一种汞离子的超灵敏检测方法及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种汞离子的超灵敏检测方法及检测试剂盒。本发明将基于核酸外切酶III介导的信号放大技术与试纸条检测技术相结合，构建一种痕量汞离子的快速检测方法。本方法具有很高的灵敏度，对汞离子的检测限为10pM，检测结果直观，肉眼可见，检测过程方便、迅速，可用于汞离子的实地现场检测；此外，本发明的检测方法具有很好的特异性，常见的其他金属离子对检测不产生影响；构建得到的检测试纸条使用起来省时、省力，检测速度快且操作简单方便，检测结果直观，肉眼可见，不需要使用任何仪器。
【专利说明】一种汞离子的超灵敏检测方法及检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分析化学【技术领域】，具体涉及一种核酸外切酶III介导的信号放大用于痕量汞离子的快速检测方法。
【背景技术】
[0002]汞离 子(Hg2+)是一种普遍存在的重金属污染源，对人体危害严重，是环境监测的重要指标。汞离子接触可不同程度地对健康造成一系列有害影响，包括肾脏衰竭、大脑受损、神经系统以及免疫系统损伤。美国环境保护署规定饮用水中汞离子的最大允许量不得超过ΙΟηΜ。目前，汞离子的常规检测方法主要有原子吸收法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法等。但是这些方法操作繁琐，需要麻烦的前处理、专门的分析技术人员以及昂贵的仪器，不利于现场快速分析检测。近年来，利用汞离子能与DNA中的胸腺嘧啶(thymine, T)特异性地结合，形成T-Hg2+-T复合物，设计了一系列传感器用于汞离子的检测(Ono, A and Togashi,H.Angew.Chem.1nt.Ed., 2004,43,4300-4302)。但是潜在的缺点是检测灵敏度低，难以满足环境样品检测的需要，因此需要通过信号放大来提高检测灵敏度。
[0003]核酸外切酶III (exonuclease III,Exo III)能从双链DNA中的3'末端开始逐步切去单核苷酸。该酶的最适底物是双链DNA中的平齐末端或3'凹馅末端DNA，对单链DNA没有活性，也不能切割双链DNA中的3'突出末端(Zuo, X.；Xia, F.；Xiao, Y and Plaxco，K.ff.J.Am.Chem.Soc.，2010，132，1816-1818)。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于将基于核酸外切酶III介导的信号放大技术与试纸条检测技术相结合，构建一种痕量汞离子的快速检测方法。该方法具有很高的灵敏度和特异性，操作简单，检测迅速，检测过程无需使用任何仪器。
[0005]本发明所采取的技术方案是:
[0006]一种汞离子的超灵敏检测方法，包括如下步骤
[0007](I)构建茎环结构DNA:所述茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，凸出部分含有T碱基；
[0008](2)构建辅助DNA:所述辅助DNA的5’端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的3’端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA，并形成含有3’平末端的部分互补的双链DNA ；
[0009](3)将待检样品与茎环结构DNA、辅助DNA混合后，静置反应；
[0010](4)往步骤(3)的反应液中加入核酸外切酶III，在有汞离子存在的情况下，茎环结构DNA和辅助DNA通过T-Hg2+-T复合物互补，形成含有3’平末端的部分互补双链DNA，核酸外切酶III能与部分互补的双链DNA中的3’平末端结合，从而开始切割反应，释放单核苷酸以及汞离子，最后释放出单链DNA，所述单链DNA含有茎环结构DNA的环状区和5’端茎状区；[0011](5)通过检测步骤(4)释放出的单链DNA来判断待检样品中是否含有汞离子。
[0012]在汞离子存在的情况下，辅助DNA的5’段与茎环结构DNA的3’端的突出部分及部分茎状区互补，且辅助DNA的3’末端有至少4个碱基不能与茎环结构DNA互补形成平末端。
[0013]作为优选的，所述茎环结构DNA中，环状区部分的碱基数为9~12，茎状区部分的碱基数为18~21个,?状区的碱基数比环状区的碱基数多。
[0014]作为优选的，所述茎环结构DNA的突出部分以及辅助DNA的5’端均含有I~5个
T碱基。
[0015]步骤(5)可采用电化学法、荧光法、比色法、电化学发光法或试纸条法检测释放出的单链DNA。
[0016]作为优选的，步骤(5)采用试纸条法检测释放出的单链DNA，所用试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
[0017]所述金标垫上喷射有金标DNA探针I，所述金标DNA探针I与茎环结构DNA的环状区互补；
[0018]所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的5’端茎状区互补；
[0019]所述质检区上固定有DNA探针3,所述DNA探针3与DNA探针I互补。
`[0020]一种汞离子的超灵敏检测试剂盒，其包括:
[0021](I)茎环结构DNA:所述茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，凸出部分含有T碱基；
[0022](2)辅助DNA:所述辅助DNA的5’端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的3’端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA，形成含有3’平末端的部分互补的双链DNA ；
[0023](3)核酸外切酶III ;
[0024](4)检测试纸条。
[0025]所述检测试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；
[0026]所述金标垫上喷射有金标DNA探针I，所述金标DNA探针I与茎环结构DNA的环状区互补；
[0027]所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的5’端茎状区互补；
[0028]所述质检区上固定有DNA探针3,所述DNA探针3与DNA探针I互补。
[0029]所述DNA探针2用链霉亲和素与生物素修饰。
[0030]所述DNA探针3用链霉亲和素与生物素修饰。
[0031]下面举例介绍一下本发明方法的技术原理:
[0032]如图1所示，茎环结构的DNA包含有4个功能区域，分别是1、2、4、和2*区域，其中2和2*是互补的，形成茎环结构的茎状区；4为茎环结构的环状区。在DNA中，5’端用小正方形表示，3’端用箭头表示。茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，即为I区域。在I区域中含有I~5个T碱基。辅助DNA包含有3个区域(1*、2*和3*)，其中在区域I*中也含有I~5个T碱基。在有Hg2+存在时，茎环结构DNA的I区域通过形成T-Hg2+-T复合物与辅助DNA的I*区域结合，在茎环结构DNA的3’末端形成平末端，并开始介导DNA链置换反应，打开茎环结构，使辅助DNA的2*区域和茎环结构DNA的2区域结合，形成更长的部分互补的双链DNA(1*和I互补，2*和2互补)。然后加入核酸外切酶IIKExo III)进行信号放大(图1，反应b)。Exo III能与部分互补的双链DNA中的3’平末端结合，从而开始切割反应，释放单核苷酸以及汞离子，最后释放出单链DNA(包含2*区域、4区域以及部分2区域)。同时由于部分互补双链DNA中的辅助DNA3’端的3*区域不与茎环结构DNA互补形成平末端，因此Exo III不会切割辅助DNA。最终，切割反应后辅助DNA被释放出来，汞离子也被释放出来，从而可以开始下一轮的反应(图1，反应C)。最后形成大量的单链DNA，可采用电化学法、荧光法、比色法、电化学发光法或试纸条法检测释放出的单链DNA。下面将介绍其中的试纸条法。
[0033]如图2所示，检测试纸条包含4个部分:样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，这四个部分从左到右依次固定于胶板上(如图2所示)。DNA探针I (DNApiObel)的5’端用巯基(-SH)修饰，固定在金纳米颗粒(AuNPs)上，形成的AuNPs-DNA probe I复合物喷射在金标垫上。硝酸纤维素膜上划有两个检测区域:检测区和质控区，其中检测区固定的是链霉亲和素(SA)-生物素(biotin)-DNA探针2 (SA-biotin-DNA probe2)，质控区固定的是链霉亲和素(SA)-生物素(biotin)-DNA 探针 3 (SA-biotin-DNA probe3)。其中 DNA probe I的4*区域与茎环结构DNA的4区域是互补的；DNA probe2的2区域与茎环结构DNA的2*区域是互补的；DNAprobe3与DNAprobel互补。
[0034]将上面得到的单链DNA滴于试纸条的样品垫，通过毛细管迁移作用向前移动，经过金标垫时， 单链DNA的4区域与DNAprobel的4*区域杂交,形成复合物。该复合物继续往前移动，通过检测区时，单链DNA的2*区域会与固定在检测区的SA-biotin-DNA probe2相互作用，从而抓住该复合物，使其在检测区聚集。聚集的金纳米颗粒形成肉眼可见的红色区域。过量的AuNPs-DNA probe I复合物会与质控区上的DNAprobe3杂交,在质控区聚集,从而质控区也呈红色。也就是说有汞离子存在时候，检测区和质控区都显示红色。当没有汞离子存在时，茎环结构的DNA和辅助DNA不会相互作用，Exo III无法作用于茎环结构DNA，因而没有单链DNA形成。从而检测区没有红色出现，而质控区始终显示红色，表明组装的试纸条可用。
[0035]本发明的有益效果是:
[0036](I)Exo III能介导信号放大过程，使汞离子可不断循环，达到高灵敏检测的目的；
[0037](2)本发明所述的汞离子的检测方法具有很高的灵敏度，对汞离子的检测限为ΙΟρΜ，检测结果直观，肉眼可见，检测过程方便、迅速，可用于汞离子的实地现场检测；
[0038](3)本发明所述的汞离子检测方法具有很好的特异性，常见的其他金属离子对检测不产生影响；
[0039](4)本发明的试纸条检测方法使用起来省时、省力，检测速度快且操作简单方便，不需要使用任何仪器，不需要专业的技术人员，无须培训即可推广使用。
【专利附图】
【附图说明】[0040]图1为Exo III介导的信号扩增示意图；
[0041]图2为试纸条检测示意图；
[0042]图3为对不同浓度的汞离子检测的结果图；
[0043]图4为特异性实验结果图。
【具体实施方式】
[0044]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0045]实施例1 一种汞离子的超灵敏检测试剂盒的构建
[0046]一、茎环结构DNA与辅助DNA的设计
[0047]茎环结构DNA的序列如SEQ ID NO:1所示,其结构如下:
[0048]
【权利要求】
1.一种汞离子的超灵敏检测方法，包括如下步骤 (1)构建茎环结构DNA:所述茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，凸出部分含有T碱基； (2)构建辅助DNA:所述辅助DNA的5’端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的3’端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA，并形成含有3’平末端的部分互补的双链DNA ； (3)将待检样品与圣环结构DNA、辅助DNA混合后，静直反应； (4)往步骤(3)的反应液中加入核酸外切酶III，在有汞离子存在的情况下，茎环结构DNA和辅助DNA通过T-Hg2+-T复合物互补，形成含有3’平末端的部分互补双链DNA，核酸外切酶III能与部分互补的双链DNA中的3’平末端结合，从而开始切割反应，释放单核苷酸以及汞离子，最后释放出单链DNA，所述单链DNA含有茎环结构DNA的环状区和5’端茎状区； (5)通过检测步骤(4)释放出的单链DNA来判断待检样品中是否含有汞离子。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在汞离子存在的情况下，辅助DNA的5’段与茎环结构DNA的3’端的突出部分及部分茎状区互补，且辅助DNA的3’末端有至少4个碱基不能与茎环结构DNA互补形成平末端。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述茎环结构DNA中，环状区部分的碱基数为9~12,?状区部分的碱基数为18~21个,?状区的碱基数比环状区的碱基数多。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述茎环结构DNA的突出部分以及辅助DNA的5’端均含有I~5个T碱基。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)可采用电化学法、荧光法、t匕色法、电化学发光法或试纸条法检测释放出的单链DNA。
6.根据权利要求1或5所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)采用试纸条法检测释放出的单链DNA，所述试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸； 所述金标垫上喷射有金标DNA探针I，所述金标DNA探针I与茎环结构DNA的环状区互补； 所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的5’端茎状区互补； 所述质检区上固定有DNA探针3,所述DNA探针3与DNA探针I互补。
7.一种汞离子的超灵敏检测试剂盒，其包括: (1)茎环结构DNA:所述茎环结构DNA的3’端适当延伸，凸出在茎环结构外，凸出部分含有T喊基； (2)辅助DNA:所述辅助DNA的5’端含有T碱基，在有汞离子存在时能与茎环结构DNA的3’端通过形成T-Hg2+-T复合物互补，从而打开茎环结构DNA，形成含有3’平末端的部分互补的双链DNA ； (3)核酸外切酶III； (4)检测试纸条。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于所述检测试纸条包括样品垫、金标垫、含有检测区和质控区的硝酸纤维素膜以及吸水纸；所述金标垫上喷射有金标DNA探针I，所述金标DNA探针I与茎环结构DNA的环状区互补； 所述检测区上固定有DNA探针2，所述DNA探针2与茎环结构DNA的5’端茎状区互补； 所述质检区上固定有DNA探针3,所述DNA探针3与DNA探针I互补。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA探针2用链霉亲和素与生物素修饰。
10.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA探针3用链霉亲和素与生物素修饰。
【文档编号】C12Q1/68GK103773856SQ201410005177
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】陈俊华, 周顺桂, 温俊林 申请人:广东省生态环境与土壤研究所