一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法
【专利说明】一种利用整合宿主因子提高滚环扩増效率的方法 【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法。 【【背景技术】】
[0002] 滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)是 1998年建立的一种体外等温 核酸扩增方法。该方法借鉴了自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环复制方式，可以实现 环状DNA的高速循环复制，具有灵敏度高、特异性强、高通量、操作简便和反应条件温和等特 点，在单核苷酸多态性分析、DNA芯片、蛋白质芯片、核酸测序等方面得到了广泛使用。
[0003] 滚环扩增的机理主要在于使用具有强的持续性和链置换活性的聚合酶，如Phi 29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶等。在滚环扩增过程中，寡核苷酸引物与单链环状模板结合，在 该类聚合酶的作用下，不断延伸互补链，在完成一圈复制后重新回到原点，核酸链间的位移 活动使得新合成出的核酸链进一步取代之前的旧链作为聚合前体，从而使得延伸过程可以 进一步循环，得到线性的与环状模板互补的多拷贝序列构成的联聚分子。根据使用的寡核 苷酸引物的数量和特性，滚环扩增可分为线性扩增（Linear RCA，LRCA)、指数扩增 (Hyperbranched RCA，HRCA)、多引物滚环扩增(multiply-primed RCA)和锁式探针扩增 (Ligation-RCA，LRCA)等。其中，多引物RCA利用Phi 29 DNA聚合酶和多条寡核苷酸引物，提 高了合成的速度和产量，不仅可以扩增质粒、人工细菌染色体（Bacteria art if icial chromosome，BAC)、粘粒等大的环状DNA，而且可以扩增未知序列的环状DNA和无法克隆的环 状模板，产物为双链，可用于测序、酶切、克隆、标记和检测等方面，市售的TempliPhi?DNA测 序模板扩增试剂盒即应用了多引物RCA技术。
[0004] 尽管多引物RCA技术已得到广泛应用，但该技术仍存在一定的不足。尤其是当反应 体系中的DNA模板复杂或含量很低时，大量引物不能与模板有效配对，引物之间易形成二聚 体结构，导致错配的产生，降低了目的DNA的滚环扩增效率。目前，有一种利用单链结合蛋白 TthSSB来提高RCA扩增效率方法。TthSSB蛋白具备单链结合蛋白（single-stranded nucleic acid binding protein，SSB)的特性，在RCA反应过程中，通过与体系中的单链DNA 结合，不仅使得单链DNA保持稳定，防止其重新配对成双链或被核酸酶降解，还能促进同源 的核苷酸链互补配对，从而实现了对RCA技术的优化。
[0005] 整合宿主因子是调控原核生物基因复制转录的蛋白之一，其最初被发现具有辅助 λ噬菌体整合到其宿主基因中的功能，故将其命名为整合宿主因子。它是一种热稳定的双链 DNA结合蛋白，不仅具有维持DNA的超螺旋和压缩状态的作用，在DNA的弯曲、基因转录调控、 核蛋白复合物的装配所需的位点特异性重组反应和起始于复制原点的复制，以及通过蛋白 质-RNA相互作用控制翻译起始等方面发挥作用。整合宿主因子（IHF)由α亚基(99个氨基酸） 和β亚基(94个氨基酸)两个异源亚基构成，α亚基和β亚基之间有30%的同源性。已有研究报 道单独表达的IHF-α亚基难与DNA结合，而IHF-β亚基可与DNA形成稳定的复合物。迄今为止， 还没有关于运用双链DNA结合蛋白来提高RCA扩增效率的报道。 【
【发明内容】
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[0006] 本发明要解决的技术问题，在于提供一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的 方法，该方法在很大程度上解决了 RCA技术反应速度慢、灵敏度低等问题。
[0007] 本发明是这样实现的：
[0008] 一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法，制备RCA反应液，在RCA反应液 中加入IHF-β蛋白。
[0009] 进一步地，所述RCA反应液中IHF-β蛋白的浓度为0.204~4.08ngAil。
[0010] 本发明具有如下优点：
[0011] 通过在RCA反应过程中加入一定浓度的IHF-β，可以显著地提高滚环扩增的效率， 增强滚环扩增的灵敏度，填补了有关利用耐热的DNA双链结合蛋白来提高RCA扩增效率的方 法和应用领域的空白。 【【附图说明】】
[0012] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0013]图1是本发明中IHF-β蛋白的SDS-PAGE电泳检测示意图。
[0014]图2是本发明中IHF-β蛋白的活性检测电泳示意图。
[0015]图3是本发明中以重组质粒pUC 19-hupB为模板，IHF-β蛋白对RCA扩增效率影响情 况的电泳示意图。
[0016] 图4是本发明中以单克隆（含有重组质粒pUC19-hupB)为模板，IHF-β蛋白对RCA扩 增效率影响情况的电泳示意图。 【【具体实施方式】】
[0017] 本发明涉及一种利用整合宿主因子提高滚环扩增效率的方法，制备RCA反应液，在 RCA反应液中加入IHF-β蛋白所述RCA反应液中IHF-β蛋白的浓度为0.204~4.08ngAU。
[0018] 请参阅图1~4所示，结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
[0019] 实施例1:
[0020] 1、IHF-邱勺制备
[0021]①将来源于大肠杆菌的IHF-β的基因插入pET-22b表达载体中，通过连接转化并用 菌落PCR、酶切鉴定及测序验证，即可得到重组表达载体pET-22b-IHF-i3;
[0022] ②将构建好的重组载体pET-22b-IHF-i3转化大肠杆菌BL21，取含重组质粒的阳性 菌株加入LB液体培养基中培养过夜，之后菌液按1 %比例接种到50 ml的LB培养液中，放入 37°C摇床培养至其0D值为0.6-0.8;加入IPTG，将菌液放入37°C摇床中诱导表达3小时，摇床 转速为160rpm;
[0023] ③取诱导表达后的菌液离心得到菌体，裂解，释放蛋白质。SDS-PAGE电泳检测蛋白 表达情况，电泳结果见图1。
[0024] 图 1 各泳道表不：M为PageRuler Low Range Unstained protein Ladder;IHF泳道 表示制备的IHF-β蛋白。
[0025] 由图1可以看出制备的I HF-β蛋白的大小为10.5kD，符合理论值。
[0026] ④IHF-邱勺纯化。
[0027] 利用上述方法大量培养含重组质粒的阳性菌株。菌液离心（3000 Xg)15min，收集 大肠杆菌菌体，_70