专利名称：猪细小病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法
技术领域：
本发明涉及一种实时荧光PCR检测方法，具体涉及猪细小病毒与猪圆环病毒2型 二重STOR Green I实时荧光PCR检测方法。
背景技术：
猪细小病毒病(PPV)是由猪细小病毒感染引起的以母猪繁殖障碍为主要特征的 病毒性传染病，其特征是母猪孕前期感染该病毒时，经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭，引起母 猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等，同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻，但 其它类型的猪感染后无明显临床症状。PPV在猪群中检出率甚高，在猪群中的血清抗体阳性 率达50% 80%，是困扰养猪业发展的主要病毒性繁殖障碍性疾病之一。猪圆环病毒2型(PCM)是近年来新发现畜禽病毒之一，是迄今发现的一种最小的 动物病毒，根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列可分成PCVl和PCV2两种基因型。PCVl 无致病性，广泛存在于猪原代细胞系及猪群中；PCV2有致病性，可引起猪断奶后多系统衰 竭综合征、猪皮炎与肾病综合征、断奶猪和育肥猪的呼吸道疾病、猪的繁殖障碍等疾病，并 与猪的繁殖与呼吸综合征、细小病毒病、伪狂犬病毒病、幼龄仔猪的先天性震颤等疾病的发 生密切相关。目前，国内外对以上病毒已开展了大量相关研究，建立了病毒分离、免疫荧光法、 ELISA方法、免疫组化法等方法，以及多种检测PPV、PCV2的PCR方法，如竞争PCR、套式PCR 和原位杂交等。但病毒分离耗时，原位杂交虽然有很高的灵敏度，但操作繁琐，成本较高，周 期较长，并且对病料的要求较高。目前PCR具有较高的敏感性和特异性，广泛应用于临床诊 断。但由于不同的引物之间差别较大，以及PCR扩增时各种因素的影响，诊断时往往容易出 现假阴性的结果，且不能定量；尤其是对隐性感染动物往往漏检，从而造成了疾病的流行和 蔓延。虽然PRV、PPV等建立的TaqMan探针法能够定性、定量，但成本偏高，不利于推广应 用。STOR Green I是非特异性结合于双链DNA的荧光染料，可以和多种扩增序列结合。STOR Green I PCR检测方法可以不用设计和合成特异的荧光标记的探针直接扩增检测任何基因 的技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是设计与合成出猪细小病毒与猪圆环病毒2型引物后， 利用引物用STOR Green I实时荧光PCR检测方法同时检测出猪细小病毒与猪圆环病毒2 型两种病毒。本发明的技术方案是猪细小病毒与猪圆环病毒2型二重STOR Green I实时荧光 PCR检测引物的序列如下猪圆环病毒2型引物的序列如下上游引物Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3‘；
下游引物P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘；猪细小病毒引物的序列如下上游引物P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3‘；下游引物P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'。利用上述引物检测猪细小病毒与猪圆环病毒2型的二重STOR Green I实时荧 光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光PCR反应体系和 SYBRGreen I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份
权利要求
1.猪细小病毒与猪圆环病毒2型二重STORGreen I实时荧光PCR检测引物，其特征在于猪圆环病毒2型引物的序列如下 上游引物 Pl 5' -TAA CTA CTC CTC CCG CCATAC-3‘； 下游引物 P2 5' -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3‘； 猪细小病毒引物的序列如下 上游引物 P3 5' -TGG GAG GGC TTG GTT AGA-3‘； 下游引物 P4:5' -TGG TGG TGA GGT TGC TGA T-3'。
2.利用权利要求1所述引物检测猪细小病毒与猪圆环病毒2型的二重STORGreen I 实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下STOR Green I实时荧光PCR反应 体系和STOR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测，其特征在于所述STOR Green I实时荧光PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成份
全文摘要
本发明公开了一种猪细小病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法，设计与合成引物，利用引物检测猪细小病毒与猪圆环病毒2型的二重SYBR Green I实时荧光PCR检测方法，包括提取样品的DNA后，按如下SYBR Green I实时荧光PCR反应体系和SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。本发明能同时检测猪细小病毒与猪圆环病毒2型两种DNA病毒，不能检测出猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒，并且具有较好的特异性、重复性和敏感性。
文档编号C12N15/11GK102071257SQ20091017271
公开日2011年5月25日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者党玉丽, 崔保安, 李明凤, 郭显坡, 陈红英, 魏战勇 申请人:河南农业大学