猪细小病毒5a、使用方法及疫苗的制作方法
【专利说明】
[0001] 序列表
[0002] 本申请案含有根据37C.F.R. 1.821-1.825之序列表。本申请案之随附序列 表W全文引用的方式并入本文中。2013年3月21日建立之该ASCII复本系命名为 10-0150-PCT-SEQ.txt且大小为 34, 542 字节。
技术领域
[0003] 本发明属于动物健康领域且设及新猪细小病毒株（包括用于接种之减毒病毒 株）、制造方法及使用自该新颖细小病毒株获得之疫苗之治疗方法。
【背景技术】
[0004] 细小病毒感染多种动物物种，且其中一些可引起严重临床疾病，但大部分该等 病毒仅引起轻度或亚临床感染。其属于细小病毒科（Parvoviridae)且形成两个亚科： 浓核病毒亚科值ensovirinae)，其成员感染昆虫；及细小病毒亚科（Parvovirinae)，其 成员感染脊椎动物。后一亚科当前包括五个属：依赖病毒属值巧endovirus)、红病毒属 巧ryt虹ovirus)、阿留申水貂病毒属（Amdovirus)、博卡病毒属度ocavirus)及细小病毒 (1) (Parvovirus(1))。 阳0化]细小病毒病毒粒子为非包膜型且含有约5-6千碱基化ilobases;化）之单股、线性DNA基因组。基因组由两个主要开放阅读框架（OR巧组成，该两个主要开放阅读框架编码非 结构及衣壳蛋白。最近描述之博卡病毒在两个主要0RF之间携带第Ξ个ORF(l)。
[0006] 细小病毒属中之经典猪细小病毒（PPV1)株在全世界广泛分布且可引起猪之生殖 性障碍，尤其在接种方案未正确进行或疫苗功效由于免疫抑制因子而降低之畜群中。在最 近十年期间，已在猪中检测到多种新型细小病毒。该等细小病毒包括猪细小病毒2(PPV2) (2) 及相关病毒（3)。在香港鉴定一组新型猪及牛细小病毒，亦即胡可病毒化okoviruses) (P化V，B化V) (4)，且发现该等病毒在遗传学上与人类PARV4及PARV5类似。尽管其最初W 香港命名为胡可病毒，但提出将KloV新型分类为PPV3巧）。PPV4展示与牛细小病毒2之最 高相似性，但编码能力及基因组组构与博卡病毒类似，因为PPV4与博卡病毒类似地编码位 于0RF1与0RF2之间的额外0RF3。然而，PPV4编码之推定0RF3蛋白与博卡病毒编码之蛋 白质显著不同巧）。
[0007] 仍需要监测猪中新型病毒之出现及研发关于新型病毒之疫苗、治疗及检测方法。
【发明内容】
[0008] 本发明提供新颖核巧酸序列、蛋白质序列、免疫原性组合物、疫苗W及关于制造及 使用新型细小病毒株之方法，该等新颖细小病毒株尤其感染驯养猪。该等病毒株设及在来 自临床患病之驯养猪之组织样品中鉴定的新颖猪细小病毒；基于与已知猪细小病毒物种及 病毒株之序列同源性，该新颖病毒命名为猪细小病毒5A或PPV5A。
[0009] 本发明之组合物及方法使得检测由该新型病毒所致之感染、监测野生及驯养动物 w及畜群中病毒序列之遗传性变化，w及制造及使用新颖疫苗来保护动物免于病毒感染。
[0010] 本发明之免疫原性组合物及疫苗包含由SEQIDNO: 1之核酸序列编码之多肤序 列，或其免疫原性片段，可选地包括用于诱导更强免疫原性反应的佐剂。
[0011] 本发明之例示性组合物包含沈QIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4之多肤序列 或其对PPV5A特异性抗体具有免疫反应性之片段中之任一者。本发明之较佳多肤包括SEQ IDN0:2或SEQIDN0:4之序列，尤其SEQIDN0:4。较佳地，该等多肤或其片段对PPV5A 特异性抗体具有免疫反应性。
[0012] 在另一方面中，本发明提供编码一或多种多肤、抗体构建体或抗体缀合物之核酸 序列。编码多肤之基因序列包含与SEQIDN0:1之序列至少95%、90%、85%或甚至80% 同源及/或相同的核酸序列，详言之，SEQIDNO: 1(衣壳蛋白）之核巧酸序列2845-5547， 或SEQIDNO: 1中编码对PPV5A特异性抗体具有免疫反应性之多肤的片段。本发明之例示 性核酸序列包括沈QIDNO: 1之核巧酸1975-2844及沈QIDNO: 1之核巧酸2845-5547之 序列，及其编码对PPV5A特异性抗体具有免疫反应性之多肤的片段之序列中之任一者。较 佳地，核酸序列或基因为编码对PPV5A特异性抗体具有免疫反应性之多肤或肤的核酸序列 或基因。
[0013] 此外，如本文中所用之本发明之多肤包括（但不限于）包含W下之多肤：
[0014] U包含沈QIDNO:2或沈QIDNO:4之氨基酸序列的多肤； 阳015] ii)与i)之多肤至少80%同源及/或相同之多肤；
[0016] iii)i)及/或ii)之多肤之片段；
[0017] iv)iii)或iv)之片段，其包含至少5个、较佳8个、更佳10个、甚至更佳15个包 括于SEQIDNO:2或SEQIDNO:4之序列中之连续氨基酸；
[0018] V)由多核巧酸编码之多肤，该多核巧酸包含SEQIDNO: 1之核巧酸1975-2844或 沈QIDNO: 1之核巧酸2845-5547的序列；
[0019] Vi)由与Vi)之多核巧酸至少80%同源或相同之多核巧酸编码之多肤；
[0020] vii)由多核巧酸编码之蛋白质片段，该多核巧酸包含至少15个、较佳24个、更佳 30个、甚至更佳45个包括于沈QIDNO: 1之核巧酸1975-2844或沈QIDNO: 1之核巧酸 2845-5547之序列中之连续核巧酸。 阳021] 本发明之免疫原性组合物包含至少一或多种如本文中定义之PPV5A多肤，可进一 步包含生理学上可接受之媒介物，诸如医药学上或兽医学可接受之载剂、佐剂或其组合。
[0022] 由此提供之任何PPV5A多肤或包含由此提供之该等PPV5A多肤中一或多者之任何 免疫原性组合物均可用作药物，较佳用作疫苗或免疫原性组合物，最佳用于对象针对PPV5A 感染之预防或治疗。
[0023] 尤其较佳PPV5A多肤包括具有免疫原性表位之多肤，该等免疫原性表位诱导对 PPV5A具有特异性之免疫学反应。较佳PPVA多肤包括具有在相关PPV1中被预测为表面抗 原之氨基酸序列的多肤（Simpson等人，JMB315, 2002)且包括（但不限于）SEQIDN0:4 之残基 141-156、272-278 及 329-339。
[0024] 本领域技术人员将理解，本文中使用之组合物可合并有已知可注射、生理学上可 接受之无菌溶液。对于制备供非经肠注射或输注之即用型溶液，可轻易地使用等张水溶液， 例如生理食盐水或血浆蛋白溶液。此外，本发明之免疫原性及疫苗组合物可包括兽医学可 接受之载剂、稀释剂、等张剂、稳定剂或佐剂。
[00巧]本发明之方法包括（但不限于）在对象中引起针对PPV5A感染之免疫反应的方 法，其包含向对象施用包含一或多种如本文中定义之PPV5A多肤之免疫原性组合物的步 骤。较佳地，针对PPV5A之大于一种血清型或病毒株引起免疫反应。本发明之组合物可用 于治疗或者预防PPV5A感染。较佳地，该免疫反应降低与一或多种PPV5A血清型之感染相 关或由一或多种PPV5A血清型之感染引起之一或多种临床病征之发病率或严重性。
[00%] 本文中，需要接受本发明之组合物之施用的合适对象包括需要预防或治疗与病 毒、微生物、寄生物、原虫、细菌或真菌有关之感染、疾病或病状的动物。藉由使用本发明之 组合物或方法来刺激免疫反应之动物包括家畜，诸如猪、牛、家禽（例如鸡、鸭、碟或火鸡）、 山羊及绵羊；及驯养动物，诸如小鼠、兔、犬、猫及马。较佳动物包括猪、鼠科动物、马科动物、 兔类动物及牛科动物。最佳在猪中刺激免疫反应。
[0027]本发明亦提供降低与PPV5A感染相关或由PPV5A感染引起之一或多种临床病征之 发病率或严重性的方法，其包含施用本发明之免疫原性组合物之步骤，该免疫原性组合物 包含一或多种由此提供之PPV5A肤且较佳包含载体分子，使得与未接受由此提供之免疫原 性组合物的对象相比，PPV5A感染之临床病征之发病率或严重性降低至少10%，较佳至少 20%，更佳至少30%，更佳至少50%，更佳至少70%，最佳至少100%。该等临床病征包括 由单独PPV5A感染引起之病毒血症及免疫抑制。该等临床病征可包括神经病学病征（抑郁 症、共济失调、嗜睡）、腹泻、呼吸困难、体况损失、关节肿胀（引起贩行及仰邸）、平均每日体 重增加降低、死亡及由与另一生物体（例如猪鼻支原体（Mycoplasmahyorhinis))之合并 感染引起之多发性浆膜炎。
[0028]根据另一方面，本发明亦设及预防PPV5A感染之方法，其中该PPV5A感染可由与 沈QIDNO1、2、3及/或4之核巧酸序列具有100%序列相同性、与沈QIDNO1、2、3及/ 或4之核巧酸序列具有至少95%序列相同性、与SEQIDNO1、2、3及/或4之核巧酸序列 具有至少90%序列相同性或与SEQIDNO1、2、3及/或4之核巧酸序列具有至少85%序 列相同性的PPV5A引起，该方法包含施用本发明之免疫原性组合物之步骤，该免疫原性组 合物包含一或多种由此提供之PPV5A肤。
[0029]本发明亦提供制备由此提供之任何免疫原性组合物之方法，该方法包含将一或多 种由此提供之PPV5A肤与载体分子混合，较佳使得该一或多种PPV5A肤及载体分子彼此共 价偶合或缀合。该等缀合物可为多价或单价的。多价组合物或疫苗包括多种PPV5A肤与载 体分子之免疫结合。在另一方面中，本发明提供制造一或多种PPV5A肤之方法，该方法包含 用编码由此提供之任何PPV5A肤的核酸分子转化宿主细胞（较佳为原核细胞，诸如大肠杆 菌巧.coli))。或者，宿主细胞可为真核细胞，诸如动物细胞、昆虫细胞、原生生物细胞、植物 细胞或真菌细胞。较佳地，真核细胞为哺乳动物细胞，诸如CH0、BHK或COS;或真菌细胞，诸 如酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae);或昆虫细胞，诸如Sf9。本发明核酸之杆状病毒 度aculovirus)表达亦为较佳。
[0030] 本发明之另一方面提供制造一或多种PPV5A肤之方法，该一或多种PPV5A肤诱 导针对至少一种PPV5A遗传变体且更佳两种或两种W上PPV5A遗传变体之免疫反应。此 方法包含培养经转化之表达载体，该经转化之表达载体编码及表达一或多种本文中掲示之 PPV5A肤。经表达之蛋白质由表达生物体保留或分泌至培养基中。表达系在足W产生能够 诱导针对PPV5A之免疫反应的PPV5A肤之条件下进行。PPV5A血清型（PPV5A肤诱导针对其 之免疫反应）包括（但不限于）具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、 91%或90%相同性之序列。
[0031] 制造本发明之组合物之方法可进一步包含将一或多种PPV5A肤与载体分子之缀 合物与生理学上可接受之媒介物（诸如医药学上或兽医学可接受之载剂、佐剂或其组合） 混合。本领域技术人员将认识到媒介物、佐剂或组合之选择将尤其由递送途径、个人偏好及 动物物种决定。
[0032] 在另一方面中，本发明提供诊断对象中之PPV5A感染之方法。该方法包含提供一 或多种PPV5A肤；使该一或多种PPV5A肤与自对象获得之样品接触；及若在样品中检测到 能够结合一或多种PPV5A肤之抗体，则鉴定对象患有PPV5A感染。
[0033] 在另一方面中，本发明提供确定对象先前已暴露于PPV5A感染且能够表达针对 PPV5A之免疫反应的方法。该方法包含提供一或多种PPV5A肤；使该一或多种PPV5A肤与 自对象获得之样品接触；及若在样品中检测到能够结合一或多种PPV5A肤之抗体，则鉴定 对象患有PPV5A感染。
[0034] 本发明亦提供包含免疫原性组合物之试剂盒，该免疫原性组合物包含一或多种 PPV5A肤，较佳连同载体分子一起；用于封装免疫原性组合物之容器；一组印刷说明书；及 能够将免疫原性组合物施用动物之施配器。可选地，一或多种PPV5A肤及载体分子可W缀 合物形式或W各别化合物形式被封装。当分开供应时，亦供应使一或多种PPV5A肤与载体 分子缀合之构件W及适当印刷说明书。
[0035] 本发明亦提供用于对动物进行接种之试剂盒，其包含一组印刷说明书；能够将由 此提供之包含一或多种PPV5A肤之免疫原性组合物施用至动物之施配器；且其中至少一 种PPV5A肤有效地使动物对至少一种与PPV5A感染相关之疾病免疫。较佳地，该一或多种 PPV5A肤系选自由此提供之PPV5A肤。本发明之试剂盒可进一步包含兽医学可接受之载剂、 佐剂或其组合。
[0036] 本发明之试剂盒中之施配器能够将其内含物W液滴形式施配；且当经鼻内、经口、 皮内或肌肉内施用动物时，试剂盒中所包括之包含由此提供之PPV5A肤的免疫原性组合物 能够降低PPV5A感染之至少一种临床病征之严重性。较佳地，与未经治疗之受感染动物相 tL临床病征之严重性较佳降低至少10%，较佳至少20%，更佳至少30%，更佳至少50%， 更佳至少70 %，最佳至少100 %。
[0037] 亦掲示用于治疗或预防由PPV5A引起之感染的方法。该方法包含向对象施用有效 量之本发明之免疫原性组合物，其中该治疗或预防系选自由W下组成之群：减少PPV5A感 染之病征、降低PPV5A感染之临床病征之严重性或发病率、降低由PPV5A感染引起之对象死 亡率及其组合。
[0038] 本发明之组合物进一步包含兽医学可接受之载剂、佐剂或其组合。该等组合物可 用作疫苗且包含一或多种额外减毒疫苗、灭活疫苗或其组合。该等疫苗引起针对至少一种 与选自由W下组成之群之病毒相关的疾病之保护性免疫学反应：猪细小病毒1、2、3、4、5A、 5B、其它猪细小病毒种、其它猪病原性病毒及细菌及其组合。可与针对PPV5A之疫苗组合 共施用之其它类型之疫苗包括（但不限于）2型猪环状病毒（例如