专利名称：：川芎挥发油在制备治疗皮肤瘢痕药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是川芎挥发油用于制备治疗皮肤瘢痕药物的新用途。
背景技术：
：瘢痕是创伤修复的必然产物，凡涉及真皮层的伤口几乎都以瘢痕愈合而告终。过度增生的瘢痕常会破坏人体表面的完整性或伴有各种程度的功能障碍，给病人带来精神和身体上的双重痛苦。皮肤瘢痕发病率高，但目前临床应用的药物或疗效不够理想，或副作用较多，或有效成分不明确难以大量推广应用。川尊(L/gws"cwmc/7waraa'o打gHort.)为伞开多禾斗丰直物，收载于《中华人民共和国药典》2005年版一部。本品为川芎干燥根茎，不规则结节状拳形团块，直径2-7cm，表面黄褐色，粗糙皱縮，有多数平行隆起的轮节，顶端有凹陷的类圆形茎痕，下侧轮节上有多数小瘤状根痕。质坚实，不易折断，断面黄白色或灰黄色，散有黄棕色的油室，形成层环呈波状，气浓香，味苦、辛、粗有麻舌感，味回甜。中药川芎为我国传统中药之一，被喻为"血中之气药"，具有活血行气、祛风止痛的功效。川芎含有的化学成分主要有内酯类、生物碱类、酚类、以及挥发油类等多种化合物(杨丽红,谢秀琼,万丽,王曙宾,詹珂.川芎化学成分硏究,时珍国医国药[J],2007:18(7)1576-1577.)。川芎挥发油为川芎的有效部位。主要成分是苯酞类化合物(LiHX,DingMY,YuJY.SeparationandidentificationofthephthalicanhydridederivativesofLiqusticumCh画xiongHortbyGC-MS,TLC，HPLC-DAD,andHPLC-MSJournalofchromatographicscience,2002;40(3):156-61)。藁本内酯是苯酞类化合物的典型代表，占挥发油总量的50%-80%，为挥发油的主要成分。其化学结构如下川芎挥发油具有改善微循环、降低血压、增加脑血流量及镇痛、调节心血管功能以及抗凝血等作用。研究发现川芎挥发油可使微血管解痉，增加毛细血管幵放数目，加快血流速度，使聚集的红细胞解聚，其中红细胞解聚作用尤为显著。(谢秀琼,詹珂,尹蓉莉,杨丽红.川,挥发油的研究进展[J].时珍国医国药，2007，18(6):1508-1509)。川芎挥发油有缓解偏头痛的作用(ChengPeng,XiaofangXie,LanWang,LiGuo,TanlianHu.PharmacodynamicactionandmechanismofvolatileoilfromR/n,20附aZigz^m/CTmawx〖o"gHort.ontreatingheadache.Phytomedicine2009,16:25-34.)，还具有解热作用，其解热机理与抑制环氧化酶(COX)活性，从而降低下丘脑前列腺素E2有关(杨金蓉,宋军,马晓文,李袓伦,胡荣.川芎挥发油对环氧化酶-2活性的选择性抑制作用[J].甘肃中医，2008，21(2))。此外川芎挥发油中的内酯类化合物还具有平滑肌解痉作用，对NA引起的血管收縮有解痉作用。(中国医学科学院药物研究所.中草药现代研究，第2巻[M].北京北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1996，6:423)。但是至今未见川穹挥发油用于治疗皮肤瘢痕方面的报道。
发明内容本发明为川芎挥发油提供一种治疗瘢痕的新用途。经人体皮肤瘢痕成纤维细胞体外实验和动物实验，发现川芎挥发油对皮肤瘢痕成纤维细胞具有明显的诱导凋亡作用，且对兔耳瘢痕治疗疗效显著，因而可用于制备治疗皮肤瘢痕的药物。图1为本发明川芎挥发油的GC-MS分析图谱图2为川芎挥发油对瘢痕成纤维细胞的活力影响3为川芎挥发油对瘢痕成纤维细胞乳酸脱氢酶活性4为川芎挥发油诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的流式二维点5为川芎挥发油抑制兔耳瘢痕增生的瘢痕指数图5规常压蒸馏得川芎挥发油2.5ml，用无水硫酸钠干燥后，取少量挥发油进行GC-MS分析，结果见图l。由图1可见，其主要化学成分为藁本内酯(67.027%)和3-丁烯基苯酞(5.831%)。川芎挥发油诱导人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞凋亡实验(一)试剂1.胎牛血清(FBSHyclone)2.磷酸缓冲液(PBSHyclone)3.二甲基亚砜(DMSOSigma)4.甲基四唑蓝(MTTAmresco)，用PBS配制成0.5o/。MTT5.0.25%胰酶(Sigma)6.DMEM细胞培养液(Sigma)7.细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物技术发展有限公司)8.瘢痕止痒软化膏(成都东洋百信制药有限公司，批准文号国药准字Z20050438)9.川芎挥发油溶液取上述制备的川芎挥发油溶于适量的二甲基亚砜后，用含10。/。FBS的DMEM细胞培养液稀释，使川芎挥发油的终浓度分别为25吗/ml,50昭/mU00吗/ml(DMSO含量均少于"/。)备用(二)制备人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞取16-30岁病人皮肤增生性瘢痕，在无菌条件下，去除表皮和皮下组织，生理盐水反复冲洗后剪切成0.5-1.0mn^的组织块，接种于一次性培养瓶壁上，组织块间距0.3-0.5mm，加入FBS适量，按常规在细胞培养箱内倒置培养2h后，加入含20y。FBS的DMEM培养液(含青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)5ml继续培养，每周换液2次。待原代细胞生长基本融合成片时，吸除培养液，PBS液漂洗2次后加入0.25%胰酶消化约1min，倒置显微镜下见胞质回縮、细胞间隙增大时，吸弃胰酶，加入含10MFBS的DMEM培养液终止消化，吸管轻轻吹打瓶壁细胞使呈细胞悬液，按1:3比例分装传代，使用第3-6代细胞进行以下实验。(三)川芎挥发油对瘢痕成纤维细胞活力影响实验MTT比色实验是一种检测细胞存活和生长的方法。酶联免疫检测仪所测得的光吸收值间接地反映了细胞活力。本实验分成4组，第l组为空白对照组，第2，3，4组分别为川芎挥发油低、中、高剂量组。取对数生长期的瘢痕成纤维细胞，用含10。/。FBS的DMEM培养液配制成5xl(^个/ml的细胞悬液，以每孔100pl分别接种于3块96孔培养板，置C02培养箱培养24h后，吸弃培养液，每块板的第2，3，4组分别加入上述配制的低、中、高三种不同浓度的川芎挥发油溶液ioow/孔，第l组空白对照组加等量的含10y。FBS的DMEM培养液，每组IO个平行孔，继续培养，3块板分别于12，24，48h，加入0.5。/。MTT2(^1染色，继续培养4h，吸弃培养液，每孔加DMS015(V1，振荡10-15min，自动酶联免疫分析仪测定吸光度A(波长570nm)，分别测得不同浓度川芎挥发油培养不同时间的细胞活力，(细胞活力=实验组吸收值/对照组吸收值)重复做三批细胞实验，结果见图2。由图2可见，在12，24，48h三个不同的时间点，川芎挥发油各剂量组与空白对照组相比，细胞活力均有下降，且呈明显的量效和时效关系。特别是中、高剂量组对成纤维细胞增殖抑制非常明显，与空白对照组相比有显著性差异。说明川芎挥发油能明显抑制瘢痕成纤维细胞的增殖。(四)川芎挥发油对增生性瘢痕成纤维细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响实验LDH是质膜完整性的标志，也是检测细胞死亡的指标，释放的LDH越多，LDH活性越高，说明细胞损伤越严重。本发明取药物作用24和48h的细胞培养液，自动生化分析仪分析。实验分成4组，第l组为空白对照组，第2，3，4组分别为川芎挥发油低、中、高剂量组。将对数生长期的人瘢痕成纤维细胞，用含10。/。FBS的DMEM培养液配制成5xl(^个/ml的细胞悬液，以每孑LlO(Hil分别接种于2块96孔培养板，置C02培养箱培养24h后，吸弃培养液，每块板按组分别加入上述配制的低、中、高三种不同浓度的川芎挥发油溶液10(^1/孔，空白对照组加等量的含10y。FBS的DMEM培养液，每个浓度10个平行孔，继续培养，2块板分别于24，48h，吸取培养液，自动生化分析仪分析LDH活性，重复做三批细胞实验，结果见图3。由图3可见，在24，48h不同的时间点，低剂量组与空白对照组相比，LDH活性无明显差异。而中、高剂量组使细胞膜通透性增加，乳酸脱氢酶释放，因此培养液中的LDH活性显著升高，和空白对照组比较均有显著性差异，且随作用浓度和时间的增加而增加，说明川芎挥发油能够促使瘢痕成纤增殖、细胞凋亡、细胞分化等。本实验分成4组，第l组为空白对照组，第2，3，4组分别为川芎挥发油低、中、高剂量组。将对数生长期的瘢痕成纤维细胞，用含10%FBS的DMEM培养液配制成1.5xl()S个/ml的细胞悬液，以每孔2ml分别接种于l块6孔培养板，置C02培养箱培养24h后，吸弃培养液，第2，3，4组分别加入上述配制的低、中、高三种不同浓度的川芎挥发油溶液2ml/孔，空白对照组加等量的含10MFBS的DMEM培养液，继续培养12h后，吸弃培养液，0.25%胰酶消化，1500rpm离心5min，PBS缓冲液洗涤2次，分别加入500pl的BindingBuffer悬浮细胞，加入AnnexinV-FITC和Propidiumlodide各5(11，混匀；室温避光反应5-15min，流式细胞仪分析细胞凋亡率。其凋亡二维点图可分为四个象限，左上为死亡细胞；左下为活细胞；右上为晚期凋亡和死亡细胞；右下为早期凋亡细胞；凋亡率为右上部分与右下部分凋亡和死亡细胞百分率之和，结果见图4。由图4可见，川芎挥发油作用12小时后，细胞凋亡明显，随给药浓度增加，凋亡率显著增加，中、高剂量组的凋亡率分别为36.42%和48.01%，凋亡率显著高于空白对照组。说明川芎挥发油能抑制瘢痕成纤维细胞的增殖且能诱导其凋亡。川芎挥发油对兔耳增生性瘢痕的抑制实验本实验分成5组(1)空白对照组，(2)川芎挥发油低剂量组，(3)川芎挥发油中剂量组，(4)川芎挥发油高剂量组，(5)阳性对照组上述药物均为膏剂，其第l-4组的药物组分及其重量百分比如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>第5组阳性对照药物为瘢痕止痒软化膏取新西兰兔5只，雌雄不拘，清洁级，兔龄3-4个月，体重2.2-2.6kg。由中国人民解放军第二军医大学实验动物中心提供。饲养室温度18-22°C，相对湿度60%-75%，人工混合饲料喂养。动物分笼适应性饲养3天后，按常规用药25%乌拉坦静注，麻醉。兔耳75%酒精消毒后，用圆形钻刀在兔耳腹侧面中线沿长轴避开血管两侧作直径为7mm的圆形切口，完整切除全层皮肤，去除软骨膜，保留软骨。每耳6处，间隔2cm。术后创面涂抹金霉素软膏防止感染。术后第7天，将60个瘢痕创面随机分成5组，即川芎油软膏高、中、低剂量组，阳性对照组和空白对照组，每组12个创面，分别外涂相应的药物软膏，并轻揉直到药物吸收。每天1次，每处瘢痕约50mg，连续30天。第31天，用游标卡尺测量兔耳瘢痕厚度和瘢痕边沿正常耳厚度，瘢痕指数=(瘢痕厚度+正常耳厚度)/正常耳厚度。测得各组瘢痕指数，进行比较，结果见图5。由图5可见，中、高剂量组药效明显，与空白对照组相比，兔耳瘢痕指数明显减小，具有显著性差异。特别是高剂量组，药效比阳性对照组还好。实验结果表明，川芎挥发油能显著抑制皮肤瘢痕成纤维细胞增殖和诱导其凋亡，能减小瘢痕指数，因此，可用于制备治疗皮肤瘢痕的药物。ii权利要求1.川芎挥发油在制备治疗皮肤瘢痕药物中的应用。全文摘要本发明涉及医药
技术领域：
，是川芎挥发油用于制备治疗皮肤瘢痕药物的新用途。经体外人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞凋亡实验和兔耳增生性瘢痕的抑制实验，川芎挥发油能显著抑制皮肤瘢痕细胞增殖和诱导其凋亡，并能减小瘢痕指数，因此，可用于制备治疗皮肤瘢痕的药物。川芎挥发油制备方法简便，价格低廉，本发明为皮肤瘢痕的治疗提供了新的药物来源。文档编号A61K36/236GK101664426SQ20091019739公开日2010年3月10日申请日期2009年10月20日优先权日2009年10月20日发明者吴建国,宏张,张巧艳,渐杜,秦路平,婷韩,魏艳洁,黄宝康申请人:中国人民解放军第二军医大学