一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法及使用的引物和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法，扩增PID1基因第2外显子所 使用的引物，以及筛选优质牛种所使用的试剂盒，属于动物分子遗传学技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着饮食文化的丰富和人们生活水平的不断提高，越来越多的人意识到牛肉特有 的营养价值。牛肉含有人体所需的必需氨基酸，具有高蛋白、低胆固醇的特点，营养丰富。随 着消费群体的增大，牛肉在肉类消费中的比重在逐年攀升，牛肉价格也连续走高。消费总量 在不断增长的同时，人们对牛肉的质量也有了更高的要求，"雪花牛肉"、"高档牛肉"逐渐成 为消费时尚，消费者对高档牛肉的需求也越来越迫切。国内现阶段大多数的"高档牛肉"主 要依赖进口，这一现实状况对我国高档肉牛品种的选育提出了新的挑战。我国肉牛现有五 大品种，八大地方品种，但多为兼用型，肉牛的综合生产水平较低，特别是牛肉的质量较国 外有很大的差距，高档肉牛的培育相对滞后，培育高档肉牛已是必然趋势。 布莱凯特黑牛是一种优质肉牛新品种，是通过体细胞克隆等现代生物技术结合常规育 种杂交方法，对当地的鲁西黄牛和渤海黑牛进行改良而获得的优良种质资源。该杂交种质 充分显现了杂种优势，保留了和牛肉质特性和部分外表特征，获得了鲁西黄牛和渤海黑牛 适应本土环境和地理条件的生理特性。由于致密化的脂肪具有一定的硬度，其肉块可切成 小方块、中方块和大方块，每个切面都成大理石花纹的独特特性。该牛最大特点是肉质好， 呈典型的大理石花纹，又称"雪花肉"，细嫩多汁，其牛肉含有丰富的蛋白质，氨基酸组成比 猪肉更接近人体需要，能提高机体抗病能力，CoQlO含量也相对较高，具有营养心肌、增强抵 抗力的功能，同时含铁量丰富，饱和脂肪酸含量很低，不饱和脂肪酸含量高，风味独特，肉质 鲜美，口感特别，营养丰富，肉用价值极高，是我国肉牛品种中不可多得的优质肉牛新种质， 因此快速高效的培育肉质、营养更加优良的肉牛品种是当务之急。
[0003] 目前，对布莱凯特黑牛优质牛种进行筛选或者培育优质牛种的方法很少有 报道，目前常用SSCP和普通RFLP技术进行单核苷酸多态性（Single nucleotide Polymorphisms，SNPs)检测及群体遗传多态性分析，这些方法不稳定，有些突变不引起DNA 弯曲，分子构象不改变，在通常的条件下，这些突变可能未被检出，因而，只通过这些技术并 不能证明完全没有突变，实际应用中可能会遇到相当比例的假阴性结果；同时目前的检查 技术灵敏度不高，受多种因素如电泳温度、离子强度（即电泳缓冲液浓度）、凝胶浓度、甘油 的浓度和交联剂亚甲基双丙烯酰胺的浓度等的影响，导致重复性差；加之其操作过程复杂， 这极大的限制了其在生产中的应用。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术中还没有一种快速有效的筛选优质牛种的方法的不足，本发明提供 了一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法，该方法能够快速、简洁的筛选出优质的布莱凯 特黑牛牛种，准确性高，为培育肉质、营养更加优良的莱凯特黑牛品种提供了技术支持。
[0005] 本发明还提供了一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的试剂盒，使用该试剂盒可以方 便的筛选出优质牛种，便于应用。
[0006] 本发明还提供了一种扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的引物，该引物能准 确的扩增出布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子，为优质牛种的筛选提供了良好的基础。
[0007] 肌内脂肪（Intramuscular Fat，IMF)是沉积在肌内脂肪细胞中的甘油三酯 (Triglyceride，TG)，頂F含量与牛肉的品质密切相关，能直接影响肉的嫩度和风味，提高肌 内脂肪含量也成为现代育种的要求之一。在黑牛育种过程中发现，布莱凯特黑牛的肉质情 况存在差异，并非所有培育出来的布莱凯特黑牛都具有肉质好、营养丰富、风味独特的独特 特性，为了使布莱凯特黑牛保持优良的品种就必须不断筛选优良的牛种。
[0008] 目前有关筛选、选育优质布莱凯特黑牛牛种方面的研究还比较少，没有很好的筛 选方法，发明人试图从分子生物学角度研究基因与黑牛肉质的关系，为培育优质布莱凯特 肉牛品种提供新的思路。在这一思想的指导下，发明人选择PID1、roSS2、C0Q2、C0Q3等基 因进行研究，以布莱凯特黑牛养殖场的大量布莱凯特黑牛为研究对象，通过PCR扩增技术 分析黑牛的上述基因情况，寻找影响黑牛品质的基因因素。PID1 (磷酸酪氨酸互作结构域 l，Phosphotyrosine interaction domain containing 1)基因有一个 PTB(磷酸酪氨酸作 用位点）结构域，与信号蛋白She上的PTB结构域相似，参与生长因子刺激下细胞增殖等下 游效应。C0Q10 (辅酶Q10)是一种醌环类化合物，广泛存在于动植物及微生物细胞的线粒体 内膜上，其在氧化磷酸化、细胞凋亡、体内自由基清除和增强机体免疫力等方面起着重要作 用，是生物有氧呼吸电子传递链中的必要成分，其不仅对于ATP的产生至关重要，还具有清 除体内活性氧自由基及通过调控NAD +/NADH比率来控制细胞的氧化还原态等功能，是人体 内唯一可利用的CoQ类，被生物学家称为维生素 Q。CoQlO除具备以上功能外，还是人体唯 一可利用的CoQ类，而十聚异戊二稀焦磷酸合成酶（decaprenyl diphosphate synthase， DPPS)在CoQlO合成过程中起决定性作用，其为同源二聚体蛋白，也称为异源四聚体，作为 合成c〇Qio的关键酶之一，决定着十异戊二烯侧链的合成，而且具有专一性，该酶由rossi 和ross2两个亚基组成，并分别由rossi和ross2基因分别编码。c〇Q2基因为真核生物中 对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶（PPT)的编码基因，PPT是C0Q10生物合成过程的 主要限速酶之一，影响体内C0Q10的合成。C0Q3基因编码的氧-甲基转移酶催化辅酶Q10 合成过程中两步重要甲基化反应，甲基转移酶（methyltransferase，MT)广泛存在于生物 体内，它是甲基转移酶大家族中的一员。
[0009] 经过最后的研究结果显示：PID1、TOSS2、C0Q2、C0Q3这些基因都有位点的突变，但 是TOSS2、C0Q2、C0Q3基因的突变与肌内脂肪含量等性状并没有明显的对应关系，而PID1基 因的突变对布莱凯特黑牛的品质却有明显的对应关系，具体来说当布莱凯特黑牛PID1基 因第2外显子的第285位碱基发生了 T※G转换时，布莱凯特黑牛的肉质更好，因此确定了 以检测PID1基因的突变来筛选优质黑牛的筛选方法。 本发明具体技术方案如下：
[0010] 一种筛选布莱凯特黑牛优质牛种的方法，PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外 显子的基因序列，选择PID1基因第2外显子的第285位碱基为G (鸟嘌呤）的布莱凯特黑 牛为优质牛种。 toon] 发明人根据研究结果得到了上述筛选方法，通过这一方法可以方便、快捷的判断 黑牛品质的优劣，为优化肉牛品质提供了更好的技术支持。
[0012] 单核苷酸多态性（SNP)是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、 插入或缺失等变化。单核苷酸多态性具有数量多、分布广和稳定遗传等特点，是一种进行分 子遗传育种的优良手段。PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异 性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切 位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此技术大大提高了目的DNA的含量和相对 特异性，而且方法简便，分型时间短。本发明PID1基因第2外显子酶切位点为ATTAAT，因此 可以被Ase I内切酶特异性识别，采用PCR-RFLP法能够快速、便捷、直观的判断出是否存在 285位碱基突变，因此采用PCR-RFLP法筛选优质牛种。
[0013] 进一步的，PCR-RFLP法筛选优质牛种包括以下步骤： (1) 取布莱凯特黑牛待检样本，提取DNA，作为PCR扩增的模板DNA ; (2) 采用PCR扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子，得PCR产物，扩增所用的引物如 下： 上游引物：5' GTGACCTATCTGGGTAAGGTGCCC3' 下游引物：5' TCAGCCATCATCAGATTCTAATTCCTGGG3' ； (3) 利用限制性内切酶酶切扩增的PCR产物，再对酶切后的片段进行琼脂糖凝胶电泳 检测，选择琼脂糖凝胶电泳产生1个片段的布莱凯特黑牛为优质牛种。
[0014] 上述方法中，酶切后仅有一个电泳片段时，表示PID1基因第2外显子的第285位 碱基为G(鸟嘌呤），其对应的基因型为BB纯合子，此牛种肉质最佳。
[0015] 上述方法中，所述待检样本可以是布莱凯特黑牛的组织样本、血液样本、排泄物样 本等，选择范围广。 上述方法中，可以采用现有技术中公开的提取试剂盒提取DNA。
[0016] 上述步骤（2)中，PCR反应条件为：94°C预变性7min、94°C变性30s、56°C退火30s、 72°C延伸45s，30个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0017] 上述步骤（2)中，PCR反应体系为：模板DNA2.0yL，含Mg2+的lOXPCRBuffer 5. 0 μ L，dNTP 4. 0 μ L，扩增布莱凯特黑牛PID1基因第2外显子的上、下游引物各1. 0 μ L， 5U/ μ L的Taq酶0. 3 μ L，加双蒸水即可至总体积为50. 0 μ L。 上述步骤⑶中，所述限制性内切酶为限制性内切酶Ase