固体从中经过的装置包含 选自由W下组成的组的多孔材料：多孔膜、整体柱（monolith)、织造材料、无定形的纤维材 料、晶体材料、大网状骨架上的水凝胶状材料、填充颗粒柱和其组合。
[0059] 在一个或多个前述实施方案中，本文所公开的方法进一步包括使所述溶液与安置 在装置中的化学官能化固体接触。
[0060] 在一个或多个前述实施方案中，通过沉降或离屯、之后沉降来去除在使细胞培养收 获物与至少一种脂肪酸接触之后存在或于分离步骤存在的固体材料。
[0061] 在一个或多个前述实施方案中，通过过滤来去除在使细胞培养收获物与至少一种 脂肪酸接触之后存在或于分离步骤存在的固体材料。在一些此类实施方案中，过滤包括膜 过滤或深度过滤。在一些此类实施方案中，膜过滤或深度过滤包含官能化的过滤膜。在一 些此类实施方案中，至少一种官能团为正电性的。在一些此类实施方案中，至少一种官能团 结合金属离子。
[0062] 在一个或多个前述实施方案中，第一接触步骤之前是IgG抗体的部分纯化。
[0063] 在一个或多个前述实施方案中，细胞培养收获物含有细胞。在一个或多个前述实 施方案中，细胞培养收获物不含细胞。
[0064] 在一个或多个前述实施方案中，至少一种脂肪酸包含一般结构式邸3(邸2)。〇)0出 在一些此类实施方案中，至少一种脂肪酸包含庚酸、或辛酸、或壬酸、或癸酸。在一些相关实 施方案中，脂肪酸可在脂肪酸链的任何位置含有单个双键。在一些此类实施方案中，含有双 键的脂肪酸为壬締酸。在一些此类实施方案中，脂肪酸为8-壬締酸。在一些实施方案中， 主碳链可为无支链的；在其它情况下为支链的。
[0065] 在一个或多个前述实施方案中，至少一种脂肪酸W选自由W下组成的组的范围的 浓度存在：（a)约0. 05%到约5%、化）约0. 1 %到约1. 0%、（C)约0. 2%到约0. 4%和（d) 约0.1%到约0.2%。在一些实施方案中，壬酸可在约0.25%到约0.50%的范围使用。在 一些实施方案中，壬締酸可在约0. 2%到0. 4%的范围使用。
[0066] 在一个或多个前述实施方案中，阳离子型表面活性剂可W下述浓度存在：(a)约 0. 001%到 0. 1%、化）约 0. 005%到 0. 05%、（C)约 0. 0125%到 0. 025%。在一个或多个前 述实施方案中，阳离子型表面活性剂可为嫁蜡基Ξ甲基漠化锭。
[0067] 在一个或多个前述实施方案中，疏水阳离子组分可在性质上为芳香族的，例如苯 扎氯锭、或氯己定、或阿来西定（alexidine)。在一个此类实施方案中，氯己定的浓度可 在W下范围：（a)约 0.001 % 到 0.01 %、化）约 0.005 % 到 0.05 %、（C)约 0.0075 % 到约 0. 0125%。
[0068] 在一个或多个前述实施方案中，一种或多种官能化固体或可溶性基底包含选自组 由阴离子型、阳离子型或两性离子型组成的组的至少一种电荷配置。在一个或多个前述实 施方案中，一种或多种官能化固体或可溶性基底包含一种具有金属结合官能团的物质和为 阳离子型的不同物质。在一个或多个前述实施方案中，金属结合官能团为阳离子型的。
[0069] 在一个或多个前述实施方案中，金属结合官能团选自由W下组成的组：Ξ(2-氨 乙基）胺、二亚乙基Ξ胺、Ξ亚乙基Ξ胺、四亚乙基五胺、聚丙締亚胺四胺、聚（酷胺基胺） (PAMAM)树状物、去铁胺、精氨酸、组氨酸、组胺、咪挫和其组合。
[0070] 在一个或多个前述实施方案中，金属结合官能团为式I化合物：
[0071]
[0072] 其中R在每次出现时独立地为氨或C1-C4烷基，前提是至少一个R为任选地经由 连接体与固体载体连接的位点；并且Χ、Υ和Z中的每一个独立地为（CH2)。，其中η为2到6 的整数，其中細2基团任选地被0或ΝΗ替代。在一个此类实施方案中，金属结合官能团为阳 离子馨合剂为Ξ(2-氨乙基）胺（TREN)。在其它实施方案中，根据式I的任何紧密的TREN 类似物均可用于本文所公开的方法中。式I涵盖了许多市售化合物，并且可通过本领域技 术人员常规使用的方法容易地制备其它合成的设计化合物。例如，式I的叔胺可通过依序 还原性胺化反应由伯胺制备。
[0073] 在一个或多个前述实施方案中，通过W下方式在固体表面上构造树状正电荷层： 例如通过还原性胺化而接连活化现有层，然后引入多价氨基物质，洗掉未结合的过量物质， 然后再次活化该表面等。例如在TREN的情况下，使初始TREN层共价连接到所述膜并且将 过量的洗掉。然后将结合的TREN活化，去除活化剂，并引入新鲜的TREN，其具有在最初固定 化的TREN的末端处的反应性氨基上添加TREN分子的作用，其具有使电荷场的深度实质上 加倍并且使带正电荷的基团数目增加为Ξ倍的作用。在洗掉未结合的TREN之后，可添加另 外的层。本领域技术人员将理解，许多试剂和化学方法可用于产生电荷或其它相互作用基 团的概念上等同的布置。
[0074] 在一个或多个前述实施方案中，一种或多种固体包含一种具有金属结合官能团的 固体和为阴离子型的不同固体。在一个或多个前述实施方案中，金属结合官能团为阴离子 型的。在一个或多个前述实施方案中，金属结合官能团选自由W下组成的组：亚氨基二乙 酸、次氮基乙酸、谷氨酸、天冬氨酸、氨基苯基憐酸盐和其组合。在一个或多个前述实施方案 中，阴离子型馨合剂为亚氨基二乙酸。
[00巧]在一个或多个前述实施方案中，一种或多种官能化固体或可溶性基底包含一种为 阳离子型的物质和为阴离子型的不同物质。
[0076] 在一些实施方案中，提供用于纯化IgG抗体的方法，其包括使细胞培养收获物与 具有8到10个碳原子的至少一种脂肪酸接触W形成混合物，使所述混合物与尿囊素接触； 并且在使所述混合物与尿囊素接触之后分离固体材料，W提供包含IgG抗体的溶液。
[0077] 在一些此类实施方案中，所述方法进一步包括使所述溶液与至少一种化学官能化 固体或可溶性物质接触。在一些实施方案中，至少一种化学官能化固体或可溶性物质包括 Ξ(2-氨乙基）胺。
[0078] 在一个或多个前述实施方案中，尿囊素W选自由W下组成的组的范围的浓度存 在：（a)约0.6%到约30%、化）约1 %到约10%和（C)约1 %到约2%。在一个或多个前述 实施方案中，尿囊素在非零量到高达约0. 6 %的范围。
[0079] 在一些实施方案中，将所述方法应用于天然来源（例如血清或血浆）的单克隆IgG 抗体或多克隆IgG抗体。在一些实施方案中，将所述方法应用于酶促或重组来源（例如F油、F(ab')2或ScFv)的片段免疫球蛋白构造体。
[0080] 在一些实施方案中，提供了有助于实施本文所公开的任一种方法的试剂盒。
[0081] 对W下术语进行了定义，使得可更容易地理解本发明。另外的定义在整个具体实 施方式中有陈述。
[0082] "脂肪酸"是指由被簇基封端的线性脂肪族链组成的有机分子，其具有邸3(邸2) cCOOH的一般结构式，其中η为至少1的整数。对于适于实施本发明方法的脂肪酸来说，"n" 可为至少4到高达12的整数。适于实施方法的饱和脂肪酸的具体示例特别包括庚酸（C7)、 辛酸（C8)、壬酸（C9)和癸酸（CIO)。术语脂肪酸还可指含有一个双键或更大数目（例如2 个、3个、4个、5个等）的双键的不饱和脂肪酸，所述双键可出现于沿主碳链的任何位置。
[0083] "尿囊素"是指结构式为〔4&Ν403且IUPAC名称为2, 5-二氧代-4-咪挫烷基脈的 经尿酸氧化产生的嚷岭代谢物。
[0084] "TREPT是指Ξ(2-氨乙基）胺。特别已知该正电性化合物体现对金属离子的强亲 和力。其可化学附着到各种可溶性材料和不溶性材料W使那些材料具有由TREN介导的化 学特性。
[0085] 在本发明上下文中，"细胞培养"是指出于产生IgG单克隆抗体的目的在液体培养 基中培育细胞。用于该目的的细胞通常包括中国仓鼠卵巢（CH0)细胞，但可包括来自其它 哺乳动物的细胞类型，W及非哺乳动物的动物细胞、植物和微生物。在所有情况下，液体培 养基含有营养物W支持细胞生长。
[0086] "生物反应器"是指细胞在其内在受控条件下生长的容器。容器可包括不诱钢罐、 或其它材料的罐、或包覆材料罐（linedtank)、或聚合物袋，其尺寸适于生长产生目标量的 期望抗体所需的数目的细胞；装配有传感器和输入端，W允许监测关键工艺参数和根据需 要进行调节W维持用于细胞生长和抗体产生的理想条件。
[0087] "收获物"或"细胞培养收获物"通常是指生物反应器在细胞培养过程终止时的内 容物。除了产生的IgG之外，收获物最初还将含有细胞、细胞分泌物和死细胞的排出内容 物，W及所述细胞最初在其中生长的营养培养基的内容物。运些非抗体组分构成了将要从 抗体中去除的污染物。特别包括宿主蛋白质和DNA，但还可包括病毒和内毒素。细胞培养收 获物也常常含有错误装配形式或受损形式的呈片段形式的抗体。
[008引"澄清的细胞培养收获物"是指已从其中去除细胞的收获物。澄清工艺合计不过是 离屯、、或微滤、或运两种的组合，W去除固体，或其可包括使用化学添加剂或带化学交互作 用表面的固体材料W从收获物中提取特定类别的可溶性污染物。
[0089]"官能化固体"或"一种或多种固体"是指呈W下物理形式的化学相互作用固体： 颗粒；膜；整体柱块材料；长丝或纤维；无定形烙块、织造烙块或晶体烙块；凝胶或任何复合 构造或此类物理形式的组合，包括体现一个或多个此类形式的装置，所述形式装置被配置 成支持固体的保留持而允许液体经通过所述装置。术语官能化的自身被理解为表明基础本 材料出于带有使得能够实施所公开的方法的相互作用化学实体的特定目的地而W被合成 的方式被修饰。虽然具有化学相互作用表面的未溶解的尿囊素晶体可存在于各种实施方案 中，但应当理解，尿囊素并不被包括在"官能化固体"所意指的范围内，因为并不需要对该天 然材料进行修改W使其官能化。相同的概念框架适用于官能化的可溶性基底，其可与官能 化固体基底互换或组合使用。可溶性基底在官能化之前可具有天然或合成来源，并且具有 数百道尔顿（D)到超过100, 000D的范围的尺寸。
[0090] "蛋白质"是指含有碳、氨、氧、氮且通常含有硫并且主要由一条或多条通过肤键连 接的氨基酸链构成的任何一组复杂有机大分子。蛋白质可为天然或重组来源的。可用非氨 基酸部分对蛋白质进行修饰，例如通过糖基化、聚乙二醇化或与其它化学部分缀合来修饰。 蛋白质的示例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肤激素。
[0091] "宿主污染物"或"宿主细胞污染物"是指目标产物生长于其中的细胞所产生的生 物分子。所述术语可包括各种类别的宿主污染物，例如宿主蛋白质和宿主DNA。
[0092] "宿主蛋白质"或"宿主细胞蛋白质"或"HCP"是指目标产物生长于其中的细胞所 产生的蛋白质。此类蛋白质表示将要从目标产物中去除的一种类别的污染物。
[0093] "抗体"是源于人或其它哺乳动物细胞系的IgG、IgM、IgA、I曲或I姐类别的指免 疫球蛋白，包括天然形式或遗传修饰形式，例如人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、 合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体和体外产生的抗体。所述抗体可通过单 一克隆产生，在运种情况下，它们被称为单克隆抗体；或从超过一种的克隆产生，在运种情 况下，它们被称为多克隆抗体。IgG抗体特别是指一类被称为免疫球蛋白G的抗体，其还可 作为一种亚类或亚类的混合物存在，例如在人中作为IgGi、IgGz、IgGs或IgG4存在；或在小 鼠中作为IgGi、IgGzA、IgGze或IgG3存在；或在大鼠中作为IgG1、IgGzA、IgGze、IgGzc存在。在 真核宿主中天然或重组产生的抗体可W多种糖基化形式存在，而在非真核宿主中产生的抗 体可W多种糖基化形式和非糖基化形式存在。术语抗体还被理解为理解为包括不论酶促来 源还是蛋白水解来源的片段构造体，包括但不限于F油、F(油'）2、VHH和ScFv。
[0094] "内毒素"是指存在于革兰氏阴性细菌的外膜中的、裂解后从细胞释放的有毒的、 热稳定性的脂多糖物质。内毒素可由于它们的高含量的憐酸盐和簇基残基而通常为酸性 的，并且可由于脂质-A区域的脂肪酸含量而为高度疏水的。内毒素可为氨键合提供大量机 会。
[0095] "多核巧酸"是指由链中共价键结合的多个核巧酸单体构成的生物聚合物。DNA(脱 氧核糖核酸）和RNA(核糖核酸）是多核巧酸的示例。多核巧酸可具有形成氨键的高倾向 性。
[0096] "蛋白质制剂"是指任何含有目标蛋白质的水性或主要为水性的溶液，例如含有细 胞的细胞培养收获物、（基本上）无细胞的细胞培养物上清液或含有来自纯化阶段的目标 蛋白质的溶液。
[0097] "病毒"或"病毒粒子"是指仅在主要为细菌、植物和动物的活宿主的细胞内复制的 超显微的（直径大约为20nm至1] 300nm)、代谢惰性的传染原：其由RNA或DNA核、蛋白质外 壳（coat)和在更复杂的类型中的围绕的包膜构成。
[0098] 在针对特定细胞培养收获物定制本文所公开的方法时的有用起点是将无水尿囊 素添加到含有细胞或已被去除细胞的细胞培养收获物中，其中所添加的尿囊素总计1%w/ V。在所述添加期间维持混合。一部分尿囊素溶解，但另一部分保持不溶解。在水中，约 0.6%溶解且其余的保持不可溶，但在其中尿囊素与各种组分相互作用的复杂生物系统中， 该比例可改变。将壬酸添加到0.3%v/v的比例，并持续揽拌。或者，脂肪酸添加可发生在 添加尿囊素之前，或与尿囊素添加同时发生，但所建议的顺序似乎支持来自处理的抗体的 略高回收率。在一些情况下，不必调节抑，因为脂肪酸自身上的带负电荷的簇基将抑降低 到约5. 4。在其它情况下，或者如果使用脂肪酸盐，则应当将收获物的抑调节到约抑5.2。 无需调节电导率。将混合维持长达2小时或更长，此时引入带TREN的聚合物颗粒，其中颗 粒的比例可在2%v/v到5%v/v的范围。低于2%和高于5%的量倾向于往往有效性较 低。无需调节电导率和抑，但由于通过TREN颗粒清除了壬酸根离子，因此抑将自发地增 加。持续混合长达4小时或更长，然后终止。不同的混合方法、混合器和混合速度大体上相 关于效率而变化，且直接影响利用所公开的方法获得的结果的质量。因此，在明确最终方法 之前应当对它们进行系统地研究。在混合之后，任选地使固体沉淀，并通过任何便利的方法 (例如微滤或沉降）使液体澄清。澄清的液体可任选地借助于经过具有被正电荷占据的内 部液体-接触表面的装置被进一步处理。该步骤无需调节抑或电导率条件。可针对W下 方面的降低来评估处理过的材料：浊度、宿主细胞蛋白质、抗体聚集物、抗体片段、DNA、组蛋 白、核小体、病毒、内毒素或可能与特定纯化目标有关的其它污染物。
[0099] 在一些实施方案中，脂肪酸可W它们的酸性离子形式被引入收获物中。当W酸性 形式被引入时，可能不必调节收获物的抑，因为脂肪酸自身可将工作抑滴定到合适的值。 可将抑通常调节到抑4. 0到6. 0的范围，但更理想地，4. 5到5. 5、或4. 8到5. 2的范围、 或5. 2。更高酸性的条件通常支持更好的污染物去除，但更低酸性的条件通常有利于更高的 IgG回收率。一般来说，所公开的方法支持在比传统进行的脂肪酸沉淀更高的抑值下的良 好结果。将认识到，避免极端抑可降低施加于抗体的化学压力，并且可W功能抗体的更高 回收率和/或改善的抗体稳定性的形式提供次要益处。因此，按常规评估例如4. 5到5. 5的 中度抑值通常有益，尽管在利用脂肪酸进行沉淀的技术领域内通常实施相反程序。即使在 不严格要求预先进行抑滴定的情况下，预先进行抑滴定仍然可能是审慎的，因为它可W提 高所述方法的可再现性。在其它实施方案中，脂肪酸可作为盐被引入，所述盐例如辛酸钢、 或壬酸钢、或癸酸钢；或辛酸钟、或壬酸钟、或癸酸钟；或其它盐，例如与钟阳离子的盐。当 作为盐被引入时，将有必要通过添加适当的滴定剂来调节工作溶液的pH，W实现期望的工 作pH，因为所述盐的制剂有效地中止了组成离子的滴定能力。合适的滴定剂可由预先滴定 到目标工作抑或接近目标工作抑的酸或浓缩缓冲液组成。初步比较表明游离酸形式支持 相比于脂肪酸盐更有效的污染物去除。
[0100] 实验数据表明，在一些实施方案中，尤其对于聚集物的去除来说，癸酸比辛酸更为 有效，然而，显然由于其疏水性更高（由于其10原子碳链），因此其还设及更高的抗体损 失风险，有时导致源于相对微小的环境溫度变化的更低的回收率或不稳定结果。到目前为 止的实验发现表明，在类似背景下，癸酸的有效浓度范围为辛酸的浓度的约一半。运表明 0.2%癸酸为开始实验的一种合适浓度。其它实验数据表明，壬酸（9-碳）相比于辛酸或癸 酸提供了疏水性与电荷的更有利平衡，并且支持更有效的宿主蛋白质降低。其它实验结果 表明，8-壬締酸，即在脂肪酸链的末端具有单个双键的9-碳脂肪酸，也支持优于辛酸或癸 酸的结果。
[0101] 在一些实施方案中，官能化固体也可在它们被添加到收获物中之前被平衡至特定 的抑值。此类调节可通过用具有目标抑的含有约lOOmM化C1的缓冲液洗涂所述固体来 实现。然后可抽吸被平衡的固体W去除过量的液体，使得它们可作为湿饼被添加到收获物 中。实验可有益于确定用于给定的纯化的最适当的平衡抑和电导率。在一个实施方案中， 可在第一实验中用20mM乙酸盐、lOOmM化Cl将所述固体预先平衡到约5. 1到5. 3、或5. 15 到5. 25、或5. 2的抑。可在后续实验中评估更高和更低的抑值和电导率值。
[0102] 在一些实施方案中，官能化可溶性基底也可在它们被添加到收获物中之前被平衡 至特定的抑值。此类调节可通过将酸或碱添加到期望基底的液体浓缩物中来实现。适度 实验可有益于确定用于给定的纯化的最适当的平衡抑和电导率。在一个实施方案中，可在 第一实验中用20mM乙酸盐、lOOmM化C1将可溶性基底预先平衡到约5. 1到5. 3、或5. 15到 5. 25、或5. 2的抑。可在后续实验中评估更高和更低的抑值和电导率值。
[0103] 通常值得的是评估每个变量的值范围W确定用于特定纯化的最有效配置。可W更 小比例（例如1% )或更高比例（例如2%、3%、4%、5%或中间增量）来评估尿囊素浓度。 实验数据表明，低于1%时，