检测aldh2基因多态性的引物、探针和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[000? ]本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体涉及检测ALDH2基因多态性的引物、探 针和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人类乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase gene,ALDH)是一种四联体蛋白，催化 乙醛和其他脂肪族醛氧化，目前已经发现19种ALDH基因，在其19种同工酶中，存在于肝脏线 粒体内的ALDH2活性最强。
[0003] ALDH2具有乙醛脱氢酶的活性，是人体内酒精代谢的关键酶，能够将有害产物乙醛 转化为无害的乙酸，从而起到解毒的作用。ALDH2同时也具有硝酸酯酶活性，临床上治疗及 预防冠心病心绞痛的常用药物硝酸甘油也是由其代谢的，硝酸甘油经ALDH2代谢，释放一氧 化氮(NO)，N0能激活鸟苷酸环化酶，使平滑肌和其他组织内的环鸟苷酸(CGMP)增多，导致肌 球蛋白轻链去鳞酸化，调节平滑肌收缩状态，引起血管扩张，从而有效预防冠心病和心绞 痛。
[0004] 人类ALDH2基因位于12号染色体，包含13个外显子，其12号外显子1510位 (rs671SNP)的鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)时，导致该基因编码蛋白504位的谷氨酸(Glu)替 换为赖氨酸(Lys)，即Glu504Lys(rs671)。这个位点突变使ALDH2失去结合辅酶的能力，造成 酶活性的丧失，严重影响酒精、硝酸甘油等的代谢。人群中该酶基因型有3种情况，具有正常 催化活性的野生纯合子型:ALDH2*1/1;活性下降的杂合子型:ALDH2*l/2(约为正常ALDH2活 性的6.25% )，催化活性失去的突变纯合子型ALDH2*2/2。同时ALDH2表现出明显的遗传多态 性，在不同的地域、民族、人种中其频率不同。其在欧美白种人中少见，而在中、日、韩等东亚 黄种人中突变率高达30%~50%。
[0005] 研究显示，在饮酒人群中，尤其是重度饮酒者，ALDH2基因多态性与酒精性中毒、酒 精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)、消化道癌症等疾病密切相关，ALDH2*2突变人 群患肝癌、食道癌、口腔癌的概率分别是ALDH2*1野生人群的3倍、12.95倍、11.72倍以上， ALDH2*2突变是增加区域性癌化几率的重要因素之一。另外，ALDH2*2突变导致硝酸甘油代 谢速率大大降低，从而无法产生一氧化氮，难以发挥药效。因此对ALDH2基因突变的检测能 够指导人们根据自己的基因型正确饮酒，从而减少酒精引起的身体伤害，真正做到健康饮 酒。也能为医生合理使用硝酸甘油提供有力参考，减少用药无效导致的意外死亡。
[0006] 目前，针对ALDH2基因多态性检测的方法有多种，最简单的方法是PCR-RFLP，但该 方法操作复杂，样本多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而 出现假阴性或假阳性的结果，可靠性低。DNA测序法虽然是金标准，但步骤繁琐，过程复杂， 容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败，另外测序仪价格超出了一般临床检验实验室 的承受范围。高分辨率溶解曲线法，快速，简便，经济实用，但是受仪器温度控制，假阳性高。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中对于ALDH2基因检测方法的上述不足，本发明在Taqman探针 法的基础上提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的ALDH2 多态性位点的引物和探针。
[0008] 本发明提供的检测ALDH2基因多态性的引物和探针，其探针为公用的Taqman探针， 其核苷酸序列5'端标记报告基团，3'端标记淬灭基团；引物的核苷酸序列如下：
[0009] 突变型ARMS上游引物：
[0010] SEQ ID N0:l(5'-TCCCACACTCACAGTTATCACGTT-3'）；
[0011] 野生型ARMS上游引物：
[0012] SEQ ID N0:2(5'-TCCCACACTCACAGAATTCACTTC-3'）；
[0013]公用的下游引物：
[0014] SEQ ID N0:3(5'-GGTCAACTGCTATGCTCTGATTGG-3'）。
[0015] 上述引物针对G1510A位SNP位点设计。引物及探针使用的具体原理是:针对突变位 点分别设计野生型和突变型ARMS引物和Taqman探针，结合荧光定量PCR反应，对从人外周血 细胞或口腔拭子等组织中提取的基因组DNA进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计 算野生型和突变型的ACt值来确定样本DNA的基因型。
[0016] 优选地，探针的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示，5'端标记的报告基团为FAM，3'端 标记的淬灭基团为MGB。
[0017] 探针SEQ ID N0:4:5'-FAM/CCGTACTCCCCAAC T/MGB-3'。
[0018] 本发明还提供了一种检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其包括权利要求1或2所述 的检测ALDH2基因多态性的引物和探针。
[0019 ] 优选地，还包括内控引物和内控Taqman探针，核苷酸序列如下：
[0020] 内控上游引物：
[0021] SEQ ID N0:5(5，-TCCCGACCACACGCGACT-3，)；
[0022] 内控下游引物：
[0023] SEQ ID N0:6(5'-ACCTTCGTGCTGGAGCACAT-3'）；
[0024] 内控 Taqman 探针：
[0025] SEQ ID NO:7;
[0026] Taqman探针的核苷酸序列5'端标记报告基团，3'端标记淬灭基团。
[0027]优选地，报告基团为J0E，淬灭基团为BHQ1。
[0028] SEQ ID N0:7(5'-J0E-CAACGCTCCGCTCCACAAACTCATCATA-BHQl-3'）
[0029] 所述内控基因碱基序列为NCBI数据库中基因序列编号为NM_001204889.1第818到 1117位。上述引物是针对该段序列设计的。这段序列是ALDH2基因第9外显子上的一段序列， 与目的基因是同一个基因，不仅可以作为试剂盒的质控，还可以作为样本DNA的质控，保证 提取出来的DNA包含ALDH2基因，可以排除其他序列的非特异交叉反应，同时它也不会对目 的基因产生交叉反应，确保试剂盒的准确性。
[0030] 优选地，还包括阳性质控品，阳性质控品为含有ALDH2G1510A野生型基因序列、 G1510A突变型基因序列以及内控基因序列的DNA混合物，内控基因序列如SEQ ID N0:8所 不。
[0031] 优选地，上述的检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其中的试剂分为四类：
[0032] (1)ALDH2基因突变型检测液：至少含有SEQIDN0:1、SEQIDN0:3的引物和核苷 酸序列为SEQ ID NO: 4的探针，以及内控引物和内控Taqman探针，dNTPs，PCR缓冲液；
[0033] (2)ALDH2基因野生型检测液：至少含有SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3的引物和核苷 酸序列为SEQ ID NO: 4的探针，以及内控引物和内控Taqman探针，dNTPs，PCR缓冲液；
[0034] (3)阳性质控品；
[0035] (4)DNA 聚合酶。
[0036] PCR缓冲液为现有技术已知，可以自行配制或者直接购买市售商品（例如商品名通 常为10XPCR buffer)，其含有帮助PCR过程顺利进行的盐离子如Mg2+和其他化学成分。 [0037]优选地，上述的检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其中的试剂分为三类：
[0038] (1)ALDH2基因突变型检测液：至少含有SEQIDN0:1、SEQIDN0:3的引物和核苷 酸序列为SEQ ID N0:4的探针，以及内控引物和内控Taqman探针，dNTPs，PCR缓冲液，ABI公 司的产品Fast master Premix;
[0039] (2)ALDH2基因野生型检测液：至少含有SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3的引物和核苷 酸序列为SEQ ID NO: 4的探针，以及内控引物和内控Taqman探针，dNTPs，PCR缓冲液，ABI公 司的产品Fast master Premix;
[0040] (3)阳性质控品。
[0041] 其中Fast master Premix是ABI公司（即美国应用生物系统公司 AppliedBiosystems)的产品，其将NDA聚合酶与PCR缓冲液集成在一起。另外我们发现，向含 有Fast master Premix的反应体系中额外加入PCR缓冲溶液之后，曲线荧光信号增强，线型 呈S型，符合PCR的特点，并且Ct值提前，检测结果更易判断。
[0042] 上述两种试剂盒，其中的ALDH2基因突变型检测液和ALDH2基因野生型检测液可以 分装在多个管内，进行批量检测，或者进行同一样品的重复检测，以节省时间。
[0043]本发明还提供了以上任一所述的检测ALDH2基因多态性的试剂盒的使用方法，其 包括：
[0044] (1)用内控引物及内控Taqman探针扩增阳性对照品，结果显示J0E信号CT值小于 25,表示试剂盒可用；
[0045] (2)将待检样品DNA分别用突变型引物和公用Taqman探针，以及野生型引物和公用 Taqman探针进行荧光定量PCR反应并获得对应的突变型CT值和野生型CT值，ACt= |野生型 CT值-突变型CT值| < 2.5为杂合型样本，ACt =野生型CT值-突变型CT值>2.5为突变型