S(pH 7.4)在4°C下进行24小 时透析。从透析膜收集Cas9-9R4L蛋白质并用Bradf ord测定法测定蛋白质量。
[0272] 5-5.sgRNA_9R4L 的制备
[0273] sgRNA(lyg)轻轻加入到100μ1 DPBS(pH 7.4)中的各种量091?礼(：肽（从1至40的重 量比）中。将该混合物在室温下孵育30分钟，使用无 RNA酶的去离子水稀释10倍。用动态光散 身才（Zetasizer-nano analyzer ZS；Malvern instruments Worcestershire，UK)，测定所形 成的纳米粒子的流体动力学直径和z电位。
[0274] 5-6.Cas9 蛋白质和 sgRNA 处理
[0275] 如下所述用Cas9-9R4L和sgRNA-C9R4LC处理细胞：将lyg sgRNA和 15yg C9R4LC肽 加入到250mL 0Ρ??ΜΕΜ培养基中，并在室温下孵育30分钟。在接种后24小时，用0Ρ??ΜΕΜ培养 基洗涤细胞并用sgRNA-C9R4LC复合体在37°C下处理4小时。将细胞用0Ρ??ΜΕΜ培养基再次洗 涤并用Cas9-9R4L在37°C下处理2小时。处理后，培养基用含血清的完全培养基取代，并在下 一次处理前在37°C下孵育24小时。连续3天以相同的程序实施Cas9和sgRNA的多次处理。
[0276] 5-7.Cas9_9R4L和sgRNA_9R4L能编辑培养的哺乳动物细胞中的内源基因而不使用 额外的递送工具
[0277] 为了确定Cas9_9R4L和sgRNA_9R4L在不使用额外的递送工具时是否可以编辑培养 的哺乳动物细胞中的内源基因，我们用Cas9-9R4L和靶向CCR5基因的sgRNA-9R4L处理了 293 个细胞，并分析了基因组DNAJ7E1测定表明，在以Cas9-9R4L和sgRNA-9R4L两者处理的细胞 中9%的CCR5基因被破坏，而在对照细胞(包括未经处理的细胞，用Cas9-9R或sgRNA-9R4L处 理的细胞，或用未修饰的Cas9和sgRNA两者处理的细胞（图13))中没有观察到CCR5基因的破 坏，这表明，用Cas9-9R4L蛋白质和与9R4L缀合的sgRNA(而不是未修饰的Cas9和sgRNA)处理 可以导致哺乳动物细胞中高效的基因组编辑。
[0278] 实施例6:根据向导RNA结构控制脱靶突变
[0279] 最近，三个小组报道了RGEN在人细胞中具有脱靶效应。出乎我们意料的是，RGEN在 与标靶位点相差3至5个核苷酸的脱靶位点有效地诱导了突变。然而，我们注意到，我们所使 用的RGEN和其他人使用的RGEN有一些差异。首先，我们用dualRNA--其是crRNA加 tracrRNA，而不是由crRNA和tracrRNA的必要部分组成的单向导RNA(sgRNA)。第二，我们用 合成的crRNA而非crRNA编码质粒转染K562细胞(而不是HeLa细胞）。用crRNA编码质粒转染 HeLa细胞。其他小组使用sgRNA编码质粒。第三，我们的向导RNA在5 '末端有两个附加的鸟嘌 呤核苷酸，这对于T7聚合酶的体外有效转录是必需的。在其他人使用的sgRNA中没有包括这 样的额外核苷酸。因此，我们的向导RNA的RNA序列可以表示为5 ' -GGX2Q，而5 ' -GX19R表其他 人使用的序列，其中X20或GX19对应于20-bp靶序列。第一个鸟嘌呤核苷酸是细胞中由RNA聚 合酶转录所需的。为了测试脱靶RGEN效应是否可归因于这些差异，我们选择了在人类细胞 中以高频率诱导脱靶突变的4个RGEN(13)。首先，我们在K562细胞中比较了使用体外转录 dualRNA的我们的方法与转染sgRNA编码质粒的方法，通过T7E1测定法测定了在标靶和脱靶 位点的突变频率。三个RGEN显示了在标靶和脱靶位点可比较的突变频率，与向导RNA组成无 关。有趣的是，当使用合成的dualRNA时，一个RGEN(VEFGA位点1)在一个验证的脱靶位点上 没有诱导Indel，该脱靶位点与标靶位点有三个核苷酸不同（称为0T1-11，图14)。但合成的 dualRNA没有辨别出其它验证的脱靶位点(0T1-3)，所述脱靶位点与标靶位点有两个核苷酸 不同。
[0280]下一步，通过比较5 ' -GGX2Q(或5 ' -GGGX19) sgRNA与5 ' -GX19sgRNA，我们测试了在 sgRNA的5'末端添加两个鸟嘌呤核苷酸是否可以使RGEN更特异。四个复合Cas9的GX19sgRNA 同等有效地在标靶和脱靶位点诱导了Indel，容忍多达四个碱基错配。与之形成鲜明对比， GGX2QsgRNA有效区别脱靶位点。事实上，当我们使用四个GGX2QsgRNA时，T7E1测定在七个验 证的脱靶位点的六个中几乎没有检测到RGEN诱导的indel(图15)。然而，我们注意到，两个 GGX2QsgRNA(VEGFA位点1和3)在标靶位点的活性比对应的GX19sgRNA的活性低。这些结果表 明，或许通过改变向导RNA的稳定性、浓度或二级结构，在5'端的额外核苷酸可以影响在标 靶和脱靶位点的突变频率。
[0281] 这些结果表明，三个因素--使用合成的向导RNA而不是向导RNA编码质粒，使用 dualRNA而非sgRNA，以及使用GGX2QsgRNA而非GX19sgRNA--在脱靶位点的辨别上有累积效 应。
[0282] 实施例7:配对的Cas9切口酶
[0283]原则上，单链断裂（SSB)不能被易错NHEJ修复，但仍引发高保真同源定向修复 (HDR)或碱基切除修复。但通过HDR的切口酶诱导的定向诱变比核酸酶诱导的诱变效率低得 多。我们推理，配对Cas9切口酶可以产生复合DSB，其触发通过NHEJ或HDR的DNA修复，导致有 效的诱变(图16A)。此外，配对切口酶使基于Cas9的基因组编辑的特异性增倍。
[0284] 我们首先通过荧光毛细管电泳在体外测试了几种设计为靶向AAVS1基因座中靶位 点的Cas9核酸酶和切口酶（图16B)。与Cas9核酸酶(其切割DNA底物的两条链)不同，Cas9切 口酶由向导RNA和Cas9的突变体形式组成，在所述Cas9突变体中催化性天冬氨酸残基改变 为丙氨酸(D10A Cas9)，该Cas9切口酶仅切割一条链，产生位点特异性缺口（图16C，D)。然 而，有趣的是，一些切口酶(在图17A中的六31432433，和36)在人类细胞中在靶位点诱导了 Indel，这表明缺口可以体内转化为DSB，尽管低效。在相对的DNA链上产生两个相邻缺口的 配对Cas9切口酶以从14 %至91 %的频率产生Inde 1，相当于配对核酸酶（图17A)的效应。在 三个基因组基因座上，产生5 '突出端的两个切口的修复，比产生3 '突出端的两个切口的修 复，以更高频率地导致Indel形成（图17A和图18)。此外，配对切口酶比单一切口酶能够更高 效地通过同源定向修复进行靶向基因组编辑(图19)。
[0285] 接下来，我们使用深度测序测定了脱靶位点上配对切口酶与核酸酶的突变频率。 与三个sgRNA复合的Cas9核酸酶在六个位点诱导了脱靶突变，所述位点与其相应的标靶位 点相差一个或两个核苷酸，突变频率范围从〇. 5%至10% (图17B)。与此相反，配对Cas9切口 酶在六个脱靶位点的任何一个上均未产生〇. 1 %检测限以上的Indel jSOff-l位点（其与其 标靶位点在PAM的第一位置(即，NGG中的N)上相差一个核苷酸)可以被认为是另一个标靶位 点。正如所料，与S2sgRNA复合的Cas9核酸酶在该位点和标靶位点上具有相同的效率。与之 形成鲜明对比，与S2和AS2sgRNA复合的D10A Cas9以270倍的因数区分该位点和标靶位点。 该配对切口酶还分别以160倍和990倍的因数区分AS2脱靶位点（图17B中的Of f-Ι和Of f-9) 和靶位点。
[0286] 实施例8:配对Cas9切口酶诱导的染色体DNA剪接
[0287] 已经报道，由工程化的核酸酶ZFN和TALEN产生的两个并行DSB能促进介于中间的 染色体片段的大缺失。我们测试了由配对Cas9切口酶诱导的两个SSB是否也能在人细胞中 产生缺失。我们使用PCR检测缺失事件，发现7个配对切口酶与配对Cas9核酸酶以同样效率 诱导了高达Ι.Ι-kbp染色体片段的缺失（图SOAJhPCR产物的DNA序列证实了该缺失事件 (图20C)。有趣的是，在七个缺失特异性PCR扩增子的两个中sgRNA匹配序列保持完整(20C中 下划线所示）。与此相反，Cas9核酸酶对没有产生含有完整靶位点的序列。这一发现表明，远 离的两个缺口没有转化为两个分开的DSB以促进居间染色体片段的缺失。此外，因为解链温 度非常高，不可能相隔l〇〇bp以上的两个切口在生理条件下造成具有大突出端的复合DSB。
[0288] 我们提出，两个远离的缺口通过头对头方向的链置换而被修复，导致在中间形成 DSB，其通过NHEJ的修复引起小的缺失（图20D)。因为在这个过程中两个靶位点保持完整，切 口酶能再次诱导SSB，反复触发循环，直到靶位点缺失。这一机制解释了为什么产生5'突出 端的两个并列缺口但不是产生3'突出端的两个并列缺口在三个基因座有效诱导了 Indel。
[0289] 然后我们调查了Cas9核酸酶和切口酶是否能诱发由于标靶和脱靶DNA切割的NHEJ 修复而导致的不希望的染色体易位（图21A)。使用PCR，我们能够检测到Cas9核酸酶诱导的 易位（图21B，C)。使用分离自转染了编码AS2+S3Cas9切口酶对的质粒的细胞的基因组DNA， 没有扩增出这样的PCR产物。这一结果与以下事实一致，即，不同于其相应的核酸酶，AS2和 S3切口酶在脱靶位点不产生Indel (图17B)。
[0290] 这些结果表明，配对Cas9切口酶允许在人类细胞中的靶向诱变和高达Ι-kbp染色 体片段的大缺失。重要的是，配对切口酶在脱靶位点没有引起Indel，而在该脱靶位点处其 相应的核酸酶诱发突变。此外，与核酸酶不同，配对切口酶不促进与脱靶DNA切割相关的不 想要的易位。原则上，配对切口酶使Cas9介导的诱变的特异性加倍，这将扩大RNA向导酶在 需要精确基因组编辑应用（如基因和细胞治疗）中的效用。这种方法的一个附加说明是，需 要两个高活性sgRNA构成有效的切口酶对，这限制了可靶向的位点。如该研究和其他研究所 示，并非所有sgRNA都具有同样活性。当单克隆而不是细胞群被用于进一步的研究或应用 时，代表基因组中独特序列的向导RNA的选择以及优化的向导RNA的使用将足以避免与Cas9 核酸酶相关的脱靶突变。我们提出，Cas9核酸酶和配对切口酶均为有利于细胞和生物体中 精确基因组编辑的强大选项。
[0291] 实施例9:用CRISPR/Cas衍生的RNA向导核酸内切酶的基因分型
[0292]接着，我们推定RGEN可代替常规的限制酶用于限制性片段长度多态性(RFLP)分析 中。当由核酸酶引起的DSB由易错非同源末端连接(NHEJ)系统修复时，包括RGEN的工程化核 酸酶将在靶位点诱导Indel。被设计识别靶序列的RGEN不能切割带有indel的突变序列，但 能有效地切割野生型靶序列。
[0293] 9-1 .RGEN 成分
[0294] 使用MEGAshortcript T7试剂盒(Ambion)，根据制造商的说明书，通过体外转录制 备crRNA和tracrRNA。转录的RNA在8 %变性尿素 PAGE凝胶上分离。切出含RNA的凝胶片，并转 移到洗脱缓冲液。将RNA回收至无核酸酶水中，然后用苯酚:氯仿提取，氯仿提取和乙醇沉 淀。用光谱法定量纯化的RNA。通过退火序列如下所示的寡核苷酸和其互补寡核苷酸，制备 crRNA的模板：5，-GAAATTAATACGACTCACTATAGG X2qGTTTTAGAGCTA TGCTGTTTTG-3，（SEQ ID N0:76)，其中X 20是革巴序列。使用Phusion聚合酶(New England Biolabs)，通过正向和反向 寡核苷酸的延伸，合成了 tracrRNA模板：
[0295] (5 '-GAAATTAATACGACTCACTATAGGAACCATTCAAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTC CG-3'（SEQIDN0 :77#P
[0296] 5 '-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCT ATG-3'(SEQ ID N0：78))〇
[0297] 9-2.重组Cas9蛋白质纯化
[0298] 在我们以前的实施例中使用的Cas9DNA构建体（其编码在C末端融合His6标签的 Cas9)插入至pET_28a表达载体。重组Cas9蛋白质表达于大肠杆菌菌株BL21 (DE3)，用ImM IPTG诱导后在25°C培养在LB培养基中4小时。收获细胞，并再悬浮于包含20mM Tris PH 8.0，500mM NaCl，5mM咪唑和ImM PMSF的缓冲液中。将细胞在液氮中冷冻，在4°C解冻，并超 声处理。离心后，将裂解物中的Cas9蛋白质结合至Ni-NTA琼脂糖树脂(Qiagen)上，用含有 20mM Tris pH8.0,500mM NaCl和20mM咪唑的缓冲液洗涤，并用包含20mM Tris pH 8.0， 500mM NaCl和250mM咪唑的缓冲液洗脱。纯化的Cas9蛋白质对20mM HEPES(pH 7.5)，150mM KC1，ImM DTT和10 %甘油进行透析，并通过SDS-PAGE分析。
[0299] 9-3. T7内切核酸酶I测定
[0300] T7E1测定如下进行。简要地说，用基因组DNA扩增的PCR产物在95°C变性，在16°C退 火，并在37°C与5单位T7内切核酸酶I(New England BioLabs)孵育20分钟。将反应产物用 2 %至2.5 %的琼脂糖凝胶电泳分离。
[0301 ] 9-4 · RGEN-RFLP 分析
[0302] PCR 产物（100-150ng)在37°C 下与优化浓度(表 10)的 Cas9蛋白质、tracrRNA，crRNA 在10μ1 NEB缓冲液3(1X)中孵育60分钟。切割反应后，加入RNA酶A(4yg)，并将反应混合物在 37°C孵育30分钟，以除去RNA。用含有30%甘油，1.2%SDS和100mM EDTA的6X终止溶液缓冲 液终止反应。产物用1 -2.5 %琼脂糖凝胶电泳分离，并用EtBr染色以显现。
[0303] [表 10]
[0304] RFLP测定中RGEN成分的浓度
[0305]
[0306] [表 11]
[0307] 引物 [0308]
[03C
[0310] 9-5.质粒切割测定
[0311 ]限制性内切酶处理的线性化质粒（l〇〇ng)在37°C下与Cas9蛋白质（0 . lyg)、 tracrRNA(60ng)和crRNA(25ng)在10yg NEB3缓冲液（IX)中孵育60分钟。用含有30%甘油， 1.2%SDS和100mM EDTA的6X终止溶液终止反应。产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分离，并用EtBr 染色而显现。
[0312] 9-6.RFLP 策略
[0313] 具有所需DNA特异性的新RGEN可以通过替换crRNA而容易地创建；一旦获得重组 Cas9蛋白质，则不需要从头纯化定制蛋白质。当核酸酶引起的DSB通过易错非同源末端连接 (NHEJ)修复时，包括RGEN的工程化核酸酶在靶位点诱发小的插入或缺失（inde 1)。设计成识 别靶序列的RGEN有效切割野生型序列，但不切割具有indel的突变序列（图22)。
[0314] 我们首先测试RGEN能否差异地切割包含野生型或修饰C4BTO靶序列（其在切割位 点具有1至3个碱基Indel)的质粒。具有这些Indel的六个质粒中没有一个被靶特异性 crRNA、tracrRNA和重组Cas9蛋白质组成的C4BPB特异性RGEN5切割（图23)。与此相反，具有 完整靶序列的质粒被该RGEN有效切割。
[0315 ] 9-7.使用RGEN介导的RFLP检测由同一RGEN诱导的突变
[0316]接下来，为了测试RGEN介导的RFLP检测由同一 RGEN诱导的突变的可行性，我们利 用了通过RGEN祀向C4BPB基因建立的基因修饰的K562人癌细胞克隆（表12)。
[0317][表 12]
[0318]在这项研究中使用的RGEN的靶序列
[0319]
[0320] 本研究中使用的C4BTO突变体克隆具有范围从94bp缺失至67bp插入的各种突变 (图24A)。重要的是，发生在突变体克隆中的所有突变均导致了RGEN靶位点的丧失。在分析 的6个C4BPB克隆中，4个克隆具有野生型和突变体等位基因(+/-)，2个克隆仅具有突变体等 位基因（-/-)。
[0321] 用靶特异性crRNA、tracrRNA和从大肠杆菌表达和纯化的重组蛋白Cas9组成的 RGEN，完全消化从野生型K562基因组DNA扩增的跨RGEN祀位点的PCR产物（图24B/第1道）。当 使用RGEN对C4BPB突变体克隆进行RFLP分析时，含有野生型和突变体等位基因的+/-克隆的 PCR扩增子被部分消化，不含有野生型等位基因的-/_克隆的扩增子根本不被消化，不产生 对应于野生型序列的切割产物（图24B)。甚至在靶位点的单碱基插入也阻碍C4BPB RGEN对 扩增的突变体等位基因的消化(#12和#28克隆），表明RGEN介导的RFLP的高特异性。我们对 PCR扩增子平行地进行错配敏感的T7E1测定（图24B)。值得注意的是，T7E1测定无法区分-/-克隆和+/-克隆。更糟的是，T7E1测定不能区分含有相同突变序列的纯合突变体克隆和野生 型克隆，原因是相同突变序列的退火将形成同源双链体。因此，RGEN介导的RFLP比常规的错 配敏感的核酸酶测定法在分析工程化核酸酶(包括ZFN，TALEN和RGEN)诱导的突变体克隆方 面更优越。
[0322] 9-8.RGEN-RFLP分析的定量测定
[0323] 我们还调查了 RGEN-RFLP分析是否是一个定量的方法。从C4BPB无效克隆和野生型 细胞中分离的基因组DNA样品以各种比例混合，并用于PCR扩增。对PCR产物平行进行RGEN基 因分型和T7E1测定（图25b)。正如所料，由RGEN切割的DNA与野生型对突变的比率成比例。与 此相反，T7E1测定结果与从该比率推断的突变频率具有很差的相关性，特别是在高突 变％-一互补突变序列可相互杂交形成同源双链的情形一一是不准确的。
[0324] 9-9.使用RGEN介导的RFLP基因分型分析突变体建立者小鼠
[0325] 我们还应用RGEN介导的RFLP基因分型（简称RGEN基因分型），进行了突变体建立者 小鼠的分析，该小鼠通过向小鼠一细胞胚胎中注射TALEN而建立（图26A)。我们设计并使用 了识别P i bfl基因中的TALEN祀位点