GmBRI1蛋白及其基因在培育转基因植物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种GmBRI1蛋白及其基因在培育转基因植物中的应用。本发明提供了如下1）-3）中任一种物质在调控植物株高或培育株型改变的植物中的应用：1）蛋白GmBRI1；2）编码蛋白GmBRI1的DNA分子；3）含有编码蛋白GmBRI1的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述蛋白GmBRI1的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，转入GmBRI1的拟南芥bri1-5植株能够从极端矮化的形态回复到野生型拟南芥植株的形态，并出现多种介于极端矮化和正常株高之间的半矮杆形态，转入GmBRI1的拟南芥bri1-5植株的株高高于突变体bri1-5。这说明GmBRI1是有功能的油菜素内酯受体蛋白，GmBRI1蛋白及其编码基因可用于调节植物株高。
【专利说明】GmBRM蛋白及其基因在培育转基因植物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种GmBRIl蛋白及其基因在培育转基因植物中的应用。
【背景技术】 [0002]随着人口的快速增长，全世界的粮食安全面临严峻挑战。因此，高产一直作为作物育种的首要目标。而高产和倒伏的矛盾制约着作物产量的进一步提高。二十世纪六十年代的“绿色革命”使世界粮食总产在短时间内大幅度提高，这有赖于小麦、水稻半矮杆新品种的推广应用。这种半矮杆品种因植株高度大大降低而表现出抗倒伏能力强、产量潜力大等显著特点，可以进行高密度种植而获得高产。之后的研究发现，这种半矮杆株型是由于植物激素赤霉素的合成或信号途径改变导致的。“绿色革命”的启示是:要使作物产量再次大幅度提高，必须对产量赖以形成的植物总体的生长发育状况进行重大调控。自此，更多研究开始关注这类控制或影响植物生长发育和产量形成的物质——植物激素。在众多激素中，油菜素内酯备受关注，因大量证据表明，对油菜素内酯合成和信号途径成分的调控可以构建半矮杆株型，从而提高植株的抗倒伏性，提高产量。
[0003]油菜素内酯(BrassinosteiOids，BRs)又称芸苔素内酯或芸苔素，是一种甾体化合物，对植物生长发育有多方面的调节作用，如促进细胞伸长与分裂，暗形态发生，光形态建成，木质部分化，种子萌发和提高抗逆性等。被称为“第六大植物生长激素”。在BR信号转导途径中，油菜素内酯受体蛋白发挥了重大作用，它定位在细胞膜上，一方面感受和结合细胞外的油菜素内酯信号，另一方面在膜内通过一系列的磷酸化和去磷酸化反应激活下游转录因子BZR1/BESI，BZR1/BESI进入细胞核与DNA结合，调控BR响应基因的表达。近年来对油菜素内酯受体蛋白的研究发现，通过分子手段，对油菜素内酯受体蛋白基因brassinosteroid insensitivel (BRIl)进行遗传操作，能够调控植物的形态建成，获得株型适中且产量不受影响的植株，具有巨大的高产潜力。
[0004]大豆是世界上最为重要的油料作物和高蛋白粮食作物。而倒伏问题一直是困扰大豆高产稳产的主要问题之一。倒伏使大豆平均减产56.1%，当倒伏发生在开花或结荚期时减产率会更高。以往育种者通过常规育种手段改良和调节株型，增强作物的抗倒伏性，挖掘高产潜能。近年来，随着生物技术的发展，可以通过分子手段，调控株型性状相关基因如BRI基因的表达，设计和改造作物株型，为培育高产大豆品种创造条件。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供如下I) -3)中任一种物质的应用。
[0006]本发明提供如下I)_3)中任一种物质的在调控植物株高或培育株型改变的植物中的应用:
[0007]I)蛋白 GmBRI I ；
[0008]2)编码蛋白GmBRI I的DNA分子；[0009]3)含有编码蛋白GmBRIl的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
[0010]所述蛋白GmBRIl的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0011]上述应用中，所述编码蛋白GmBRIl的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I ;
[0012]所述含有编码蛋白GmBRIl的DNA分子的重组载体为将所述编码蛋白GmBRIl的DNA分子替换掉表达载体pTFlOl.1-GFP中的GFP基因，得到的重组载体。
[0013]在本发明的实施例中，重组载体为将序列表中序列I所示的编码蛋白GmBRIl的DNA分子替取代表达载体pTFlOl.1-GFP的XbalI和Kpn I酶切位点间的片段(GFP)得到的
重组载体。
[0014]载体pTFlOl.1-GFP按照如下方法制备:将GFP表达盒(其核苷酸序列如序列表中序列15所示)插入载体pTFlOl.1的Hind III和EcoR I酶切位点间得到的载体。
[0015]上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0016]上述应用中，所述双子叶植物为拟南芥。
[0017]上述应用中，所述调控植物株高为提高植物株高，植物为拟南芥突变体bril-5。
[0018]本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0019]本发明提供的方法，为将编码蛋白GmBRIl的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的株高高于所述目的植物；
`[0020]所述蛋白GmBRIl的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0021 ] 上述方法中，所述编码蛋白GmBRI I的DNA分子通过重组载体导入目的植物；
[0022]所述重组载体为将所述编码蛋白GmBRIl的DNA分子替换掉表达载体pTFlOl.1-GFP中的GFP基因，得到的重组载体。
[0023]在本发明的实施例中，重组载体为将序列表中序列I所示的编码蛋白GmBRIl的DNA分子替取代表达载体pTFlOl.1-GFP的Xba II和Kpn I酶切位点间的片段(GFP)得到的重组载体。
[0024]载体pTFlOl.1-GFP按照如下方法制备:将GFP表达盒(其核苷酸序列如序列表中序列15所示)插入载体pTFlOl.1的Hind III和EcoR I酶切位点间得到的载体。
[0025]上述方法中，所述编码蛋白GmBRIl的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I。
[0026]上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0027]上述方法中，所述双子叶植物为拟南芥突变体bril-5。
[0028]本发明的实验证明，本发明构建了 GmBRIl的过表达载体，并将其转入拟南芥油菜素内酯受体缺失突变体bril-5植株中，实验证明，转入GmBRIl的拟南芥bril-5植株能够从极端矮化的形态回复到野生型拟南芥植株的形态，并出现多种介于极端矮化和正常株高之间的半矮杆形态，转入GmBRIl的拟南芥bril-5植株的株高高于突变体bril-5。这说明GmBRIl是有功能的油菜素内酯受体蛋白，GmBRIl蛋白及其编码基因可用于调节植物株高。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为GmBRIl的cDNA的PCR扩增产物电泳图谱
[0030]图2为GmBRI I在大豆不同组织中的表达[0031]图3为重组载体pTFlOl.1-GmBRIl的质粒图谱
[0032]图4为T3代转基因拟南芥植株中目基因的PCR产物电泳结果
[0033]图5为T3代转基因拟南芥植株的表型鉴定结果
[0034]图6为T3代转基因拟南芥植株的株高分析结果
[0035]图7为T3代转基因拟南芥植株中目的基因半定量RT-PCR产物电泳结果【具体实施方式】
[0036]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由北京华大公司完成。
[0039]实施例1、蛋白GmBRIl及其编码基因在调节植物株高中的应用
[0040]一、蛋白GmBRIl及其编码基因的获得
[0041 ] 1、蛋白GmBRII及其编码基因GmBRII的获得
[0042]用拟南芥油菜素内酯受体蛋白AtBRIl (基因库序列号:AAC49810)的氨基酸序列在大豆序列数据库中比对，找到同源性较高的蛋白质及其对应的核苷酸序列。发现GmBRIl(Glyma06gl5270)是AtBRII的同源基因，且与拟南芥AtBRII基因一样，没有内含子。
[0043]提取大豆Williams82 (Haun, ff.J., Hyten, D.L., Xu, ff.ff., Gerhardt, D.J., Albert, T.J., Richmond, T., Jeddeloh, J.A., Jia, G.F., Springer, N.M., Vance, C.P.&Stupar, R.M.(2011).The Composition and Origins of Genomic Variationamong Individuals of the Soybean Reference Cultivar ffiIliams82.PlantPhysiologyl55, 645-655.国家种质库编号:I2A12645，统一编号:WDD00587，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)的基因组DNA，用引物Pl (其核苷酸序列为序列表中的序列3)和P2 (其核苷酸序列为序列表中的序列4)进行PCR扩增。
[0044]PCR反应体系如下:
[0045]
【权利要求】
1.如下1)-3)中任一种物质在调控植物株高或培育株型改变的植物中的应用: 1)蛋白GmBRIl ； 2)编码蛋白GmBRIl的DNA分子； 3)含有编码蛋白GmBRIl的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述蛋白GmBRIl的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述编码蛋白GmBRIl的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I ; 所述含有编码蛋白GmBRIl的DNA分子的重组载体为将所述编码蛋白GmBRIl的DNA分子替换掉表达载体pTFlOl.1-GFP中的GFP基因，得到的重组载体。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述双子叶植物为拟南芥。
5.一种培育转基 因植物的方法，为将编码蛋白GmBRIl的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物的株高高于所述目的植物； 所述蛋白GmBRIl的氨基酸序列为序列表中的序列2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述编码蛋白GmBRIl的DNA分子通过重组载体导入目的植物； 所述重组载体为将所述编码蛋白GmBRIl的DNA分子替换掉表达载体pTFlOl.1-GFP中的GFP基因，得到的重组载体。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述编码蛋白GmBRIl的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I。
8.根据权利要求5-7任一所述的方法，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述双子叶植物为拟南芥突变体bril-5。
【文档编号】C12N1/19GK103710379SQ201410005260
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】王妙, 韩天富, 王庆钰, 孙 石, 吴存祥, 蒋炳军, 侯文胜 申请人:中国农业科学院作物科学研究所