一种猪细小病毒毒株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪细小病毒毒株，猪细小病毒（Parvoviridae），CCTCCNO：V201313。本发明采用PCR方法对河南地区采集的疑似PPV病料进行PCR检测，通过接种猪睾丸（ST）细胞分离到1株病毒，命名为HP104。通过观察细胞病变、生物学特性研究、电镜观察病毒的形态等途径证实分离的病毒为猪细小病毒。本发明将猪细小病毒HP104株病毒液与油乳剂混合制成乳化剂，然后接种健康豚鼠，28天后检测到HI抗体水平达到128，而对照组豚鼠猪细小病毒抗体呈阴性。说明河南分离株PPVHP104具有良好的免疫原性。
【专利说明】一种猪细小病毒毒株
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种猪细小病毒毒株的制备方法。
【背景技术】
[0002]猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。能够导致受感染母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔猪，同时还会引起仔猪皮炎症状、非化脓性心肌炎和消瘦性综合征。猪细小病毒又常同猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪瘟、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等混合感染而加重了其危害。
[0003]一些科研工作者曾经做过河南地区猪细小病毒的流行病学调查，发现很多猪场都有PPV抗体阳性猪存在，说明河南地区PPV的感染情况比较严重，给河南地区养猪业造成了重大的经济损失。在当前情况下，对河南地区存在的猪细小病毒进行研究也就显得尤为
重要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种猪细小病毒毒株，分类命名:猪细小病毒，拉丁文学名:Parvoviridae,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏单位简称:CCTCC,保藏单位地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期:2013年5月28日，保藏编号CCTCC NO:V201313o
[0005]本发明的技术方案是:一种猪细小病毒毒株，猪细小病毒(Parvoviridae)，CCTCCNO:V201313o
[0006]本发明的有益效果是:本发明采用PCR方法对河南地区采集的疑似PPV病料进行PCR检测，通过接种猪睾丸(ST)细胞分离到I株病毒，命名为HP104。通过观察细胞病变、生物学特性研究、电镜观察病毒的形态等途径证实分离的病毒为猪细小病毒。
[0007]本发明将猪细小病毒HP104株病毒液与油乳剂混合制成乳化剂，然后接种健康豚鼠，28天后检测到HI抗体水平达到128，而对照组豚鼠猪细小病毒抗体呈阴性。说明河南分离株PPV HP104具有良好的免疫原性。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为组织病料中PPV的PCR扩增结果，其中M.DNA Marker DL 2000; 1.病料中的PPV的PCR扩增产物；2.阴性对照；
图2为HP104株电镜照片；
图3为猪细小病毒HP104全基因组各片段PCR扩增结果，M.DNA Marker DL2000; 1.P1/P2扩增结果；2.P3/P4扩增结果；3.P5/P6扩增结果；4.P7/P8扩增结果；5.阴性对照；
图4为重组质粒PCR鉴定结果，M.DNA Marker DL2000; 1.P1/P2扩增片段;2.P3/P4扩增片段；3.P5/P6扩增片段；4.P7/P8扩增片段；5.阴性对照；图5为PPV不同分离株基因的核苷酸序列同源性分析 图6为PPV全基因序列系统发育进化树。
【具体实施方式】
[0009]一种猪细小病毒毒株，猪细小病毒(Parvoviridae)，CCTCC NO:V201313。
[0010]一猪细小病毒毒株HP104的分离鉴定和生物学特性的研究 I材料与方法
1.1材料
1.1.1病料组织和细胞株
病料组织采自河南省新乡市某猪场病死仔猪的胎衣、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结。河南省新乡市某猪场1000头母猪，2012年9月有10头初产母猪流产、死产，母猪无明显症状，而断奶仔猪被毛粗糙、精神沉郁。根据发病情况，怀疑是PPV感染)猪睾丸(ST)细胞购自中国兽药监察所(冻存)。
[0011]1.1.2 HA试剂的配制
0.01 M PBS液的配制:取氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，磷酸二氢钠1.15 g，磷酸氢二钾
0.2 g，溶于800 mL三蒸水中充 分溶解后定容至1000 mL，调pH值到7.4，高压灭菌后4°C保存备用。
[0012]抗凝剂(3.8%柠檬酸钠)的配制:称取柠檬酸钠3.8g，加灭菌蒸馏水至100 mL,装瓶备用。
[0013]0.6%豚鼠红细胞悬液制备:按常规方法心脏采集健康豚鼠血液(每毫升血液加入抗凝剂0.2 mL)，将血液注入离心管中，经2000 rpm离心lOmin，用移液器吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞用PBS液洗涤，如此反复洗涤三次，第三次离心10min后弃上清液，加PBS配制成0.6%的红细胞悬液。
[0014]1.2引物设计
从GenBank中下载多条具有代表性的猪细小病毒基因组序列，利用DNAStar软件寻找非结构蛋白NSl基因中的序列。应用Primer premier 5.0软件设计出扩增195 bp的引物Pl和P2，用于检测PPV。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0015]Pl 5’- CCA AAA ATG CAA ACC CCA ATA-3’
P2 5’- ATCT GGC GGT GTT GGA GTT AAG-3’
1.3病料的PCR检测和处理
1.3.1病料的PCR检测
采用蛋白酶K法提取病料组织(死胎胎衣、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结)DNA。以病料组织DNA为模板，进行PCR扩增反应，扩增体系为2 X PCR Taq Mix聚合酶12 μ L，模板DNA 3UL，引物Pl和Ρ2各0.5 yL，补超纯水至25 μ L。混匀后于PCR仪上进行扩增，同时设无模板的阴性对照。反应条件为95°C预变性5 min ；94°C I min,53°C 50 s,72°C 50 s，共30个循环；最后72°C延伸10 min。反应结束后，取5 μ? PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶(含
0.5 Pg/mL EB)进行电泳检测PCR结果。
[0016]如果PCR检测结果为阳性，则将PCR产物回收纯化并连接到T载体上，经连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的PCR和酶切鉴定等过程，对鉴定的阳性克隆进行序列测定，由上海生物工程有限公司完成，
1.3.2病料的处理
将PCR检测为阳性的病料组织按1:5(w/V)加入含青霉素I OOO U/mL和链霉素I 000U/mL的灭菌PBS液，经研钵研磨后，放入_20°C冰箱中，反复冻融3次，再用0.22 Mm的细菌滤器过滤除菌。
[0017]1.4病毒的培养与增殖
将处理后的病料按培养液量的1/10同步接种到ST细胞中，置于5%C02 37°C恒温培养箱中培养72 h。收获接毒细胞，反复冻融3次收集病毒，8000 rpm离心30min去除细胞碎片，此为第I代毒，命名为PPV HP104。按10%接毒量盲传至细胞出现了较稳定的细胞病变(CPE)，此后按培养液体积的2%接毒，用同样的方法将该毒株连续传代到第25代。
[0018]1.5细胞病变观察
将状态良好长成单层的ST细胞用0.25%胰酶按常规方法消化后，同步接种PPV HP104第10代细胞培养物，置于5%C02 3 7°C恒温培养箱中培养。逐日观察细胞病变直至收获病毒。
[0019]1.6病毒滴度TCID5tl的测定
将消化吹散的ST细胞悬液加入EP管中，取PPV HP104第10、15、20、25代细胞培养物分别连续倍比稀释KT1?10_1(1，在细胞培养箱中孵育Ih后接种到96孔板中，每孔200 μ?,每个稀释度各作6个重复，逐日观察细胞病变情况，并按照Reed-Muench法计算病毒滴度TCID500`[0020]1.7病毒血凝效价的测定
在96孔“V”型微量反应板上，加入50 μ? PBS液于反应板的第I孔至第12孔，再加50μ? PPV ΗΡ104第10、15、20、25代细胞培养物于每排第I孔，按倍比稀释至第11孔，弃去50 μ L，第12孔为阴性对照孔，加50 μ L 0.6%的豚鼠红细胞悬液于每孔。在微量震荡器上摇匀10 S，放置37°C温箱静置I h，以50%红细胞凝集为终点，样品出现凝集终点的最高稀释度为该病毒液HA效价。
[0021]1.8理化特性研究
取5只灭菌的离心管，在超净台内分别加入3 mL PPV HP104第20代细胞液。第I管加入终浓度为4.8%的分析纯氯仿混合振荡,置于4°C作用10 min,随后用500 rpm的速度离心5 min，然后吸取上层液体；第2管用0.1 mol/L的盐酸调pH至3.0，于37°C水浴作用2 h，再用5.6%的NaHC03溶液将pH值调回至7.2 ;第3管置于56°C水浴中作用30 min ;第
4管加入1%的胰蛋白酶置37°C水浴作用I h后，用灭活胎牛血清终止其作用；第5管不处理作为正常对照。然后分别ST传代细胞按常规方法测定其TCID5tlt5
[0022]1.9形态学观察
取PPV HP104第25代细胞培养物在_20°C反复冻融3次，用超声波将其处理3次，每次5 min，在4°C条件下12 000 rpm离心I h，取上清液用IN NaOH把pH调至8.0 ;缓缓加入PEG-6000至10%，0.5M NaCL，搅拌I h后放置在4°C过夜，过夜后20 000 rpm离心I h，沉淀物用少量TEI液溶解，20 000 rpm离心30 min,取上清后以50 000 rpm离心2.5 h,然后将上清弃去，用少量TEI把沉淀物溶解，12 000 rpm离心15 min，上清液就是浓缩的PPV病毒液,取2 μ?涂在柱上,用电镜进行观察照相。[0023]2 结果
2.1病料的PPV检测结果和测序结果
从疑似PPV感染的病料组织中提取DNA，进行PCR扩增，扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳检测表明，获得了 I条约200 bp的的特异性带(图1)，与预期片段大小相符。
[0024]阳性克隆测序结果表明PCR扩增片段长度为195bp，与预期结果相符合。将阳性片段序列与Genbank中已发表的多株猪细小病毒序列进行核苷酸同源性比较后，发现同源性可达到100%。测序结果如下:
【权利要求】
1.一种猪细小病毒毒株，其特征在于，猪细小病毒(Parvoviridae)，CCTCC NO:V201313 。
【文档编号】C12R1/93GK103436497SQ201310235390
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年6月14日 优先权日:2013年6月14日
【发明者】崔保安, 陈红英, 吴宇阳, 陈龙彪, 魏战勇, 李新生 申请人:河南农业大学