蛋白质纯化方法
【专利说明】蛋白质纯化方法
[0001] 本文所公开的实施方案设及用于纯化蛋白质的方法，所述蛋白质包括抗体，例如 IgG抗体和IgM抗体。
【背景技术】
[0002] 蛋白质的纯化通常始于澄清步骤，其中去除了细胞和碎片，使得剩余的上清液 可通过否则被细胞和碎片的存在所妨碍的方法处理。它们的去除通常设及物理方法，例 如离屯、和过滤。该步骤有时设及使用具有阴离子交换能力的过滤材料，或将阴离子交换 颗粒或可溶性聚合物直接添加至含抗体的收获物中（Gagnon，P.，化rificationTools forMonoclonalAntibodies,ValidatedBiosystems,Tucson, 1996 ；Kuczewski,M,.等， Bio地armInt. 23 (3) (2010) 20-25 ;Kuczewski,M.,等，Biotechnol.J. , 6 (2011) 56-65。
[0003] 用尿囊素、可溶性有机阳离子和混合的颗粒对物理澄清的细胞培养收获物的二次 处理已被描述（Gan,H.等，J.C虹omatogr.A, 1291 (2013)33-40)。该方法特别降低由死细胞 排出的染色质的含量和与染色质相关的聚集物的水平，但随后需要Ξ个色谱步骤W实现期 望的纯度。尿囊素是经抑A批准的广泛用于非处方卫生保健产品中的抗炎剂。已知显然通 过氨键合从蛋白质溶液（包括从IgG溶液）去除内毒素（Vagenende等，ACS.Appl.Mater. Inte;rfaces, 22 (2013) 4472-4478;Vagenende等，J.Qiromatogr.A1310 (2013) 15-20)。
[0004] 通过污染物与辛酸共沉淀对IgG抗体的部分纯化已被公开（化an化in,A.， 等，Arch.Biochem.Biophys. 89 (1960) 218-220 ;McKinney,Μ.等，J.Immuno1. Met.，96 (1987) 271-278)。所述脂肪酸结合所有蛋白质，但特别倾向于使酸性非IgG污染 物沉淀（Ga即on,见上文；Morais,V.,等，Biotechnol.Appl.Biochem. , 59 (2012) 50-54)。 已指明关于应用于细胞培养收获物的机制和工艺研发指南（Gagnon,见上文），包括基 本变量，如辛酸浓度、pH、盐浓度、溫度和对从可溶性IgG制剂去除残余辛酸的后续色谱 步骤的需要。所述技术最经常被描述用于制备通过其它手段进行后续纯化的粗制样品 (Gagnon，见上文；Y.Yigsaw等，2008,Improvingupstreamfeedstocktodownstream operations,RecoveryofBiologiesConferenceXIII,Quebec；Arunakumari,A.等， 美国专利申请20120101262A1)，但也在通过蛋白A亲和色谱捕获抗体后被作为改进 (polishing)步骤施加（Y.Brodsky等，Biotechnol.Bioeng. 109(2012)2589-2598)。
【发明内容】
[0005] 在一些方面，本文所公开的实施方案设及纯化祀蛋白质的方法，所述方法包括使 细胞培养收获物与具有7到10个碳原子的至少一种脂肪酸接触W形成混合物；使所述混合 物与一种或多种固体或可溶性材料接触W形成混合物，其中所述一种或多种固体或可溶性 材料包含阳离子型官能团和金属结合官能团，所述金属结合官能团包含选自由W下组成的 组的含氮部分：（1)聚胺、似亚胺、（3)N-杂环、（4)氨基酸、（5)N-径基酷胺、（6)芳基胺和 其组合；和在使所述混合物与一种或多种带静电的固体接触之后分离固体材料，W提供包 含所述祀蛋白质的溶液。处理过的液体在通过其它纯化方法处理（如果期望的话）之前可 任选地进一步经过具有包含正电荷的内部接触表面接触的装置。
[0006] 在一些方面，本文所公开的实施方案设及用于纯化祀蛋白质的方法，所述方法包 括使细胞培养收获物与具有7到10个碳原子的至少一种脂肪酸接触W形成混合物，使所述 混合物与尿囊素接触，和在使所述混合物与尿囊素接触之后分离固体材料，W提供包含所 述祀蛋白质的溶液。
[0007] 在一些方面，本文所公开的实施方案设及纯化抗体的方法，所述方法包括使细胞 培养收获物与具有7到10个碳原子的至少一种脂肪酸接触W形成混合物；使所述混合物与 一种或多种固体或可溶性材料接触W形成混合物，其中所述一种或多种固体或可溶性材料 包含阳离子型官能团和金属结合官能团，所述金属结合官能团包含选自由W下组成的组的 含氮部分：（1)聚胺、似亚胺、（3)N-杂环、（4)氨基酸、（5)N-径基酷胺、（6)芳基胺和其组 合；和在使所述混合物与一种或多种带静电的固体接触之后分离固体材料，W提供包含所 述抗体的溶液。处理过的液体在通过其它纯化方法处理（如果期望的话）之前可任选地另 外经过具有体现正电荷的内部接触表面接触的装置。
[0008] 在一些方面，本文所公开的实施方案设及用于纯化抗体的方法，所述方法包括使 细胞培养收获物与具有7到10个碳原子的至少一种脂肪酸接触W形成混合物，使所述混合 物与尿囊素接触，和在使所述混合物与尿囊素接触之后分离固体材料，W提供包含所述抗 体的溶液。
【具体实施方式】
[0009] 已发现，彼此化学括抗的材料的组合相比于单独依赖于任何一种材料的纯化方 法，具有W更高的纯度水平和更低的浊度水平提供包括抗体在内的祀蛋白质的出乎意料的 效应。括抗材料的组合将通常被预计抵消彼此的个别效应并导致低劣的蛋白质纯化、低劣 的蛋白质回收或两者。然而，本发明实施方案提供了限定的窗口，在所述窗口内所述材料协 同地作用而实现了显著超过任何单个组分提供的能力的蛋白质纯度水平和回收率水平。运 些观察结果特别适用于抗体，例如IgG抗体和IgM抗体。另外，实验结果表明所述组合中的 每种组分的反应性曲线不同于它们在被单独使用时的反应性曲线。运强调了本文所公开的 实施方案的实用性不能通过单独组分的已知性质或应用来预测。待组合的组分可包括含有 7个或8个或9个或10个碳原子的饱和脂肪酸、或具有一个双键的含有6个或7个或8个 或9个碳原子的不饱和脂肪酸、和带正电荷的可溶性材料和/或固体材料。它们可进一步 包括一种或多种包含金属结合官能团的固体或可溶性材料。它们可进一步包括尿囊素。在 本文所公开的方法中，将所述材料组合于含有祀蛋白质（例如抗体种类）的液体制剂中，然 后在合适的解育时间段后，去除固体W提供包含所述抗体的溶液，所述溶液中不存在高达 99%或更高的宿主细胞污染物，平均回收率在IgG抗体的情况下为约90%到约95%，且浊 度小于约5NTU(比浊法浊度单位）。
[0010] 实验数据证明了用于本文所公开的方法中的组分之间的相互括抗性相互作用。例 如，阳离子（正电性）组分和阴离子（负电性）组分例如脂肪酸被理解为彼此具有吸引性， 并且它们的相互作用应当倾向于降低任一种组分与例如细胞培养收获物中的抗体制剂的 其它组分相互作用的能力。运被数据证明，所述数据显示某些污染物（例如抗体轻链）被一 比例的组分组合去除，但如果增加阳离子组分的比例，则会再次现出在含抗体的液体中。在 一个特定的示例中，发生运种情况的原因被认为是与沉淀物内的污染物结合的脂肪酸相比 于其被吸引到污染物，被更强烈地吸引到阳离子型固体，因此当阳离子型固体的量增加时， 脂肪酸转移到该固体上，运从所述沉淀物释放了所述污染物，使其再次污染抗体制剂。在相 互括抗作用的另一示例中，晶体尿囊素已被实验显示结合细胞培养收获物中超过99%的脂 肪酸，表明其W类似方式作用于被添加的脂肪酸的高度可能性。应当预计运会降低出于使 抗体污染物沉淀的目的而被添加到含抗体的细胞培养收获物中的脂肪酸的有效性。相反， 本发明的运一方面有助于W小于在科学文献中被报道为最佳的水平的一半的浓度有效使 用脂肪酸。不受理论的约束，可能是，通过氨键合与未溶解的尿囊素复合的脂肪酸保存了它 们的天然电荷、疏水性和结合污染物的能力，而未溶解的尿囊素的物理密度通过沉降增强 了它们的去除。在相互括抗作用的另一示例中，将应当对脂肪酸为惰性的阴离子型馨合固 体添加到脂肪酸和阳离子型馨合固体的混合物中，使得被阳离子型固体和脂肪酸的已具有 括抗性的组合成功去除的污染物释放回到抗体溶液中。
[0011] 在相互括抗作用的另一示例中，添加弱化疏水相互作用且因此预计会干扰脂肪酸 实现其作用的能力的极低浓度的非离子型表面活性剂令人惊讶地改善了去除游离的轻链 污染物的有效性，而更大的量会损害酸性非抗体蛋白质的去除。在另一令人惊讶的示例中， 应当会干扰脂肪酸的电荷效应和疏水效应的低水平的阳离子型表面活性剂使得所述组合 去除酸性非抗体蛋白质的能力大致加倍，并且使得去除聚集物的能力加倍或呈Ξ倍，而更 高的浓度具有相反作用。运些示例强调了，当通常括抗的组分W恰当平衡的比例被组合时， 它们可产生窗口，在所述窗口内，可能去除在不存在括抗剂的情况下不被去除的污染物。通 过括抗剂提供的增强在许多情况下是如此巨大，W致于所公开的方法的总体纯化性能超过 了蛋白A亲和色谱的能力，所述蛋白A亲和色谱通常被认为是可用的最高性能的抗体纯化 方法。
[0012] 还发现，包含具有结合金属离子的能力的官能化固体材料有助于获得更高纯度和 更低聚集物含量的被处理抗体。可溶性馨合剂令人惊讶地未能产生运一益处。不受任何 理论的约束，运一作用可通过金属离子从抗体的表面优先转移到结合固体的金属亲和配体 来介导，效果是降低通过与金属离子的相互作用诱导的抗体的疏水不均匀性和静电不均匀 性；或通过具有对污染性蛋白质的相同作用且因此改变它们的化学行为W使它们更加响应 于所公开的方法来介导。或者，其可反映未通过金属介导的金属结合配体的次要特征的影 响。
[0013] 已进一步发现包含尿囊素特别增强脂肪酸沉淀去除微粒的能力。不受理论的约 束，尿囊素的作用被认为通过氨键合介导，借此大分子集合物（包括超小颗粒，包括病毒） 与更大的尿囊素晶体结合。由于其1.45g/cm3的相对高的密度，因此尿囊素晶体促进所结 合材料的快速重力沉降，并且通过离屯、增强它们的沉降。尿囊素晶体还将脂肪酸-污染物 沉淀物的物理构造从通常的胶质污泥改变为更像饼状的稠度，运有助于液体通过并改善过 滤效率。添加到水溶液中的一部分尿囊素溶解至高达约36mM的最大值，并且被认为弱化了 蛋白质与脂肪酸的疏水相互作用。溶解的尿囊素被理解为保留在去除固体后的含抗体的溶 液中。尽管运些特征是受欢迎的，但它们代表了一种惇论，因为实验数据表明尿囊素结合来 自细胞培养收获物的99. 7%的脂肪酸。如运所意味的，必须小屯、地控制尿囊素的比例。通 过通常W1-2% (w/v)开始的简单实验，来确定用于给定应用的适当比例。
[0014] 也已发现本文所公开的方法出乎意料地允许用具有7个或9个或10个碳原子的 饱和脂肪酸代替辛酸。庚酸含有7个碳。壬酸含有9个碳。癸酸含有10个碳。甚至更令 人惊讶地，具有6个或7个或8个或9个碳原子和1个双键的不饱和脂肪酸是有效的。尽 管除辛酸W外的种类在用于抗体纯化的技术领域内被忽视，但实验数据表明疏水性更高的 脂肪酸比辛酸更有效地去除抗体聚集物和片段，虽然降低抗体回收率的风险更高。
[0015] 实验数据表明本文所公开的方法可A)实现比单独的辛酸处理为10倍的更有效的 微粒去除，实现了约2比浊法浊度单位（NTU)的浊度，相比之下，仅利用单独的辛酸为20NTU 或更高度rodsky等，见上文）；B)将IgG纯度增加到大于99%，通常大于99.9%;C)将聚集 物含量降低到1%或更小，通常降低到小于0. 5%，且常常降低到小于0. 05% ;D)将抗体相 关片段的含量降低到1 %或更小曲增强DNA、内毒素和病毒的去除；巧支持IgG的90-95% 回收率；和巧允许甚至在其中生长细胞的生物反应器内实现此类纯化，由此提高工艺效 率。应当注意，运些量度中的一些的个别结果在某些情况下可通过传统的污染物与脂肪酸 的共沉淀来实现，但它们并非在单一操作中全部实现，如通过本文所公开的方法所实现的。
[0016] 实验数据进一步证实W下令人惊讶的发现：本文所公开的方法特别去除干扰可用 于W其它方式或另外纯化抗体的传统分级方法的污染物。所述方法可允许低功能分级方 法，例如超滤、或通过盐进行沉淀、或通过非离子型有机聚合物进行沉淀，W实现原本仅利 用高功能分级方法（例如蛋白A亲和色谱）才可实现的纯化水平。例如，利用所公开的方 法进行初始纯化，之后进行超滤或硫酸锭沉淀，之后进行阴离子交换色谱，将宿主蛋白质降 低到小于Ippm并且将聚集物降低到小于0. 05%。同样令人惊讶地，本文所公开的方法可 使高功能分级方法具有实现比它们通常能够实现的高数百倍的纯度的能力。例如，当蛋白 A亲和色谱通常将宿主蛋白质污染降低到约500到2000百万分率（ppm)的范围时，在所公 开的方法后实施的蛋白A色谱将宿主蛋白质污染降低到小于Ippm。
[0017] 在说明本文所公开的方法的多个方面的整合的一个示例性实施方案中，将尿囊素 W产生1% (w/v)的最终浓度的量添加到含抗体的细胞培养收获物中，之后W产生0.2% (v:v)的最终浓度的量添加癸酸。将混合物解育2小时，在此期间通过癸酸与污染物的相 互作用形成沉淀物，且所述沉淀物散布有未溶解的尿囊素晶体。在该步骤之后W产生5% (V: V)的最终浓度的量添加用TREN官能化的聚合颗粒，并且解育4小时的时间段。TREN(Ξ (2-氨乙基）胺）是可固定于聚合物颗粒或其它官能化固体上的正电性金属结合化合物。 此类材料被出售用于进行固定化金属亲和色谱的目的。终止混合并且通过任何便利方法去 除由癸酸-污染物沉淀物、残余癸酸、未溶解的尿囊素和TREN颗粒组成的固体。在相关的 实施方案中，由用替代性的带正电荷的金属结合物质官能化的颗粒替代TREN颗粒。在相关 的实施方案中，带正电荷的金属结合颗粒被颗粒的组合替代，所述颗粒的组合中的一些用 带正电荷的基于胺的离子交换剂官能化，且一些用带负电荷的金属结合物质官能化。在相 关的实施方案中，可仅存在缺乏金属亲和力的带正电荷的颗粒。在相关的实施方案中，可存 在用其它化学物质官能化的颗粒。在相关的实施方案中，基本上不含固体的含抗体液体借 助于经过正电性深度过滤器或其它装置来进一步处理，在所述装置中样品接触正电性或其 它官能化表面，且所述装置可提供清除来自样品的残余脂肪酸或其它可溶性非抗体种类的 额外益处。
[0018] 在说明本文所公开的方法的各个方面的整合的另一示例性实施方案中，将尿囊素 W产生2% (w/v)的最终浓度的量添加到细胞培养收获物中，之后W产生0.2% (v:v)的最 终浓度的量添加癸酸。将混合物解育2小时，在此期间通过癸酸与污染物的相互作用形成 沉淀物，且所述沉淀物散布有未溶解的尿囊素晶体。然后使混合物与包含至少一种官能化 固体的装置接触，所述固体保留散布有未溶解的尿囊素的癸酸-污染物沉淀物，但允许液 体经过。
[0019] 在说明本文所公开的方法的各个方面的整合的另一示例性实施方案中，将尿囊素 W产生1% (w/v)的最终浓度的量添加到细胞培养收获物中，之后W产生0.2% (v:v)的最 终浓度的量添加癸酸。将混合物解育2小时，在此期间通过癸酸与污染物的相互作用形成 沉淀物，且所述沉淀物散布有未溶解的尿囊素晶体。通过任何便利方法去除散布有未溶解 的尿囊素的癸酸-污染物沉淀物并且使液体与包含至少一种官能化表面的装置接触。
[0020] 在说明本文所公开的方法的各个方面的整合的另一示例性实施方案中，将尿囊素 W产生1% (w/v)的最终浓度的量添加到细胞培养收获物中，之后W产生0.2% (v:v)的最 终浓度的量添加癸酸。将混合物解育2小时，在此期间通过癸酸与污染物的相互作用形成 沉淀物，且所述沉淀物散布有未溶解的尿囊素晶体。在该步骤之后添加官能化聚合颗粒并 且解育4小时。使用包含至少一种官能化表面的装置去除所述固体。在一些实施方案中， 使处理过的液体在进一步处理之前，经过包含带正电荷的接触表面的深度过滤器。
[0021] 在一些实施方案中，可用约0. 3%浓度的壬酸、或约0. 4%浓度的辛酸、或约0. 6% 浓度的庚酸替代约0. 2%癸酸。运掲示了污染物去除和抗体回收率对脂肪酸的浓度和疏水 性的依从性。实验数据掲示，脂肪酸的疏水性越高，实现良好结果所需的浓度越低，而且损 害IgG抗体回收率的浓度越低。应当理解，绝对浓度和相对浓度可随抗体不同而变化并且 具体脂肪酸的上述浓度可因此变化，但提供所述值是为了在评价先前未被表征的抗体的纯 化时，向本领域技术人员提供方便起点的指导。
[0022] 在一些实施方案中，约0.2%辛酸可支持比在更高浓度下更有效的聚集物去除。然 而，在约0.4%下，可实现游离抗体轻链、轻链二聚体和其它片段形式W及其它污染物的更 有效去除。因此，本领域技术人员将通过考虑在潜在的后续分级方法的背景下的给定脂肪 酸的作用来识别优化给定脂肪酸浓度的值。如果在本文所公开的方法之后进行特别适于去 除聚集物的方法，则优化脂肪酸浓度W去除抗体片段可能有益。如果在本文所公开的方法 之后将要进行特别适于去除片段的方法，则优化脂肪酸浓度W去除聚集物可能有益。
[0023] 在一些实施方案中，可在脂肪酸之后添加尿囊素。在另一相关实施方案中，直到已 形成沉淀物之后才添加尿囊素。在另一实施方案中，直到已去除沉淀物之后才添加尿囊素。 在此类实施方案的一个具体实施例中，尿囊素和官能化固体可在已去除沉淀物之后添加， 并且随后在第二固体-去除步骤中一起被去除。在一些实施方案中，省略尿囊素。
[0024] 在一些实施方案中，非离子型表面活性剂或两性离子型表面活性剂可W低于其临 界胶束浓度的浓度被添加到混合物中。实验数据表明运改善了抗体片段的去除，而高于临 界胶束浓度的表面活性剂浓度抑制抗体片段的去除，虽然有增加抗体回收率的补偿益处。 在一些实施方案中，显著更高的浓度的非离子型表面活性剂或两性离子型表面活性剂可显 著地损害酸性宿主细胞蛋白质的降低。
[00巧]在一些实施方案中，低浓度的阳离子型表面活性剂可显著增强宿主蛋白质和DNA的去除。在一些此类实施方案中，阳离子型表面活性剂为十六烷基Ξ甲基漠化锭，也被称为 嫁蜡基Ξ甲基漠化锭（CTAB);或十二烷基Ξ甲基漠化锭；或癸基Ξ甲基漠化锭；或肉豆違 基Ξ甲基漠化锭；或十八烷基Ξ甲基漠化锭、或具有不同