进行测序，测序结果见附图4，利 用DNA MAN软件对L株VP2基因片段进行序列分析，L株和其它几株PPV VP2的进化树分 析，见附表1及附图5。表明L株与NADL-2株和China株的遗传距离最近。将上述猪细小病毒毒株灭活，加入佐剂，就可得到猪细小病毒病灭活疫苗；优选的，一种利用本发明细小病毒毒株制备猪细小病毒病双向油乳剂灭活疫苗的 方法，包括培养所述的猪细小病毒L株，得到猪细小病毒抗原液；将猪细小病毒抗原液灭 活；浓缩；分别配制油相和水相，将水相和油相混合在一起后乳化，即得。二乙烯亚胺的浓度及作用时间对灭活苗的效果有非常显著的影响，鉴次，本发明 选用二乙烯亚胺作为灭活剂，对灭活剂的使用剂量、作用时间、灭活效果等进行一系列试 验，以优化二乙烯亚胺灭活猪细小病毒程序。最终发现以终末浓度0. 02%二乙烯亚胺溶液 灭活猪细小病毒效果为好；当以终末浓度0. 02%二乙烯亚胺溶液在30°C，lOOr/min，气浴 振荡的条件下，72h灭活猪细小病毒的效果为最佳。其中，所述油相可参考下述方法制备得到注射用白油94份、司本-806份和硬脂 酸铝1. 5份混合在一起，配制得到油相；所述水相可参考下述方法制备得到96ml灭活后的猪细小病毒抗原液中加入4ml 吐温-80，加入硫柳汞至终浓度为0. 01wt% ；配制得到水相；优选的，将所述水相和油相按照4 1. 5比例混合在一起进行乳化。本发明灭活疫苗免疫剂量为猪肌肉注射2ml/头，一次接种灭活疫苗，现地免疫期 可达6个月以上。超剂量接种10ml/头，单剂量3次重复接种后，均未发现任何异常反应， 说明本发明所制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性及安全性。
图1细胞病变效应(CPE)结果。图2病毒的电镜检查结果。
图3免疫荧光法检查结果。图4本发明猪细小病毒毒株灭活疫苗的工艺流程图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1猪细小病毒L 株的分离、培养、鉴定一、选育方法1.病料采集无菌采集取母猪死胎的肝、肠系膜淋巴结、肾、脑等组织。以1 10 加入灭菌生理盐水，研磨，制备组织悬液，经反复3次冻融后，2000r/min离心15min，收集上 清液，再经0. 2ul滤膜滤器过滤，将滤出液置-30°C冰箱冻结保存。2.分离培养将上述病料按病毒培养液的10%含量接入尚未形成单层的细胞培 养物中，37°C感作lh，换加含2%读牛血清的MEM培养液，37°C培养5日。第二代培养78h， 收获含毒培养液，经3次冻融后，收毒。连续传代5代。3.基础种子批建立取原始毒种，按病毒培养液量的0. 5%接入尚未形成单层的 ST细胞培养物中，置37°C培养，当病变达到70%时，收获含毒细胞培养液，经3次冻融后，收 毒。连续传代6代。4.生产种子批建立取基础种子，按病毒培养液量的0. 5%接入尚未形成单层的 ST细胞培养物中，置37°C培养，当病变达到70%时，收获含毒细胞培养液，经3次冻融后，收 毒。连续传代11代。最终获得一株具有希望特性的所需猪细小病毒毒株，并命名为并命名为猪细小病 毒L株；取分离的毒株接种ST传代细胞上，在C02 3 7°C条件下培养，每天对细胞病变效应 (CPE)进行观察。结果显示细胞固缩，突立聚集，颗粒增多，有的细胞融合，细胞脱落，出现 空斑。病变见图1。二、电镜负染观察经培养5-7d后，病变细胞上清蔗糖梯度超速离心，分离病毒颗粒进行电镜负染观察。结果显示可观察到外观呈六角形或圆形，无囊膜的病毒粒子，直径约为20nm。见 图2三、免疫荧光法检查取分离的毒株接种ST传代细胞上，在C02 3 7°C条件下培养47h，当CPE达70%时， 传第二代，选用第二代培养物经3次冻融后，做荧光抗体检查。取已培养24h的ST细胞盖 玻片培养物，接种病毒，再经24h培养。取出盖玻片，用PBS冲洗，经丙酮固定，再用猪细小 病毒荧光抗体湿盒内染色30min，冲洗，封固，镜检。结果显示标本感染ST传代细胞，细胞有病变，在细胞核细胞质中，可见呈苹果绿 色的特异性荧光，阴性对照无特异性荧光出现。见图3。
(4)病毒血凝活性检测取96孔微量反应板(U型)，用pH 7. 2的PBS将含毒细胞培养液做2倍连续稀释， 加入含4HAU猪细小病毒血凝素液，并设PBS和病毒对照，充分振荡后，置4°C，18h，再加入 0.6%豚鼠红细胞悬液，置室温lh，当对照孔中的红细胞呈显著钮扣状时判定结果。结果显示收获含毒细胞培养液能凝集豚鼠红细胞，具有较高的血凝活性，而且随 着传代培养次数的增加，病毒对细胞的适应性增强，病毒血凝价有提高。见表1 (5)病毒的测序检测根据猪细小病毒NADL-2株的全基因序列自行设计一对引物，用于扩增VP2基因 片段(2808bp-4407bp)。上游引物为 Pl:5' CAATGAGTGAAAATGTGGAA 3'，下游引物为 P2: 5' TTTGCTGTGAATGTTAGTGT 3'。对PPV提取DNA，并对VP2基因片段进行PCR扩增，测序。结果显示利用DNA MAN软件对L株VP2基因片段进行序列分析，测序结果得到了 与预期结果相符的1600bp的基因片段，其中包括PPV VP1基因的2个核苷酸和VP2基因的 1598个核苷酸。测序结果见SEQ ID N0:1。PPV L株VP2基因片段与其它PPV毒株的同源性比较结果见表2。表2 PPV L株VP2基因片段与其它PPV毒株的同源性比较 本发明病毒L株和其它几株PPV VP2的进化树分析，表明L株与NADL-2株和China 株的遗传距离最近。实施例2猪细小病毒病灭活苗的制备1.制苗用病毒液的制备生产种子毒种按病毒培养液量的0. 5%接入尚未形成单层的ST细胞培养物中，置37°C旋转培养，当病变达到70%时，收获含毒细胞培养液，经3次 冻融后，收毒。2.灭活按病毒液总量的0.02%向病毒液中加入二乙烯亚胺溶液，充分振荡后， 于30°C、100r/min摇床上灭活72h，然后加入1 %硫代硫酸钠溶液，终止灭活。并作无菌检验。3.浓缩取灭活后的病毒液，经13000r/min连续离心，然后以0. 2um滤膜滤器过 滤。微滤后的病毒液以50KD滤膜滤器超滤浓缩5倍。4.油佐剂灭活疫苗的配制按照注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝1. 5份 的比例配制油相；按照96ml抗原加入4ml吐温-80及0. 01 %加入硫柳汞的比例配制水相； 水相和油相按照4 1. 5比例进行乳化，制成油包水单相苗。试验例1本发明猪细小病毒毒株灭活疫苗的工艺优化试验选用二乙烯亚胺作为灭活剂，对灭活剂的使用剂量、作用时间、灭活效果等进行一 系列试验，以优化二乙烯亚胺灭活猪细小病毒程序。(1) 二乙烯亚胺使用剂量及浓度确定设定1%,0. 2%,0. 05%,0. 02%等浓度的二乙烯亚胺，在30°C，100r/min，气浴振 荡的条件下，灭活48h，灭活后做灭活病毒液细胞培养物感染性病毒检查及小白鼠感染试 验。确定以终末浓度0. 02%二乙烯亚胺溶液灭活猪细小病毒效果最佳。(2) 二乙烯亚胺作用时间确定0.02%二乙烯亚胺，在301，10017/1^11，气浴振荡的条件下，分别做7、10、15、24、 48、60、72、80h等不同时间的灭活，灭活后做灭活病毒液细胞培养物感染性病毒检查及小白 鼠感染试验。确定以终末浓度0. 02%二乙烯亚胺溶液在30°C，lOOr/min，气浴振荡的条件 下，做72h灭活猪细小病毒效果最佳。(3) 二乙烯亚胺毒性试验设定1%、0. 2%、0. 02%等浓度的二乙烯亚胺溶液，注射18_22g小白鼠，观察10d， 记录死亡数和存活数。确定0. 2% 二乙烯亚胺注射0. 2ml及0. 02% 二乙烯亚胺0. 4ml为安 全剂量。试验例2本发明猪细小病毒病灭活苗的免疫效果试验按照实施例2的制备方法连续生产3批疫苗，对10276头猪(多数为初产母猪) 进行了疫苗接种实验。以免疫剂量为猪肌肉注射2ml/头，一次接种灭活疫苗，现地免疫期 可达6个月以上，说明该疫苗具有良好的免疫原性。以使用剂量接种2ml/头，超剂量接种10ml/头，未发现任何异常反应。取试制的 疫苗接种后备母猪、妊娠猪未见免疫对生殖功能有任何影响，配种、妊娠、产仔均正常。证明 疫苗安全性良好。
权利要求
一株分离的猪细小病毒L株，其微生物保藏号是CGMCC No.3352。
2.权利要求1所述的猪细小病毒L株在制备预防或治疗细小病毒病疫苗中的用途。
3.一种预防或治疗细小病毒病灭活疫苗，含有有效量的权利要求1所述的猪细小病毒 L株的抗原液和佐剂。
4.一种制备权利要求1所述猪细小病灭活疫苗的方法，包括培养权利要求1所述的 猪细小病毒L株，得到猪细小病毒抗原液；将猪细小病毒抗原液灭活；浓缩；分别配制油相 和水相，将水相和油相混合在一起后乳化，即得。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于用二乙烯亚胺灭活猪细小病毒抗原液。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于以终末浓度0.02wt%二乙烯亚胺溶液灭 活猪细小病毒抗原液。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于以终末浓度0.02wt%二乙烯亚胺溶液在 30°C，lOOr/min，气浴振荡的条件下，灭活猪细小病毒抗原液72h。
8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于所述油相按照下述方法制备得到注射用 白油94份、司本-80 6份和硬脂酸铝1.5份混合在一起，配制得到油相；所述水相按照下述 方法制备得到96ml灭活后的猪细小病毒抗原液中加入4ml吐温_80，加入硫柳汞至终浓度 为0.01wt% ；配制得到水相。
9.按照权利要求4所述的方法，其特征在于将所述水相和油相按照4 1.5的体积 比例混合在一起后进行乳化。
全文摘要
本发明公开了猪细小病毒L株及在制备猪细小病毒病灭活疫苗中的用途。本发明所分离毒株的微生物保藏号是CGMCC No.3352。该毒株与NADL-2株及China株具有极高的同源性、保持高的繁殖力，病毒稳定。应用二乙烯亚胺灭活该病毒的抗原液，加入油佐剂制得双向油乳剂灭活苗；用所制备的灭活疫苗对10276头猪(多数为初产母猪)进行了疫苗接种实验，免疫剂量为猪肌肉注射2ml/头，一次接种灭活疫苗，现地免疫期可达6个月以上。超剂量接种10ml/头，单剂量3次重复接种后，均未发现任何异常反应，说明本发明灭活疫苗具有良好的免疫原性及安全性。
文档编号A61K39/23GK101851609SQ201010110218
公开日2010年10月6日 申请日期2010年2月2日 优先权日2010年2月2日
发明者任德强, 吴金, 崔艳丽, 张智明, 张立恒, 戴秀莉, 杨万秋, 柴华, 潘兴广, 胡瑛瑛, 藏玉婷 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司