云杉矮槲寄生害的lamp检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一组LAMP引物，能够快速检测出寄主体内是 否有潜伏侵染的云杉矮槲寄生。
【背景技术】
[0002] 天然云杉林在我国西部生态脆弱地区具有无可替代的生态价值，发挥着保持水土 和涵养水源等重要生态功能，是我国西部乃至全国生态环境安全的重要保护屏障。云杉矮 槲寄生害是目前我国云杉林毁灭性灾害之一，造成三江源地区云杉天然林和次生林的严重 病害，在经济和生态环境上带来巨大的损失。仅2003年，在青海省门源县仙米林场就因云杉 矮槲寄生害被迫砍伐1.1万立方米的云杉。到2007年，整个青海省的发生面积已达到1.3万 公顷。预防与控制云杉矮槲寄生害已成为我国西部乃至全国生态环境安全的重要议题。
[0003] 云杉矮槲寄生(Arceuthobium sichuanense)是檀香目、桑寄生科、油杉寄生属的 多年生寄生性种子植物，主要分布于我国青海、四川、西藏和甘肃等省（自治区）。云杉矮槲 寄生通过种子进行传播，种子萌发产生胚根进行侵染。胚根侵入寄主枝条后，寄生于云杉属 树木的枝干上，依靠其内寄生系统与寄主建立寄生关系，建立位于寄主组织内部的内寄生 系统。云杉矮槲寄生的内寄生系统可以在寄主体内扩展，从而进行系统侵染，并吸取寄主营 养和水分，造成寄主生长畸形，形成丛枝、膨大等症状。侵染严重时，可以直接导致寄主死 亡。然而，由于云杉矮槲寄生从侵入寄主到显现症状需要5~8年的潜伏期，因此造成在病害 防治过程中不能及时发现病害，延误了云杉矮槲寄生害的有效防治。
[0004] 随着PCR等分子生物学技术的发展和推广，越来越多的分子检测技术运用到植物 病害诊断的过程中。利用PCR检测方法对云杉矮槲寄生的检测已有研究，例如申请号为 201410153628.5的发明专利申请公开了一种云杉矮槲寄生的PCR检测引物及其应用和PCR 检测方法，该发明涉及一对基于ITS2片段的云杉矮槲寄生PCR快速检测引物，所述引物包括 如下基因序列：dwF3: 5 ' -ACAAACTCATTTTCCCACCACA-3 ' ； dwR3 : 5 '-ACATTCAAGAAACCTGAC ACCC-3'。虽然该发明的引物具有检测周期短、操作简单、结果可靠及灵敏度高等优点，可以 有效地监测和早期预警云杉矮槲寄生的侵染动态，指导制定科学的病害管理策略，对及时 采取有效措施防治云杉矮槲寄生害具有重要意义，但是，基于PCR的检测技术都需要PCR仪 等昂贵设备，难以用于基层和现场检测。
[0005] 环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是针对革巴基 因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在 15-60分钟内实现10 9-101()倍的扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可 以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。
[0006] LAMP能在等温(60_65°C)条件下，短时间(通常是一小时内）内进行核酸扩增，是一 种"简便、快速、精确、低价"的基因扩增方法。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循 环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有操作简 单、快速、特异性强、产物易检测等特点。LAMP技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能 媲美甚至优于PCR技术，不需要PCR仪和昂贵的试剂，不依赖任何专门的仪器设备实现现场 高通量快速检测，仅通过肉眼观察即可判断检测结果，检测成本远低于荧光定量PCR，在病 原物检测及病害诊断领域具有广泛的应用前景。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种云杉矮槲寄生害的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)快速检测方法。运用环介导等温扩增技术检测云杉矮槲 寄生害的方法，能够提高检测效率和检测的准确度，本发明针对云杉矮槲寄生质体基因 clpP片段中6个区域设计1组引物(含4条特异性引物），具有特异性高，快速简便等优点。检 测时间只需45~60分钟。此外，该方法操作简便，不需要复杂设备，可用于室外及基层单位 的现场检测，能够在云杉矮槲寄生侵入寄主云杉的早期进行诊断，提前预防，为有效预防与 控制云杉矮槲寄生病害提供科学依据。为治理云杉矮槲寄生病害的最佳防治时机的把握具 有重要意义。
[0008] 为实现本发明的上述目的，本发明应用LAMP方法对云杉矮槲寄生的分子检测方法 进行研究，通过对云杉矮槲寄生质体基因 clpP片段进行扩增和分析，根据云杉矮槲寄生的 clpP基因的序列设计特异性引物，从而建立一种对云杉矮槲寄生稳定、高效、准确、简便的 检测方法，本发明的检测方法检测成本低，可以根据对反应液的颜色变化判定是否有云杉 矮槲寄生的存在。
[0009] 本发明一方面提供一种云杉矮槲寄生的LAMP检测引物，LAMP检测引物能对云杉矮 槲寄生中的质体基因 clpP片段进行扩增，生成云杉矮槲寄生特异性扩增片段。
[0010]其中，所述云杉矮槲寄生的LAMP检测引物的核苷酸序列为SEQ ID No. 1、SEQ ID No.2、SEQ ID Νο·3和SEQ ID Νο·4。
[0011]特别是，所述SEQ ID No.l的核苷酸序列为5'-CAAGGGGCTGATAGTGAA-3'；所述SEQ IDNo·2的核苷酸序列为5'-GGATAAAAGATCCCATTGAGG-3'；所述SEQIDNo·3的核苷酸序列 为5 ' -TCCGCCAGGAGAGITTATAAAAAAAGAATCAACTTATTAGTCTGATGGT-3 ' ；所述SEQ ID No · 4的核 苷酸序列为5 ' -GGTCATCCCAGGAGTCGCTACTAAGCCTATACATATAGTCTGTAC-3 '。
[0012] 尤其是，所述SEQ ID No.l的核苷酸序列的引物为上游外部引物；所述SEQ ID No.2的核苷酸序列的引物为下游外部引物;所述SEQ ID No.3的核苷酸序列的引物为上游 内部引物;所述SEQ ID No.4的核苷酸序列的引物为下游内部引物。
[0013] 本发明通过分析云杉矮槲寄生的质体基因 clpP的基因序列，设计特异性引物，能 够快速、准确地对云杉矮槲寄生进行定性检测，检测结果可靠。本发明的引物可以通过利用 本领域技术人员的公知的化学合成方法进行的DNA合成技术得到。本发明人在对相应的植 物的clpP基因序列进行测定和比较的基础上，根据云杉矮槲寄生clpP基因序列上的特异碱 基位点设计了引物，因此仅对云杉矮槲寄生有扩增信号，而对其寄主材料没有目的扩增信 号。
[0014] 本发明另一方面提供一种云杉矮槲寄生LAMP检测方法，包括如下顺序进行的步 骤：
[0015] 1)提取待测样品中的DNA;
[0016] 2)以步骤1)中提取的DNA为模板，进行LAMP扩增；
[0017] 3)分析LAMP扩增产物。
[0018] 其中，步骤2)中所述LAMP扩增过程中，LAMP反应体系以25μ1计为： lOxThcrmoPo丨缓冲液 2.5 μΙ dNTPs f 10 mM each dNTP) 1.5 μL MgS0.4 ( 100 mM) 0.5 μL Bst DNA 聚合酶（8U/.uL) 1 μ! 上游外部引物（F3，ΙΟμΜ) 2 8 μL
[0019] 下游外部引物（Β3，ΙΟμΜ) 2.8 μL 上游内部引物（ΠΡ，10μΜ) 0.7 μΙ 下游内部引物（ΒΙΡ，ΙΟμΜ) 0.7 μL 甜菜碱（5 Μ) 5μ1 模板DNA 1 μ! ddH?0 6.5μ1〇
[0020] 特别是，步骤2)中所述LAMP扩增过程中的温度为60-65°C，优选为60-63°C，进一步 优选为60°C。
[0021] 尤其是，步骤2)中所述LAMP扩增的时间为45-90min，优选为45min。
[0022] 特别是，还包括将温度升高至85°C并载温度为85°C的条件下保持10min，使得Bst DNA聚合酶失活。
[0023] 其中，步骤2)中所述LAMP扩增过程中，LAMP反应体系以25μ1计为： 10、Thermol)ol 缓冲液 2.5 μΙ dNTPs (10 mM each dNTP ) 1.5 μ I MgSD4 (lOOmM) 0.5 μL
[0024] Bsi DN A 聚介酚（8U/μL ) 1 μL 上游外部引物（F3，ΙΟμΜ) 2.8 μL 下游外部引物（Β3，ΙΟμΜ) 2.8 μΙ 上游内部引物（ΠΡ，】0μΜ) 0.7 μL 下游内