术人员将能够使用常规实验 确定各测定之操作性及最佳分析条件。
[0134] 本发明之另一方面设及用于检测或测量PPV5A之诊断试剂盒。提供用于诊断用途 之试剂盒，其在一或多个容器中包含抗PPV5A抗体，及可选地针对抗体之经标记之结合搭 配物。或者，抗PPV5A抗体可经标记（使用可检测标记，例如化学发光、酶、巧光或放射性部 分）。因此，本发明提供诊断试剂盒，其包含抗PPV5A抗体及对照免疫球蛋白。在一特定实 施例中，容器中之一种上述化合物可W可检测方式经标记。试剂盒可W可选地进一步在容 器中包含预定量之由试剂盒之抗体识别之PPV5A病毒、蛋白质或肤，W用作标准物或对照 物。 巧]比施用对象
[0136] 施用途径包括（但不限于）鼻内、经口（例如于饮用水中）、皮内及肌肉内。肌肉 内施用尤其较佳。本领域技术人员将认识到，本发明之组合物亦可W-次、两次或两次W上 剂量施用W及藉由其它施用途径施用。举例而言，该等其它途径包括皮下、皮内、静脉内、血 管内、动脉内、腹膜内、銷内、气管内、屯、内、小叶内、髓内、肺内及阴道内。视治疗之所需持续 时间及有效性而定，本发明之组合物可施用一次或数次，亦可间歇地施用，例如在数天、数 周或数月内每天及W不同剂量施用。 阳137] 包括W下实施例W说明本发明之较佳实施例。本领域技术人员应了解，W下实施 例中掲示之技术表示由发明者发现之在本发明实践中起良好作用之技术，且因此可视为构 成本发明实践之较佳模式。然而，根据本发明，本领域技术人员应了解，在不偏离本发明之 精神及范畴下，所掲示之特定实施例中可产生多种变化且仍然获得相似或类似结果。
[0138] 本申请案设及同一日期申请之标题为叩orcine Parvovirus 5B, Methods of Use and Vaccine"之申请案（代理人案号BIC-1153)，其内容W全文引用的方式并入本文中。 阳139] 实施例
[0140] 材料及方法 阳141] 材料来源：自罕见爆发调查接收来自Ξ只猪之组织匀浆。饲养场之临床病史为 200化猪患有全身肌肉颤动，其在静止时存在，但在运动期间增强。在兽医诊断实验室中进 行广泛测试，该实验室提示病毒因子（基于微观病变），但仅鉴定出因子X(与攝病毒相关之 非经典猪攝病毒），之后将样品提供至发明者W帮助确定该等动物中CNS病征之潜在起因。 阳14引 DNA及軍白质分析:值用夹自45化ifeSciences度ranfordCT) ( "454技术"）之 高通量测序进行来自受感染猪之样品的DNA分析，由化eron化untsvilleAL)进行。经由 病毒粒子保护核酸之核酸酶处理使样品富含病毒序列，接着进行提取、随机扩增及高通量 测序；通常如Victoria等人化oSpathogen2008年9月26日；4巧）：el000163中所描述 进行。
[0143] 最初由BLASTx分析将所得序列表征为细小病毒科（Parvoviridaefamily)之分 歧成员（divergentmember)。使用Sequencher软件装配序列且该等DNA分析之结果联合 目标测序会得到SEQIDNO: 1之DNA序列，其为命名为PPV5A的病毒之推定完全编码序列。 使用Sequencher软件进一步分析DNA序列，鉴定出Ξ个推定编码区，其对应于在其它细小 病毒种中发现之编码区，包含病毒复制酶（SEQIDN0:2)、开放阅读框架"0RF3"(SEQID NO:3)及病毒衣壳蛋白（SEQIDNO:4)。
[0144]连施例1:鉴定新颖病毒
[0145] 藉由454技术（病毒多源基因组学）鉴定来自不同状态之两只无关猪之肺匀浆之 样品中的DNA序列。BLAS化及BLASTx分析表明与猪细小病毒4最密切相同，其中复制酶基 因（RE巧之保守区域中存在67%核巧酸相同性最大值，而衣壳蛋白（CA巧编码区在核巧酸 层面上未呈现可辨别之匹配。在蛋白质层面上，推定之复制酶蛋白呈现约60%氨基酸相同 性且在衣壳蛋白中呈现约50%相同性。病毒表示为新型种，即猪细小病毒5A(PPV5A)。基 于衣壳蛋白编码序列研发特异性引物，且组织中类似之匀浆基于PCR之筛选及病理学/临 床特征表明约16%样品中存在因子。基于所报导之临床病征及与所筛选组织相关之病毒学 数据，观测到与若干其它病毒剂及临床病理学/组织病理学之统计学显著相关性。 阳14引 连施例2 :鉴定PPV5A为新颖细小病毒及系统发牛分析 阳147] 多种已知病毒种之推定之复制酶（R邸）及衣壳（VP1/CAP)蛋白之成对氨基酸相同 性展示于图5中。PPV5A序列与最密切相关之具有REP及CAP之PPV4之相同性（分别为约 60% /50% )支持将PPV5A指定为新型种。
[0148] 基于CAP蛋白质之保守区域，系统发生分析（图6)显示该病毒为细小病毒科及细 小病毒属中之新颖种。使用更保守的REP蛋白序列（未图示）得到类似结果。
[0149]连施例3 :确化PPV5A为巧病闲子
[0150] 使用来自ISU之Ξ种PPV5aPCR阳性组织匀浆对剖腹分娩之未喂食初乳（CDCD) 之动物进行接种，W尝试扩增病毒及确定新颖细小病毒与PRRSV之合并感染是否引起临床 呼吸病征增加。在此项研究中，用含有新颖细小病毒之组织匀浆接种之组中出现意外的高 死亡数（20% -22% )，且使用祀向衣壳蛋白编码区之PPV5A特异性PCR鉴定血清中高效价 之PPV5A。接着使用来自此项研究中之一只动物的组织攻击CDCD猪W再现临床病征。在此 项研究中，在大部分受感染动物中发现高效价病毒血症之全身感染。在接受含有PPV5A之 接种物的组中，死亡（20% )、贩行、平均每日增重降低、发热W及巨观及微观病变之发生率 较高。 阳巧1]连施例4 :PPV5A.培养、分离及纯化
[0152] 使用无菌研鉢及巧棒研磨PCR阳性组织（例如脾、脑、肺、肠等）之小切片。将经研 磨之组织再悬浮于5-lOml含有肥阳S缓冲液及抗生素之经改质EMEM中且使其澄清W消除 较大的组织块。收集上清液且连续通过各种过滤器W消除大部分较大粒子（包括细菌）。此 夕F，亦藉由连续过滤来处理来自PCR阳性动物之粪便样品悬浮液及血清W进行病毒分离。
[0153] 滤液之稀释物经膜蛋白酶处理或保持未经处理且在6孔板中在特定溫度下吸附 于建立的及原生细胞培养物（列举于下文中）上。抽出接种物且替换为2ml新鲜维持培养 基。板接着在5%C〇2氛围中在33°C-37°C下解育且每天观测与模拟（普通培养基）接种之 对照物相比之细胞病变效应，诸如细胞变圆、细胞-细胞融合、脱落、细胞丛集等。藉由PCR 筛选潜在阳性孔之病毒生长/分离。
[0154] 适用于病毒分离之建立的细胞系尤其包括：ST(猪睾丸）、SK6(猪肾脏）、 BHK-21(仓鼠仔肾脏）、VID0 R1(猪胎儿视网膜）、PK-15NADC(猪肾脏）、PK/WRL(猪肾脏）、 HRT-180(人类结肠直肠腺癌）、Hep2(人类上皮）、Vero(非洲绿猴肾脏）及RK-13(兔肾 脏）。
[01巧]适用于该过程之原生细胞培养物尤其包括：猪胚胎之肺、肾脏、睾丸、气管及肠培 养物。
[0156] 在分离病毒后，藉由多轮斑块纯化或限制稀释来纯化病毒且W较大量扩增病毒， 并且产生用于动物实验之储备培养物。 阳157] 连施例5:制备灭活病毒及巧巧 阳15引在约35°C至39°C之间且在2至15mMBEI存在下，更佳在约lOmMBEI存在下进行 灭活。灭活系进行至少24小时，多达24至72小时。接着添加等效量之中和溶液内之灭活 试剂的试剂；例如等效量之硫代硫酸钢。根据此项技术中已知之方法制备灭活病毒制剂，举 例而言，女曰Preuss,T.等人，ComparisonofTwoDifferentMethodsforInactivationof VirusesinSerum,CLINICALANDDIAGNOSTICLABORATORYIMMUNOLOGY, (1997),504-508 或Bahnemann,H.G. ,Inactivationofviralantigensforvaccinepreparation withparticularreferencetotheapplicationofbinaryethylenimine,VACCI 肥，（1990)，299-303中所掲示。一旦制备灭活病毒，则将材料与载体制剂组合W用于最终疫 苗调配。 阳1别 连施例6 :制备减毒病毒及巧巧 阳160]减毒病毒制剂系根据此项技术中已知之方法制备，举例而言，如Vaccine Protocols,第2版；Robinson, Husdon, Cranage编，Humana Press 2003中所掲不。举例而 言，"…野生型病毒在组织培养物/动物宿主中广泛继代直至毒性损失与免疫原性保持之 间达到可接受之平衡…"。 阳161] 藉由多轮斑块纯化或限制稀释来纯化减毒病毒。使用PCR分析法、深度测序或免 疫巧光分析法确定培养物质之特异性。 阳162] 藉由组合经纯化之减毒病毒制剂与载体制剂来制备减毒病毒疫苗。 阳16引连施例7:制备巧含发蒂帝白单仿巧巧 阳164] 藉由经克隆之SEQIDN0:4或其片段于多种蛋白质表达系统中之表达来制备SEQ IDN0:4之衣壳蛋白。 阳1化]巧状病毒表武:沈QIDN0:4之PPV5A衣壳蛋白于杆状病毒表达系统中表达，通常 根据Kost等人化)，2012中掲示之方法。在初始纯化时，在不可溶部分内发现少量蛋白质。 提高产率及溶解度之方法包括（但不限于）使用替代性缓冲条件（例如脈或盐酸脈）、替代 性结合及纯化条件（例如钻或儀亲和管柱、阴离子或阳离子交换管柱）或替代性表达条件 (例如溫度、时间、替代性细胞株）。
[0166] 细荫表武:沈Q IDNO:4之PPV5A衣壳蛋白于细菌表达系统中表达，通常根据EMD QiemicalsInc.NovagenUserProtocolTB184中掲不之方法。此方法包括添加细菌载体 中所含之固有HIS标签（EMD化emicalsInc. ,2011(7))W促进所产生之蛋白质之纯化。通 常根据GEHealthcare, 2012 (8)中掲示之方法纯化经细菌表达之HIS标记衣壳蛋白，且使 用所得产物如实施例8中所描述产生PPV5A特异性抗体。 阳167] 藉由组合经纯化之衣壳蛋白制剂与载体制剂来制备减毒亚单位疫苗。
[0168]连施例8:制备特择忡结合于PPV5A.杭体 阳169] 藉由使用PPV5A病毒之抗原性制剂或衣壳（SEQIDN0:4)蛋白或其片段之亚单位 蛋白制剂使兔免疫来制备特异性结合于PPV5A之抗体。针对结合于PPV5A抗原之多克隆抗 体筛选来自经接种之兔之血清样品。使来自经接种之小鼠且确定产生针对抗原之抗体之脾 与骨髓瘤细胞融合W产生杂交瘤。接着针对与PPV5A抗原之结合来筛选杂交瘤。 阳17日]《巧降抗体:在定制抗体制备服务公司（州stomantibodyproduction service)，使用根据实施例7制备之HIS标记之经细菌表达之衣壳蛋白使两只新西兰白兔 (NewZealand怖iter油bit)免疫（Rockland抗体及分析法（RocklandAntibodiesand Assays) ;Gi化ertsville，PA)。在D0、D7、D14及D28,使用每只兔约lOOyg抗原使兔免疫。 对于DO及D7接种，动物系皮内接种；在D14及D28进行之接种系皮下施用。在第一次接种 中使用完全弗氏佐剂（Complete化eund'sadjuvant);在后续接种中使用不完全弗氏佐剂 (incompleteRreud'sadjuvant)。在免疫之前W及在免疫后第38天及第45天收集来自 两只兔子之血清样品。 阳171]藉由Rockland抗体及分析法筛选抗PPV5A特异性之多克隆抗体制剂。藉由免疫 巧光分析法（IFA)、西方墨点法及酶联结免疫吸附剂分析法巧LISA)，产生对经纯化或部分 纯化之PPV5A蛋白质具有结合特异性之抗体。各分析法之特异性之参数如下：藉由检测预 测的88. 8kDa尺寸蛋白质来测量西方墨点法特异性，藉由与未感染之细胞相比来测量IFA 特异性且藉由用非相关蛋白涂布板来测量化ISA特异性。
[0172] 单巧陈杭体:在定制抗体制备服务公司（Rockland抗体及分析法； Gi化ertsville，PA)，使用根据实施例7制备之HIS标记之经杆状病毒表达之衣壳蛋白在 Ba化/c小鼠中产生单克隆抗体。根据由定制抗体制备设备设计之标准方案使用多种PPV5A 抗原性制剂使小鼠免疫。藉由定制抗体制备设备监测接种后之免疫反应，且选择用于产生 杂交瘤之抗体候选物。用于产生单克隆抗体之标准方案已为本领域技术人员所熟知，举例 而言，如G油；riele等人巧)，第117-135页中所掲不。
[0173] 藉由根据标准方案组合在杂交瘤培养基中培养至增殖期之B细胞肿瘤细胞与自 确定产生针对PPV5A抗原之抗体之经接种小鼠收集的脾细胞来产生杂交瘤，如G油riele等 人巧)，第117-135页中所掲示。在融合及培养杂交瘤后，针对与PPV5A抗原之结合筛选杂 交瘤，且选择产生抗PPV5A之杂交瘤。根据标准方案使用亲和层析纯化由杂交瘤产生之单 克隆抗体，如G油riele等人巧)，第209-232页中所掲示。
[0174] 使用此项技术中熟知的免疫学技术，例如化ISA、西方墨点分析及表位定位 (Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第 66卷(Glenn E. Morris编，1996)Humana Press, Totowa,化w Jersey)来鉴定对PPV5A具有特异性之高亲 和力抗体且进一步表征，包括确定其结合之表位、抗体关于其它相关病毒种之特异性，且选 择对PPV5A病毒抗原具有高特异性之适合的高亲和力抗体。 阳1巧]连施例9 :PPV5A.诊断分析法
[0176]ELISA分析法:使用ELISA程序，使用根据实施例8制备之抗体测量生物样品中之 PPV5A。分析