阳离子交换色 谱的进一步纯化。当在通过离屯、和/或微滤进行细胞收获物澄清后施加时，阳离子交换通 常实现5, 000-15, 00(K)ppm的宿主蛋白质水平。至少两个另外的色谱步骤通常用于实现低 于10化pm的水平。在阳离子交换之前进行所公开的方法允许阳离子交换步骤实现4.化pm 的宿主蛋白质水平并且将聚集物降低到0.68%。在50mM化is(pH8. 25)中进行的呈空隙 排阻模式的阴离子交换的单个后续改进步骤将宿主蛋白质降低到小于Ippm并且将聚集物 降低到0.53%。或者，Captoa化ere色谱的最终改进步骤将宿主蛋白质污染降低到小于 Ippm并且将聚集物降低到小于0. 05%，在所述改进步骤中，用1.0M化化、50mMHepes(pH 7. 0)将柱平衡，装柱，用同一缓冲液洗涂，然后用至300mM化Cl、50mM胎pes(pH7. 0)的线 性梯度将其洗脱。
[0122] 实施例7.通过抗体沉淀、之后进行阴离子交换色谱实现增强的性能。使如实施 例4中所述通过用尿囊素、辛酸和混合的颗粒处理制备的样品进行通过混合模式沉淀步骤 的进一步纯化，所述沉淀步骤最初如实施例3中所述利用PEG进行，之后转变为2. 0硫酸锭 (pH7.0)进行。使IgG再溶并进行测试，掲示5. 9ppm的宿主细胞蛋白质。聚集物低于检 测水平（小于0.05%)。在50mMTris(pH8.25)中进行的呈空隙排阻模式的阴离子交换 的单个后续改进步骤将宿主蛋白质降低到小于Ippm。该结果是重要的，因为它强调了所公 开的方法提供W下基础的能力：相比于基于所有方法中所知的最高性能的分级方法：蛋白 A亲和色谱的工艺，允许廉价的低功能分级方法实现更好的总体纯化性能。
[0123] 实施例8.用TREN颗粒替代多种混合的颗粒物质。将0. 5 %辛酸添加到未经任何预 处理的细胞培养收获物中。运产生了约5. 3的抑。将混合物连续揽拌2小时。然后W1% 添加尿囊素并将其解育15min。W5%v/v的比例添加TREN颗粒（WoriAeadsTREN40hi曲） 并将其在室溫下解育过夜。使一半体积经过如上所述的深度过滤器W去除固体。使另一半 经过0.22μm微滤器。微滤形式产生含有比收获物少100倍的宿主蛋白质（l，758ppm相对 于176, 244卵m)、3. 03%到0. 83%的聚集物和11. 8%到1. 23%的抗体片段的材料，抗体回 收率为90%。深度过滤形式将宿主蛋白质降低到135ppm且将聚集物降低到小于0.01%， 抗体回收率为85%。
[0124] 实施例9.颗粒解育时间。平行于实施例8进行一系列实验。将用TREN颗粒的解 育时间减少到4小时或6小时产生了与过夜（16小时）解育大致相同的结果。将解育时间 减少到1小时或2小时实现了低劣结果。
[0125] 实施例10.通过浓缩/渗滤、之后进行阴离子交换色谱对处理过的收获物进行IgG 纯化。切向流过滤通常用于浓缩和渗滤工艺溶液，但其并不被认为是纯化步骤，因为其能力 被认为太过有限。通过切向流过滤将来自实施例8的用深度过滤处理的材料浓缩。宿主蛋 白质浓度降低到20ppm。聚集物保持为0%。通过如实施例6中所述的呈空隙排阻模式的 阴离子交换将该材料改进。宿主蛋白质降低到低于可检测性水平（小于十亿分之60)。聚 集物不可检测。抗体轻链片段和重链片段不可检测。运强调了所公开的方法使得另一所知 的低功能分级技术能够实现比基于通常所实施的蛋白A色谱的工艺更高纯度的能力。
[0126] 实施例11.通过沉淀和阴离子交换色谱进行IgG纯化。通过实施例7中的沉淀方 法将来自实施例8的用深度过滤处理的材料浓缩，然后通过实施例6中的阴离子交换方法 浓缩。沉淀步骤将宿主蛋白质浓度降低到小于Ippm，且在阴离子交换之后，低于可检测性水 平（小于十亿分之60)。聚集物不可检测。抗体轻链片段和重链片段不可检测。运强调了 所公开的方法使得另一所知的低功能分级技术能够实现比基于通常所实施的蛋白A的工 艺更高纯度的能力。
[0127]实施例12.通过蛋白A亲和色谱和阴离子交换色谱来增强IgG纯化。通过如实施 例6中的蛋白A亲和步骤和阴离子交换步骤将来自实施例8的用深度过滤处理的材料分 级。蛋白A步骤将宿主蛋白质浓度降低到小于Ippm，且在阴离子交换之后，低于可检测性水 平（小于十亿分之60)。聚集物不可检测。抗体轻链片段和重链片段不可检测。本实施例 强调了所公开的方法将高功能纯化方法的性能增强超过100倍的能力。
[012引实施例13.所公开方法作为中间纯化步骤。进行实验对照，其中通过如实施例7中 所述的沉淀将通过离屯、和微滤澄清的细胞培养收获物分级。运将宿主蛋白质从287, 655ppm 降低到67, 687ppm，将聚集物从2. 83 %降低到1. 57%，并且将抗体片段从10. 4 %降低到 2. 3%。呈空隙排阻模式的后续阴离子交换步骤将宿主蛋白质从99. 6%降低到221ppm并且 将聚集物降低到1. 45%。将该实验对照与如下工艺进行比较：其中沉淀步骤之后，用0. 4% 辛酸、1 %尿囊素和5%TREN-官能化颗粒进行处理。在解育6小时之后，通过深度过滤去除 固体。将宿主蛋白质污染降低到21ppm并且将聚集物降低到低于可检测性水平。通过如实 施例6中所述的阴离子交换色谱将该材料分级。将宿主蛋白质污染降低到低于检测限。因 此使用所公开的方法作为中间步骤将最终产物的纯度增加了大于200倍。
[0129] 实施例14.癸酸的合格性（如alification)W及硫酸锭沉淀、阴离子交换色谱纯 化工艺的使能性（en油lement)。用0.2%癸酸、l%尿囊素和5%TREN颗粒处理细胞培养上 清液。在37'^过夜解育之后，通过在SartoriusPC-1过滤器上进行深度过滤来去除固体。然 后通过用50mM憐酸盐（pH7.0)中的2. 0M硫酸锭进行沉淀将滤液纯化，然后通过如实施例 6中所述的呈空隙排阻模式的阴离子交换色谱的最终改进步骤将滤液纯化。通过癸酸-尿 囊素-颗粒处理将宿主蛋白质从287, 655ppm的初始水平降低到987ppm，然后通过硫酸锭沉 淀降低到76ppm，并且通过阴离子交换降低到小于Ippm。癸酸-尿囊素-颗粒步骤将聚集 物降低到低于检测水平。癸酸-颗粒步骤将抗体轻链和重链片段从10. 4%降低到0. 6%， 并且在硫酸锭沉淀之后降低到低于可检测性水平。运提供了另一示例，其中所公开的方法 使得所知的低功能硫酸锭沉淀步骤实现比通常用通过物理手段澄清的收获物加载的蛋白A 亲和色谱的所知高功能替代方案更好的纯化。
[0130]实施例15.癸酸浓缩的评估。W0. 1 %癸酸、0. 4%癸酸和0. 6%癸酸的实施例14 进行平行实验。0.1%不支持相当的纯化。0.4%和0.6%引起过度的抗体损失。利用1% 癸酸进行的实验使几乎所有抗体与污染物沉淀。
[0131] 实施例16.在有尿囊素和没有尿囊素的情况下对不同辛酸浓度的评估。通过离屯、 和穿过0. 22微米膜的膜过滤将含细胞的收获物澄清，然后将上清液的抑降低到6. 0。用 0. 01%、0. 05%和0. 1%的量的辛酸处理各亚样品。所有样品在处理之后都是混浊的，表明 即使在通过离屯、去除沉淀的材料之后，也持续存在或重新形成了微粒。在2%尿囊素存在下 重复同一系列的实验。抗体回收率和污染物的降低基本上是等同的，但处理过的材料在处 理之后是明亮清澈的。本实施例说明尿囊素对于作为整体的所公开方法的性能的贡献。
[0132] 实施例17.通过添加尿囊素实现哺乳动物细胞收获物的加速澄清。将尿囊素添加 至1%的最终浓度，添加到化含有通常的污染物谱中的IgM单克隆抗体的含细胞的细胞培 养收获物中。将容器轻轻地满旋W混合组分。尿囊素与未知的细胞培养组分之间的相互作 用使该量的尿囊素完全溶解，因此添加额外的1%，使总的添加量达到2% (w/v)。将容器再 次满旋W混合组分。尽管微粒材料已被观察到在添加尿囊素之前非常缓慢地沉降，并且在 1%尿囊素存在下仅稍微更快，但2%尿囊素使沉降速率明显加速，且在约20分钟的时期内 使细胞培养上清液明亮清澈。1%尿囊素与2%尿囊素之间的差异被解释为表明1%尿囊素 由于在样品中存在一些溶解性物质而几乎被完全溶解。随后倾析上清液。运使一部分沉淀 物不经意地再悬浮，随后将所述沉淀物离屯、W使剩余固体沉降。运强调了尿囊素独立于脂 肪酸或其它添加剂改善细胞收获物澄清的质量的能力。它还强调了利用至少2%的尿囊素 浓度进行初始试验的潜在益处。它进一步强调了W下重要观点：尿囊素的溶解度可受样品 的组分影响，具有可通过实验确定尿囊素的过饱和浓度的作用，虽然其在水中的已知溶解 度可提供有用的初步指导。
[0133] 实施例18.通过添加尿囊素对大肠杆菌巧.coli)溶解物的澄清。利用微型流化器 W16, 000Xg将于250血50mM胎pes(pH7.0)中的20克大肠杆菌糊状物均质化。然后将 均质物W15,OOOXg离屯、1小时，W去除最大的微粒物质。运产生了褐色混浊上清液。将 无水尿囊素直接添加到上清液中，至5%w/v的最终浓度。将混合物满旋约1分钟，然后沉 降。不溶性材料在数分钟内沉降，留下明亮清澈的上清液，所述上清液含有超过90 %的存在 于原有均质物中的蛋白质产物。所述上清液容易地通过0. 22微米膜过滤器，其中尿囊素处 理之前的上清液在接触时实际上堵塞了所述过滤器。本实施例强调了尿囊素显著地改善处 理过的样品的过滤性的能力并且强调了尿囊素对作为整体的所述方法的性能的独立贡献。 它还说明所公开的方法不限于由哺乳动物细胞培养生长的抗体。
[0134] 实施例19.使用尿囊素实现的从IgG-内毒素混合物的抗体回收率和内毒素降低。 将内毒素添加到Img/mL人IgG(在5mM肥阳S、100mM化C1(pH7. 0)中）中，至22, 000抓/ ml。将2% (w/v)尿囊素添加到该混合物的等分试样中并且在室溫下混合15分钟。通过离 屯、将悬浮液澄清。测量蛋白质和内毒素浓度W计算抗体回收率和内毒素去除。2% (w/v) 尿囊素W两倍降低内毒素降低。尿囊素的量不影响抗体回收率。在随后系列的实验中，尿 囊素的量W高达10%的增量增加。10%尿囊素使抗体回收率逐渐降低到约93%，而内毒素 去除效率增加到约99%。运些实验说明使用更大量的尿囊素可导致IgG的损失。利用尺寸 在约12kDa到IMDa范围的蛋白质进行的另外实验表明如下的明确趋势：蛋白质的损失随蛋 白质尺寸的增加而增加。本实施例说明尿囊素增强作为整体的所公开方法的性能的能力。 [013引实施例20.通过添加10 %的量的尿囊素使每毫升小鼠细小病毒含有101°个粒子 的病毒培养物在生理条件下共沉淀。上清液的感染性测试证明去除了 99. 9%的病毒。通过 添加10%的量的尿囊素使每毫升鼠类白血病病毒含有101°个粒子的另一病毒培养物在生 理条件下共沉淀。上清液的感染性测试证明去除了 99. 9%的病毒。本实施例说明尿囊素对 于作为整体的所公开方法的独立贡献。
[0136]实施例21.使利用添加至20mS/cm电导率的化C1的澄清的IgM细胞培养收获物 通过填充于柱中的TREN颗粒。IgM回收率为98%。组蛋白和一般宿主蛋白质的去除为约 35%。DNA去除为99%。高分子量聚集物从19. 4%降低到1.3%。本实施例说明TREN颗 粒对于作为整体的所公开方法的独立贡献。
[0137] 实施例22.使通过离屯、和微滤澄清的抗-HER2IgG细胞培养收获物通过填充于柱 中的TREN颗粒，其中TREN颗粒的体积为所施加的细胞培养收获物的体积的2%。流动速 率为200cm/虹。所述处理将聚集物从20. 4%降低到小于3. 2%。宿主蛋白质污染降低了 58%。本实施例说明TREN颗粒对于作为整体的所公开方法的独立贡献。
[0138] 实施例23.使通过离屯、和微滤澄清的抗-HER2IgG细胞培养收获物通过用与实施 例1相同的颗粒混合物填充的柱，其中所述颗粒的体积为所施加的细胞培养收获物的体积 的2%。流动速率为200cm/虹。所述处理将聚集物从17. 4%降低到小于4%。宿主蛋白质 污染降低了 42%。本实施例说明混合的官能化颗粒对于作为整体的所公开方法的独立贡 献。
[0139] 实施例24. TREN和亚氨基二乙酸官能性的金属去除选择性的比较。使通过离屯、和 微滤澄清的细胞培养收获物经过TREN-官能化琼脂糖聚合物微球体柱或化elex-100柱。表 1中的结果显示化elex对于巧和儀显著更有效。二者对于铜、儘、儀、铅和锋类似地有效。 TREN对于侣和铁显著更有效。
[0140] 表1.ICP-0ES金属分析。所有值均W ppm表示。nd=未检测到。
[0141]
[0142] 实施例25.来自细胞培养收获物的单克隆IgG的整合纯化。将含细胞的抗-HER2 细胞培养收获物与2%的最终浓度的尿囊素和0. 2%的最终浓度的辛酸组合，然后解育2小 时。将TREN-官能化颗粒添加到5%的最终比例，并且将混合物解育额外4小时。通过离屯、 去除沉淀物并且将上清液与化elex-100颗粒和Dowex AGlx2颗粒的相等混合物组合，其中 所述组合的最终比例为2%。在1小时解育后，将混合物施加到阴离子交换深度过滤器中W 去除所述颗粒。随后在使用孔隙度等同于约50kDa的球形蛋白质尺寸的膜的切向流超滤系 统中将滤液浓缩，并且针对1M化C1、1M山梨糖醇、20mM邸TA、50mM憐酸盐（pH 7. 2)的缓冲 液进行渗滤。在浓缩到每升约20g IgG之后，通过阴离子交换色谱在W空隙排阻模式操作 的UNOsphere Q柱上处理渗余物。本实施例说明所公开的澄清方法使得工艺性能能够远远 超过当前方法的能力，尽管仅使用了所知的低功能纯化方法（超滤）和单个阴离子交换色 谱步骤。工艺结果总结于表2中。
[014引表2.工艺总结。肥P:宿主细胞蛋白质。肥P rdx :降低％。nd :未检测。
[0144]
[0145] 实施例26.脂肪酸与带相反电荷的固体之间的括抗作用。用1%尿囊素和0. 4% 辛酸处理通过离屯、和微滤澄清的细胞收获物，然后解育4小时。将所述材料分成3个等分 试样。用5%TREN颗粒处理第一个等分试样。运是所述系列的实验对照。用10%TREN 颗粒处理第二个等分试样。用5%TREN颗粒和2%DowexAG1X2颗粒处理第Ξ个等分试 样。如在运些条件下的其它实验中，与5%TREN的组合特别将游离轻链污染物降低到小于 0.1%。然而，在利用10%TREN和TREN加Dowex进行的实验中，游离轻链的量回升到超过 5%。运些结果表明所述固体材料从沉淀的轻链中去除了足量的辛酸，从而使得所述沉淀的 轻链恢复了溶解性且因此再次污染未沉淀的IgG。尤其值得注意的是，相比于TREN，更少量 的Dowex能够实现该结果。运与该特定形式的Dowex的已知强疏水性一致，所述强疏水性 应当会提升该特定形式的Dowex从辛酸-污染物沉淀物中竞争性地解离辛酸的有效性。
[0146] 实施例27.脂肪酸与带相反电荷的固体之间的括抗作用。用1%尿囊素和0. 4%辛 酸处理通过离屯、和微滤澄清的细胞收获物，然后解育4小时。将所述材料分成2个等分试 样。用5%TREN颗粒处理第一个等分试样。运是所述系列的实验对照。用5%TREN颗粒和 5%chelex200颗粒处理第二个等分试样。如在运些条件下的其它实验中，与5%TREN的 组合特别将游离轻链污染物降低到小于0. 1 %。然而，在利用TREN+化elex进行的实验中， 游离轻链的量回升到超过5%。运难W解释，因为TREN和chelex两者均为固相馨合剂，并 且化elex带负电荷，运意味着它应当不会与辛酸根离子直接相互作用，且因此应当对TREN 去除轻链的能力没有作用。运些结果表明，固相馨合剂在系统中的作用可能不是通过金属 结合介导，而是通过此类配体的与金属结合相似但不同的化学特征介导。
[0147] 实施例28.改变的工艺顺序。用1 %尿囊素和0. 4%辛酸将抗-HER2细胞培养收 获物处理2小时，然后用5%TREN颗粒处理4小时。通过离屯、去除固体并且使上清液经过 阴离子交换深度过滤器（SartoriusDC-1)。宿主细胞蛋白质污染降低到531ppm。聚集物 降低到小于0.1%。过量的游离轻链降低到小于1%。在相关的实验中，用阴离子交换中空 纤维（Qyu-speed,As址i)代替深度过滤器。宿主蛋白质降低是等同的，至528卵m，但聚集物 降低到仅3. 7%。
[014引实施例29.DNA和脂肪酸的非交互性。辛酸沉淀已被描述为具有使DNA沉淀的能 力度rodsky等，见上文）。运没有意义，因为它们的相同负电荷应当会相互排斥。运是在如 下实验中确认的：其中将1毫克/毫升、2毫克/毫升、5毫克/毫升、10毫升的浓度的纯化 的DNA与0.4%辛酸在抑5. 2和生理电导率下组合2小时。处理之后的DNA浓度没有观 察到显著差异。运显示由其他人所描述的明显的DNA结合可归因于通过中间物质的间接结 合，根据Gan等（见上文）的研究，所述中间物质可能是核小体的组蛋白组分。
[0149] 实施例30.在不存在所公开的方法的特征的情况下通过辛酸沉淀实现的污染 物降低。进行实验W证明依靠辛酸的澄清性能的基线，W说明单独的辛酸与所公开的方 法之间的差异。所有试验W含IgG的细胞培养收获物进行，所述细胞培养收获物含有 259, 777ppm宿主蛋白质和总计为非聚集的IgG的约30%的聚集物。所有实验均在生理电 导率下进行。W0. 5抑单位间隔从3. 5到7. 0评估对宿主蛋白质、IgG回收率和聚集物含 量的作用。最高的宿主蛋白质降低是在抑3. 5下，但IgG回收率小于50%。最高的聚集物 去除是在抑4. 5下。最高的IgG回收率是在抑6. 5和7.0下，但宿主蛋白质和聚集物降 低较差。下表中给出完整结果。
[0150]
[015。 实施例31.抑对所公开的方法的作用。在5. 0、5. 5、6. 0、6. 5和7. 0的抑值下评估 还含有172, 038ppm宿主蛋白质和22%聚集物的含IgG的收获物，其中将1 %尿囊素和4% 辛酸添加到所述收获物中并且轻轻地混合，然后添加5% (v/v)BioWorksTRENhi曲颗粒并 且在通过离屯、和微滤去除固体之前混合4小时。结果显著优于实施例30,强调了所公开的 方法的优良性能。下表中给出完整结果。FLC是指游离轻链。
[0152]
[015引