一种猪圆环病毒Ⅱ型毒株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪圆环病毒Ⅱ型毒株，猪圆环病毒Ⅱ型(Circoviridae)，CCTCC?NO：V201312。本发明对PCV2体外培养增殖条件进行优化并筛选出一株对PCV2敏感性较高的命名为L8的PK15细胞克隆株，为PCV2进一步研究奠定了基础。
【专利说明】—种猪圆环病毒II型毒株
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种猪圆环病毒II型毒株。
【背景技术】
[0002]1974年，德国一个研究者从猪肾细胞系PK15(ATCC-CCL33)发现一个新的，没有致病性的微小核糖核苷酸病毒样污染物。随后报道该污染物是一个二十面体，没有囊膜，有一个单股环状DNA基因组的病毒，是已知最小的能在哺乳动物细胞中进行自我复制的病毒，紧接着，命名为猪圆环病毒(PCV)。它主要感染单核/巨噬细胞系细胞，其中猪肺泡巨噬细胞是其主要的靶细胞。随后在德国、加拿大、大不列颠以及北爱尔兰进行猪的PCV抗体血清学调查，结果表明猪群中PCV普遍存在。用PCV试验感染9月龄大的猪，结果不发生临床疾病，因此认为病毒没有致病性。
[0003]90年代末期，从加拿大西部的患有消瘦性疾病的猪群身上第一次分离出类似PCV样的病毒。此后不久在美国北部和欧洲也分离出类似加拿大的病毒株。用单抗、多抗、基因序列分析都显示出这些毒株在免疫原性和遗传学与PCV的不同。因此提出，病猪分离的PCV为PCV2，之前PK15分离的PCV为PCVl。尽管PCVl无致病性，但广泛存在于猪体和猪源细胞系；PCV2具有致病性，可引起猪的多种疾病。PCV2和猪的一系列疾病综合症相关，科学术语称圆环病毒病(PCVD)。1996年首次报道消瘦综合症是加拿大西部的猪，1991年第一次在一个健康的SPF猪群中分离出PCV2。作者提出PMWS这个名词来描述其临床症状。感染猪的损伤部位检测出大量PCV2核苷酸和抗原，能分离出PCV2。在加利福尼亚6周龄的猪的间质性肺炎和淋巴结病能检测出PCV2基因组，也分离出一株PCV2病毒。1996-1997年，PCV2相关的消瘦疾病在法国和西班牙报道。从此以后，PCV2相关的PMWS在世界所有养猪国家争相报道。从1986年西班牙、英国和1989年日本的PMWS猪保存的组织病变样本中检测出大量PCV2抗原。此外，从一个回顾评价中发现，早在1969年就有PCV2在猪群中感染的证据。因此，不能说PMWS是一种新病，也不能说PCV2是一个新病毒。PCV2与另外一个在猪群迅速扩大的疾病相关，猪皮炎肾病综合症(PDNS)，在一些国家TONS已经达到动物流行病比例。尽管流行病学显示PMWS与I3DNS可能是有联系的，但TONS感染是否与PCV2有直接关系仍需要证明。PCV2是猪繁殖障碍的一个病因，能在新生猪心肌炎的心脏组织中检测出大量PCV2。PCV2抗原在增生性坏死性肺炎(PNP)猪的肺组织中大量检出，也能在母猪流产死亡综合症(SAMS)的母猪组织中检测出PCV2。PCV2也是猪呼吸道疾病综合症的一个诱因。
[0004]在PCVAD中，PMWS危害最大，它主`要发生于5?16周龄的断奶仔猪，是一种以进行性消瘦和多系统病理损伤为主要特征的免疫抑制性疾病，并且易与其它病原并发或继发感染。据估计PCVD每年给欧盟带来6亿欧元的损失。直接损失来自于保育猪和育肥猪的死亡、淘汰猪。间接损失来自于为控制继发感染而投入的抗生素和为减少PMWS影响而投入的猪场管理费用。
[0005]目前，对于PCV2引发的疾病还没有一个有效的预防措施，但首选方案还是对猪只接种疫苗。疫苗研制上，遇到最大的困难就是PCV2病毒增殖滴度低的问题。病毒体外培养增殖能力弱，很难满足疫苗生产要求。此外，没有一个固定的疫苗免疫效果评价标准，强毒感染动物模型反应结果不一。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种猪圆环病毒II型毒株，分类命名:猪圆环病毒II型，拉丁文学名:Circoviridae，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称:CCTCC，保藏单位地址:湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期:2013年5月28日，保藏编号 CCTCC NO:V201312o
[0007]本发明的技术方案是:一种猪圆环病毒II型毒株，猪圆环病毒II型(Circoviridae)，CCTCC NO:V201312。
[0008]本发明的有益效果是:本试验对PCV2体外培养增殖条件进行优化并筛选出一株对PCV2敏感性较高的命名 为L8的PK15细胞克隆株，为PCV2进一步研究奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为组织病料中PCV2的PCR扩增结果，M.DNA Marker DL 2000; 1-2.病料中的PCV2 PCR扩增产物；3.阴性对照；
图2为细胞毒PCV2全基因组的PCR产物，M.DNA Marker DL 2000; 1-2.细胞毒中PCV2的PCR扩增产物；3.阴性对照；
图3为PCV2毒株全基因组核苷酸序列比较，分别代表AY556476，AY556477，AY578327, DQ910866, DQ915587, DQ923524, EF210106, EF565364,EF592576, EU148504,EU386606, EU408780, EU547458, EU747085, EU921257, FJ804417, FJ870972, FJ905470,FN687856,⑶049340，⑶247992， HM038028, HM038032, HM776453, HQ378161,EU780074,JQ692110, AF055392, AF055394, EU148503，HZ09。▲表示实验室分离株；★表示2a, 2b, 2c参考序列；
图4为PCV2分离株基因组核苷酸序列的系统进化树，▲表示实验室分离株；
图 5 为病毒传代 PCR 检测，M.DNA Marker DL 2000; 1-6.分别代表 PCV2 I, 4，8，12，16，20代;7.阴性对照；
图6为系列稀释法不意图；
图 7 为 L8 细胞 PCVl 检测，M.DNA Marker DL 2000; 1.PCVl PCR 产物;2.L8 细胞;
3.阴性对照。
【具体实施方式】
[0010]一种猪圆环病毒II型毒株，猪圆环病毒II型(Circoviridae)，CCTCC NO:V201312。
[0011]一猪圆环病毒II型PCV2/HZ09株的分离鉴定及全基因组序列分析 I材料和方法
1.1试验材料
2009年8月采自郑州某猪场疑似断奶后多系统衰竭综合征猪的淋巴结、肺脏和脾脏等组织。aq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、pMD18_T载体、Χ-gal (5_溴_4_氯 _3_吲哚-β-D半乳糖苷)和IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖)等购自宝生物工程(大连)有限公司；胶回收试剂盒购于BioTeke公司；RPMI Medium 1640、新生牛血清购自索莱宝公司；兔抗猪IgG-FITC, D-Glucosamine购自Sigma公司；特异性抗PCV2抗血清购自VMRD公司。
[0012]1.2引物设计
引物 P1/P2 参考文献(Kim et al., 2003)(表 I)。引物 P3/P4 根据 GenBank 中 PCVl、PCV2核苷酸序列，利用01ig06.0设计。引物P1/P2和P3/P4分别用于PCV2的PCR检测和全基因组的扩增。引物由上海生物工程服务有限公司合成。
[0013]表I PCV2检测引物和全基因扩增引物
【权利要求】
1.一种猪圆环病毒II型毒株，其特征在于，猪圆环病毒II型(CiiXOViridae), CCTCCNO:V201312o`
【文档编号】C12N7/00GK103436498SQ201310235414
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年6月14日 优先权日:2013年6月14日
【发明者】崔保安, 陈红英, 卢权威, 郭官鹏, 郭敬, 李新生, 魏战勇 申请人:河南农业大学