专利名称：滚环扩增加跨缺口荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒cccDNA试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乙型肝炎病毒cccDNA定量检测的方法，特别是涉及采用滚环扩 增加跨缺口荧光定量PCR技术定量检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的方法；本发明还 涉及利用此方法研制的乙型肝炎病毒cccDNA检测试剂盒。
背景技术：
乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，以下简称 为HBV cccDNA)是乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状 DNA (relaxed circular DNA, rcDNA)进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复” 形成的结构完整的、超螺旋双链DNA分子。目前HBV cccDNA检测主要方法为荧光探针检测技术，通过选择性扩增 HBVcccDNA，使检测的灵敏度和实用性得到明显提高，根据对模板的扩增方法不同分为两 类一是跨缺口实时荧光定量PCR技术(PSAD酶降解非闭合环状DNA法，不降解质粒的ATP 依赖的 DNA 酶 Plasmid safe ATP-d印endent DNase,简称为 PSAD)，二是 Invader 技术，二 者均可通过荧光标记探针进行HBV cccDNA的定量检测。PCR技术的基本原理是采用跨rcDNA缺口区引物扩增cccDNA，但为防止rcDNA在 PCR退火过程中形成可被扩增的模板，需在扩增前用PSAD消化非闭合环状DNA或采用特殊 设计的嵌合引物特异性扩增cccDNA。Invader法的基本原理是通过一条与模板完全互补 的Invader探针和一条与模板部分互补的初级探针，后者与模板互补部分与前者的3’端紧 邻；当探针与模板杂交后形成一个部分重叠的结构，进而初级探针上5’端与模板不互补的 部分被酶切割产生被称作5’ flap的核苷酸短链；在特定温度下，这一过程可以循环反复， 所产生的5’ flap按比例地将模板信号放大，并被检测5’ flap的荧光标记探针捕获。上述方法存在以下几个问题1、检测的特异性和灵敏度不强HBV cccDNA主要存在于肝细胞核中。由于HBV cccDNA的含量通常远远低于HBV 松驰环状DNA (rcDNA)，跨缺口实时荧光PCR方法和Invader方法难以保证检测的特异性和
灵敏度。2、Invader技术和跨缺口实时荧光定量PCR技术无法区分整合DNA和cccDNAHBV慢性感染特别是肝硬化患者肝组织中存在大量整合HBV DNA,即使采用目前先 进的PSAD酶消化非闭合环状DNA，仍不能保证非闭合环状DNA被完全彻底消化，也不能有效 区别cccDNA和整合HBV DNA。3、不能有效区分整合DNA、松驰环状DNA (rcDNA)和闭合环状DNA (cccDNA)。4、样本间的差异干扰数据分析，没有内参进行标准化。如北京索奥生物医药科技有限公司生产的“乙型肝炎病毒cccDNA检测试剂盒”， 上海复星医药集团出品的“HBV cccDNA PCR荧光定量检测试剂盒”，均为直接PCR扩增，不进行PSAD酶消化和滚环扩增环节，而且无内参照，不能消除不同样本间的差异，特异性和 灵敏度低。滚环扩增(rolling cycle amplification, RCA)是一种体外等温核酸扩增方法。 原理是寡核苷酸引物与环状模板结合后，在特异的聚合酶的作用下循环扩增，滚环只有在 单链闭合状态并有相应引物存在下才能同温滚动复制。2008年9月Margeridon Severine 等人首先报道运用RCA方法获得了乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(C0Valently closed circular DNA, cccDNA)全基因序歹[J (Margeridon S, Carroue ‘ e-Durantel S, Chemin I， et al. Rolling circle amplification, a powerful tool for genetic and functional studies of complete hepatitis B virus genomes from low-level infections and for directly probing covalently closed circular DNA. Antimicrob Agents Chemother, 2008,52(9) :3068)。2009年6月我们实验室也报道了应用RCA技术扩增我国慢性乙型肝炎 患者肝组织中HBV cccDNA序列(任小强，……钟彦伟等，滚环扩增在乙型肝炎病毒cccDNA 检测中的应用，2009，34 (6) =675-678) 滚环扩增(RCA)的特点是只能扩增闭合环状DNA，不能有效去除PSAD酶未消化完 全的非闭合环状DNA，所以仅用滚环扩增方法难以完成HBV cccDNA的定量检测。
发明内容
本发明是提供一种新型灵敏度高、特异性强、且简单方便的乙型肝炎病毒cccDNA 定量检测试剂盒，用于乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测。本发明克服了现有技术的缺点，研究出了采用滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR技 术检测cccDNA的方法，并以此方法为基础开发了一种新型的检测试剂盒。本方法的主要特征是从乙肝患者肝组织中提取总DNA，分别加入滚环引物和跨缺口引物，进行滚环加跨
缺口荧光定量扩增。具体操作步骤是(1)提取肝组织总DNA ；⑵设计、合成引物与探针；(3)滚环扩 增加跨缺口荧光定量cccDNA ； (4)加入内参照标准化，消除样本间的差异。所述跨缺口荧光定量扩增技术，优选为Taqman跨缺口荧光定量扩增。若在进行滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR方法之前，先在单管中进行不降解质粒 的ATP依赖的DNA酶(Plasmid safe ATP-dependent DNase，简称为PSAD)消化非闭合环状 DNA，则检测效果更好。本方法可将肝穿组织作为检测样本。本发明研发了可以区别整合HBV DNA,HBV rcDNA和cccDNA的滚环扩增+跨缺口荧 光定量PCR新技术，突破了以往所用方法灵敏度不高、特异性不强、不能有效区分整合DNA、 松驰环状DNA (rcDNA)和闭合环状DNA (cccDNA)的技本瓶颈。当血清中HBVDNA含量用现有 技术方法无法检测到时，用本方法仍可检测到肝组织中HBV cccDNA，最低可检测0. 1拷贝/ 肝细胞。通过对140例慢性乙型肝炎和HBV感染相关肝硬化、肝癌患者的肝组织的检测，30 例非乙型肝炎患者肝组织的检测，以及200余例HBV感染患者及健康人血清的检测，表明我 们建立的检测方法具有良好的特异性、灵敏度和稳定性。本方法可以完全排除rcDNA和整合HBV DNA的干扰，对肝穿组织cccDNA进行检测。
本发明扩增线性范围宽相同PCR条件下，扩增标准品DNA浓度范围IO2-IOltl拷贝 /毫升(图1)。与现有技术的检测产品相比，本发明具有较好的特异性、灵敏度和稳定性1、与北京索奥生物医药科技有限公司“乙型肝炎病毒cccDNA扩增检测试剂盒 (PCR-荧光探针法)，直接PCR扩增”相比较，增加了 PSAD酶消化和滚环扩增环节，增加了内 参照以消除不同样本间的差异，特异性和灵敏度大大提高。当血清中HBV DNA含量用现有 技术方法无法检测到时，用本方法仍可检测到肝组织中HBV cccDNA，最低可检测0. 1拷贝/ 肝细胞(见实施例1)。索奥生物医药科技有限公司试剂盒需要受检者肝组织约100-500mg 左右，本实验仅需受检者肝组织5mg (见实施例1)。2、与上海复星医药集团“HBV cccDNA PCR荧光定量检测试剂盒”相比较，该试剂盒 仅用于血清样本检测，没有PSAD酶消化和滚环扩增环节，没有设置内参，不能保证cccDNA 检测的灵敏度和特异性，不能消除不同样本间的差异。本发明的有益效果是1、灵敏度高检测cccDNA标准品灵敏度达到IO2拷贝/毫升。当乙肝患者血清中HBV DNA含量 用现有技术方法无法检测到时，用本方法仍可检测到肝组织中HBV cccDNA，最低可检测0. 1 拷贝/肝细胞。从附图2可以看出，滚环扩增(RCA)后检测灵敏度大大增强。2、特异性强通过PSAD酶消化，去除非闭合环状DNA的干扰，在此基础上进行滚环扩增加跨缺 口 PCR，进一步去除PSAD酶未消化完全的非闭合环状DNA和整合DNA，进一步增强了特异性。3、重复性、稳定性好从实施例给出的实验结果可证实，以10个梯度稀释的质粒PCP10DNA (标准品)为 样本，每个样本分别进行6次重复实验，组内组间差异无显著性(p<0. 05)。对临床来源的 10份样本进行4次重复检测，组内组间差异无显著性(P < 0. 05)。4、污染性小PSAD酶消化和滚环扩增在单管中进行，使操作过程和结果分析更简便、省时，减少 污染机会。5、检测结果误差小设置内参，消除样本间的差异干扰数据分析。本发明的HBV cccDNA检测试剂与现有技术产品方法比较用本发明的方法可以制备检测乙型肝炎病毒cccDNA的试剂及试剂盒。所述试剂 盒中除常规检测试剂盒应有的试剂、工具外，还具有PSAD酶，Phi29DNA聚合酶，滚环引物及 相关缓冲液等。PSAD 酶(Plasmid safe ATP-d印endent DNase，Epicentre 产品)，Phi29DNA 聚合酶(New England Biolab产品)、滚环引物(见实施例方法中2设计、合成引物与探针)
图1是HBV cccDNA标准曲线，线性范围IO2-IOiq拷贝/毫升；
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图2是不同检测方法扩增电泳图，其中I 以梯度稀释的PCPlO质粒DNA为模板，PSAD消化后直接跨缺口荧光定量PCR ；II 以梯度稀释的PCPlO质粒DNA为模板，经PSAD消化后用RCA+跨缺口荧光定量 PCR扩增；图3是部分乙肝患者肝组织样本中总HBV DNA和cccDNA的定量结果比较；图4是HBeAg阳性与HBeAg阴性乙肝患者肝组织cccDNA水平的比较；图5是HBeAg阳性与HBeAg阴性乙肝患者肝组织总HBV DNA水平的比较；
具体实施例方式以下实施例中提到的PSAD酶和Phi29DNA聚合酶分别购自Epicentre和New England Biolab，滚环引物见实施例方法2实施例1滚环扩增加跨缺口实时荧光定量PCR检测乙肝患者肝组织cccDNA一、研究样本研究对象为解放军302医院2008年5月 2009年5月期间140例慢性乙型肝炎 患者，其中男93例，女47例，年龄范围3 68岁。诊断符合2000年第十次全国病毒性肝 炎会议修订的病毒性肝炎诊断标准，排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒及输血传播病毒、巨 细胞病毒、EB病毒感染以及酒精性、药物性、自身免疫性肝病。另收集非乙肝患者肝组织样 本作为阴性对照。二、方法1、提取肝组织总DNA 取新鲜冰冻肝组织5mg，采用德国Qiagen公司DNA提取试剂盒提取DNA。组织研 碎后，加入180微升裂解buffer重悬样品；加入20微升蛋白酶K，涡旋混勻；56度孵育3小 时后70度孵育10分钟。加入200微升AL buffer,涡旋使之充分混勻；加入200微升无水 乙醇，涡旋使之充分混勻；将上述样品全部加入到柱子中，8000转离心1分钟，弃滤液；柱子 放入新的收集管；小心开盖并加入500微升AWlbuffer，8000转离心1分钟，弃滤液；柱子放 入新的收集管。小心开盖并加入500微升AW2bufTer，8000转离心1分钟，弃滤液；将柱子 放入新的收集管，14000转离心3分钟，使滤膜干透，弃滤液；将柱子移入新的EP管中，加入 60-100微升ATE，室温孵育15分钟，8000转离心1分钟，收集洗脱液，储存_20度冰箱。2、设计、合成引物与探针根据我国常见的HBV基因型B，C基因组全序列，设计引物及探针RCAlAATCCTCACAATA*C*C99-113
RCA2ACCTATTCTCCTOOC1758-1744
RCA3CCTATGGGAGTGG*G*C510-524
RCA4CCTTTGTCCAAGG*G*C2689-2675
RCA5ATGCAACTTTTTC*A*C1686-1700
RCA6CTAGCAGAGCTTG*G*T29-15
RCA7TAGAAGAAGAACT*C*C2240-2254
RCA8GGGCCCACATATT*G*T2599-2585
p82 5-GGGGCGCACCTCTCTTTA-31523-1540
p83 5-AGGCACAGCTTGGAGGC-31886-1870探针5-FAM-TCACCTCTGCCTAATCATCTC-TAMRA-31825-18453、Plasmid safe ATP_d印endent DNase 酶消化设定反应体系为样品DNA 6. 8 μ 1，PSAD酶0.4 μ 1，ATP应用液0.8 μ 1，反应缓冲 液2μ 1。反应条件为37°C 30min，70°C灭活30min。4、滚环扩增上述产物作为模板力口入RCAl、RCA2、RCA3、RCA4、RCA5、RCA6、RCA7、RCA8 八个弓 | 物，每个引物 0. 0625 μ 1，共 0. 5μ 1。95°C 3min，50°C 15s, 30 °C 15s, 20 °C IOmin ；再加入上 述八个引物0. 0625 μ 1/每个引物，共 0.5 μ 1，Phi29DNA 聚合酶 1μ 1，Phi29bufferl μ 1， BSA 0. 2μ 1，d NTP 1. 6 μ 1，无菌去离子水 4. 2 μ 1。30°C 16 个小时。5、跨缺口荧光定量cccDNA 取上述产物3μl，dNTP5y l，Mg2+3. 5mM，PCR缓冲液2. 5 μ 1，跨缺口引物0. 5 μ 1 (终 浓度5 μ Μ)，Taq酶2. 5U，探针0. 2 μ 1 (终浓度2 μ Μ),剩余体积用无菌去离子水补足，总体 系为 25μ 1，94°C 3min，94°C 10s，60°C 45s，单采光，40 个循环。标准曲线由已知浓度的质粒PCP10DNA梯度稀释后建立。6、加入内参照标准化，消除样本间的差异设计内参β-actin的引物β-up、β-down和探针，扩增内参β-actin基因。反 应体系和条件同上。7、特异性、灵敏度和可重复性实验分别用有文献报道的方法PSAD消化HBV非闭合环状DNA后直接用跨缺口荧光定 量PCR法及PSAD消化HBV非闭合环状DNA后用RCA+跨缺口荧光定量法(本发明方法)进 行cccDNA定量，检测本研究方法的特异性；同时以10个梯度稀释的质粒PCP10DNA(标准 品)为样本，每个样本分别进行6次重复实验，检测组内组间差异；对临床来源的10份样本 分别进行4次重复实验，检测组内组间差异。此外还以梯度稀释的已知浓度DNA为模板，评 价本方法的检测灵敏度和线性范围。以非乙肝患者肝组织及血清DNA作为阴性对照。8、HBeAg阳性及阴性乙肝患者HBV cccDNA检测采用PSAD消化后用RCA+跨缺口 PCR方法分别对140例HBeAg阳性及阴性患者进 行cccDNA水平检测，同时检测相应样本肝组织中总HBV DNA含量及血清中HBV DNA含量。9、统计学分析应用SPSS16. 0软件完成，通过线性相关、Pearson检验及直线回归分析等方法对 数据进行分析。三、实验结果1、标准曲线的建立如附图1所示。标准曲线相关系数达0. 994，线性范围IO2-IOiq拷贝/毫升。2、方法特异性、灵敏度和稳定性实验以梯度稀释的已知浓度的PCP10HBV基因组重组质粒DNA为模板，分两组进行本方 法特异性实验，I组PCP10质粒DNA经PSAD消化后直接跨缺口荧光定量PCR (文献报道方 法)；II组PCPlO质粒DNA经PSAD消化后用RCA+跨缺口荧光定量PCR扩增(本发明方 法)；1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，如图2所示，梯度稀释PCPlO质粒DNA经过RCA
7反应之后电泳条带(图211)明显亮于未经RCA反应的相应电泳条带(图21)；以非乙型肝 炎病人肝组织及血清DNA作为阴性对照，均未检测出条带。表明本发明方法具有较好的特 异性。当血清中HBV DNA含量用现有技术方法无法检测到时，用本方法仍可检测到肝组织 中HBV cccDNA，最低可检测0. 1拷贝/肝细胞。表明本发明具有较好的灵敏度。采用本发明方法，以10个梯度稀释的质粒PCP10DNA(标准品)为样本，每个样本 分别进行6次重复实验，组内组间差异无显著性(ρ < 0. 05)。对临床来源的10份样本进行 4次重复检测，组内组间差异无显著性(ρ <0.05)。表明本方法稳定性及可重复性较好。3、肝组织中总HBV DNA和cccDNA水平的比较对140例患者进行肝组织cccDNA、总 HBV DNA、血清中HBV DNA定量，以β-actin为内参照，参照文献报道的每个细胞中含有人 类基因组DNA6. 667pg进行细胞数的计算。利用1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测条带是否为目的 条带，非乙肝患者肝组织及血清DNA作为阴性对照。肝组织总HBV DNA和cccDNA水平的检 测部分结果比较见图3，二者间呈正相关(ρ < 0. 05)。通过分析140例乙肝患者肝组织中cccDNA含量可知，肝组织中cccDNA含量大多 集中于10 100拷贝/细胞，且肝组织中cccDNA的含量与肝组织中HBV总DNA量成正相 关(P < 0. 01)，符合理论要求。本实施例还针对肝细胞中的cccDNA含量与血清HBV DNA含 量的相关性进行了分析，分析结果显示HBeAg阳性患者肝组织HBV cccDNA与血清中总HBV DNA水平相关。HBeAg阳性患者肝组织HBV cccDNA及HBV DNA水平都高于HBeAg阴性患者 (P < 0. 05)(图 4、图 5)。四、实验结论通过与已有文献报道的检测方法进行对比，可以看出以梯度稀释的PCPlO质粒 DNA为模板，经过RCA加跨缺口 PCR反应之后电泳条带(图211)明显亮于未经RCA反应电 泳条带(图21)；以非乙型肝炎病人肝组织DNA及血清DNA作为阴性对照，均未检测出条带。 对部分样本进行批内及批间检测，证明该方法的可重复性较好(P < 0. 05)，稳定性达到临 床应用要求。通过分析140例病人的肝组织中cccDNA含量可知，肝组织中cccDNA含量大多集 中于10 100拷贝/细胞，且肝中cccDNA的含量与肝中HBV总DNA量成正相关(P < 0. 01)， 符合理论要求。相关文献显示HBV cccDNA与HBeAg阳性与否关系密切，本实施例HBeAg阳 性患者肝内HBV DNA及HBV cccDNA水平都高于HBeAg阴性患者(P < 0. 05)。滚环扩增(RCA)的特点是只能扩增闭合环状DNA，因而用来扩增HBV cccDNA可提 高检测的特异性；通过PSAD酶消化，可去除非闭合环状DNA和整合DNA的干扰。由于HBV cccDNA的含量通常较低，滚环扩增具有在相应引物存在下能同温滚动复制的特征，在PSAD 酶消化基础上进行滚环扩增，可以大大提高检测的灵敏度；加上跨缺口 PCR，进一步去除 PSAD酶未消化完全的非闭合环状DNA，进一步增强了特异性。综上证实，本方法具有较好的特异性、灵敏性和稳定性。
权利要求
一种乙型肝炎病毒cccDNA定量检测的方法，特征是将肝组织提取的总DNA分别加入滚环引物和跨缺口引物后，进行滚环加跨缺口荧光定量扩增。
2.权利要求1所述的方法，操作步骤是(1)提取肝组织总DNA； (2)设计、合成引物与 探针；⑶滚环扩增；⑷跨缺口荧光定量cccDNA ； (5)加入内参照标准化，消除样本间的差已
3.权利要求1或2所述的方法，所述跨缺口荧光定量扩增技术，是Taqman跨缺口荧光定量扩增。
4.权利要求1或2所述的方法，在加入滚环引物和跨缺口引物之前，先在单管中进行不 降解质粒的ATP依赖的DNA酶消化非闭合环状DNA。
5.一种乙型肝炎病毒cccDNA定量检测试剂盒，其特征是含有PSAD酶、Phi29DNA聚合 酶和滚环引物。
6.权利要求5所述的试剂盒，其检测方法是在单管中将肝组织总DNA分别加入PSAD 酶、Phi29DNA聚合酶和滚环引物，进行滚环扩增。
全文摘要
本发明涉及一种乙型肝炎病毒cccDNA定量检测的方法，采用滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR技术检测cccDNA的方法定量检测乙型肝炎病毒cccDNA，并以此方法开发了一种新型的检测试剂盒。本发明可同时提高检测反应特异性和灵敏度。
文档编号G01N21/64GK101948932SQ20101023728
公开日2011年1月19日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者任晓强, 徐东平, 苏何玲, 钟彦伟, 韩佳琪 申请人:中国人民解放军第三〇二医院