专利名称：大豆GmPHR1基因及其编码的蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种大豆GmPHRl基因，其编码的蛋白 和应用。
背景技术：
在植物所需17种必需元素中，磷对于植物新陈代谢和正常生长发育具有极其重 要作用。同时，由于耕地土壤所特有的“遗传学缺磷”现象，使得磷素缺乏已经成为影响作物 产量提高和品质改良的重要限制因子。发挥植物自身潜力，通过现代基因克隆技术分离磷 高效基因，并通过转基因技术将其转入不同作物中，从而培育磷高效作物新品种是解决上 述问题的重要途径。目前，已克隆的磷高效基因主要包括以下几类(1)磷高效相关转录因 子基因，如CrPSRl，AtPHRl，OsPHRl等；(2)植酸酶基因，如phyA，phyB，phyC等；(3)高亲和 磷转运蛋白基因，如AtPTl，OsPTl,LePTl等；(4)磷酸酶类基因，如AtACP5，LaSAPl等；(5) 核糖核酸酶基因，如RNS1、RNS2和RNS3等；(6)有机酸分泌基因，如CSb，DcCs等。在上述 几种不同类型磷高效基因中，转录因子由于可以调控(开启或关闭)位于其下游的一系列 磷代谢相关基因的表达，从而更大范围地提高植物对磷素的吸收或利用效率，因而尤为突 出和重要。拟南芥中的转录因子AtPHRl属于MYB-CC类型，与CrPSRl同源，而CrPSRl是在 光合真核生物中报道的第一个参与磷代谢的调节因子，已被证实与磷营养代谢密切相关； AtPHRl发生突变，可导致一系列磷代谢相关基因表达量降低，转基因拟南芥耐低磷能力也 随之下降；因而AtPHRl被认为是高等植物中唯一已知的磷信号调控体系的核心转录因子， 影响着一系列磷饥饿反应基因的表达；它的发现被认为是植物磷信号调控研究的重要里程 碑。利用AtPHRl序列，通过同源基因克隆技术分离得到的OsPHRl和0sPHR2，分析发现，这 两个基因均与磷胁迫信号途径有关，且0sPHR2过量表达可使转基因水稻地上部的磷素明 显增加和积累。菜豆中的PvPHRl也被证明是一个参与植物磷素运输、再利用的正向调控因 子。尽管目前已获得一些磷高效基因，但其应用范围仍然有限，并且关于植物磷高效分子机 制也尚未明确。究其原因仍与克隆基因数量少，尤其是功能明确基因明显缺乏有很大关系。 因此，克隆磷高效基因，并对其进行分析，仍然是今后一段时期内的重要研究方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种大豆GmPHRl蛋白。大豆GmPHRl蛋白为，1)由SEQ ID No. 2所示氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1) 衍生的蛋白质。本发明还提供编码上述蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本发明提 供的大豆GmPHRl是从一个磷高效的大豆品种‘冀豆11’中通过RT-PCR分离得到，其开放 阅读框序列819bp。将得到的GmPHRl序列进行蛋白比对，发现该基因编码蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Oryza sativa)(Phaseolusvulgaris)白勺ΜΥΒ$ @
子具有较高的同源性。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的 前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活 性区段，将第(200)位的(Tyr)替换为(His)，或是将第(111)位的(Gly)缺失，或是在(131 位后面)增加(一个Ser)。因此，本发明的大豆GmPHRl蛋白还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、缺 失或添加一个或几个氨基酸，具有大豆GmPHRl蛋白同等活性的由大豆GmPHRl蛋白衍生得 到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核苷酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的 简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表 达的密码子。本发明还提供含有上述大豆GmPHRl基因或其片段的载体，以及含有该载体的宿 主细胞；所述载体为所述大豆GmPHRl基因的克隆载体或各类表达载体。本发明还提供一种大豆GmPHRl基因在培育耐低磷胁迫植物新品种中的应用，通 过在植物体内过量表达大豆GmPHRl基因，提高转基因植物对低磷胁迫的抗性。本发明从大豆中分离出了 PHRl的同源基因，通过亚细胞定位表明该基因所编码 的蛋白主要分布在细胞核中。通过农杆菌介导法将大豆GmPHRl基因转化拟南芥，获得了转 基因拟南芥。在适磷处理下，转基因拟南芥与野生型在植株生长上表现基本一致；而在低磷 胁迫下，GmPHRl超表达转基因拟南芥与野生型相比，表现出植株叶片较大，呈现绿色，叶柄 较长，生长势强等特点，而野生型拟南芥则表现出叶片变小，呈现紫色，叶柄较短，生长势弱 等植株缺磷症状，表明GmPHRl可以提高转基因拟南芥在低磷条件下的耐低磷能力。
图1是磷高效品种“冀豆11”在低磷处理条件下的cDNA进行PCR扩增的结果图。 其中M为DNA Marker DL 2000 ；1为“冀豆11”低磷处理cDNA的PCR扩增结果。图2是pGM-GmPHRl中间重组子阳性克隆筛选结果图。1_6泳道为阳性克隆PCR扩 增结果，M 为 DNAMarker DL 2000。图3是pET32a-GmPHRl重组质粒的酶切检测结果。其中1是pET32a_GmPHRl酶切 产物；2是未酶切对照；M是DNA MarkerDL5000o图4是GmPHRl基因原核表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果。其中M是蛋白标 准分子量；1，4，7，10为不含质粒菌株；2，5，8，11分别为含有空载质粒的菌株；3，6，9，12，13 分别为含有目的基因的菌株。图5是GmPHRl编码蛋白的亚细胞定位观察结果。其中，A 紫外光激发下的转空载 质粒pCam-GFP洋葱表皮细胞荧光观察；B 可见光激发下的转空载质粒pCam-GFP洋葱表皮 细胞显微观察；C 紫外光激发下的转融合表达载体pCam-GmPHRl-GFP洋葱表皮细胞荧光观 察；D 可见光激发下的转融合表达载体pCam-GmPHRl-GFP洋葱表皮细胞显微观察。图6是pBI121-GmPHRl重组质粒的酶切检测结果。其中1-2是pBI121_GmPHRl酶 切产物；3是未酶切对照；M是DNA MarkerDL15000。图7是拟南芥转化植株目的基因PCR检测图。其中1-7为转化后的拟南芥植株；M 是 DNAMarker DL2000。图8是T2代转基因拟南芥低磷胁迫处理结果图。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例IGmPHRl基因的分子克隆1.大豆幼苗培养与植株缺磷处理种子催芽后选择出芽一致的材料播于铺有蛭 石的花盆内，对生真叶展开后，进行缺磷(OmM)处理，对照磷处理为l.OmM。2.总RNA提取大豆植株总RNA(缺磷处理、对照处理)提取参照TRNzol Total RNA Reagent (购自天根生化科技(北京)有限公司)操作指南进行。3. cDNA反转录合成植株总RNA经反转录后获得cDNA第一链，合成过程参照 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit (购自宝生物工程(大连)有限公司)操 作指南进行。4. PCR扩增所用引物的设计利用AtPHRl序列，在NCBI网站比对大豆EST，通过电 子克隆技术拼接得到目的基因的电子序列。依据该电子序列设计一对引物，PHRl :5’ -CCCGGGTACCATGTATCACACAAAGAAATTTTCAC-3，PHR2 :5’ -GAGCTCGGGCCCTTACTGTCCACTCTCATTATCTTC-3，。5. GmPHRl基因开放阅读框(ORF)的分子克隆利用所设计的引物，以缺磷处理下 的反转录cDNA为模板进行PCR扩增，克隆GmPHRl基因的开放阅读框序列。PCR反应体系及
程序如下PCR 体系冀豆IlcDNALOyL10 X PCR 含 Mg2+ 缓冲液2. 0 μ L2. 5mM dNTPs2. 0 μ LEx Taq DNA 聚合酶(2. 5U/ μ L)0. 2 μ LPHRl(IOyM)l.OyLPHR2(10yM)l.OyL双蒸水12.8yLPCR 程序95°C 预变性IOmin94°C 变性Imin56°C 退火Imin72°C 延伸Imin30个循环72°C 延伸IOminIO0C保温 PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，回收目的片段，并连接于pGM-Τ载体，构建成PGM-GmPHRl载体，反应体系如下IOX连接缓冲液IyLpGM-T 载体1 μ LPCR 产物7 μ LT4DNA 连接酶IU将上述混合液混勻后，16 °C连接过夜。6.转化大肠杆菌，获得阳性克隆连接产物采用热击法转化大肠杆菌感受态细 胞，挑取阳性克隆，进行PCR检测(图2)并测序，获得GmPHRl基因的开放阅读框序列，长度 为819bp，序列如SEQ IDNo. 1所示。实施例2GmPHRl基因的原核表达1.将重组质粒pGM-GmPHRl和原核表达载体pET_32a (+)采用KpnI/SacI双酶切， 并回收目的片段，两个质粒的酶切反应体系均如下Kpn IIUSac IIU10XL 缓冲液2yL质粒IOyL双蒸水补足至20 μ L2.将回收后的pET_32a(+)表达载体与GmPHRl酶切片段进行连接，构建成 pET-32a(+) -GmPHRl载体，连接体系如下GmPHRl 片段5yLpET-32a (+)载体1 μ LT4DNA 连接酶IUIOX连接缓冲液IyL双蒸水补足至IOyL混勻后16 °C连接过夜。3.融合重组蛋白的诱导表达将上述连接产物转化大肠杆菌DH5 α，经PCR和酶 切检测，将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21菌株，挑取阳性克隆，经质粒提取、酶切检测 (图3)，测序鉴定，得到含有基因正确编码序列的阳性克隆。4. SDS-PAGE蛋白电泳分析利用IPTG诱导表达转有原核表达载体的BL21菌株， 分别收集诱导0小时，3小时，6小时，9小时和12小时的菌液。将收集的菌液离心后，倒出 液体，分别加入200 μ L上样缓冲液，振荡混勻后，置于沸水中10分钟，瞬离；配置12%的分 离胶，5%的浓缩胶，待其室温聚合完毕后，拔出梳子。各取30 μ L样品上样；浓缩胶部分以 80V恒压，分离胶部分以120V恒压电泳。电泳结束后，将电泳胶从电泳板上剥下，先用蒸馏 水冲洗干净，然后用染色液室温染色2小时，置于脱色液中直至出现清晰的条带。结果如图 4所示。实施例3GmPHRl编码蛋白的亚细胞定位分析1. PCR所用引物的设计利用生物软件DNAMAN设计一对PCR引物，扩增GmPHRl去 除终止密码子后的开放阅读框，进行编码蛋白的亚细胞定位，引物序列如下PHR3 5' -TCTAGATGTATCACACAAAGAAATTTTCACCGGC-3‘，
PHR4 5' -GGTACCCTGTCCACTCTCATTATCTTCATCC-3‘。2.亚细胞定位所需开放阅读框的扩增以pGM-GmPHRl质粒为模板，利用PHR3和 PHR4引物，扩增不含终止密码子的基因开放阅读框序列，电泳检测后切胶回收目的条带，与 PGM-T载体连接，蓝白斑筛选，测序，挑选出开放阅读框序列无误的阳性克隆pGM-PHRl用于 后续试验。3.表达载体的构建将目的基因GmPHRl和绿色荧光蛋白基因GFP构建成融合 基因，并与真核表达基因35S启动子及终止子连接，利用限制性内切酶将该序列连接于 PCAMBIA1300 载体的 EcoRI/Hindlll 位点，构建成表达载体 pCam-GmPHRl :GFP。酶切反应体系为EcoR IIUHindIIIIUIOXM 缓冲液2yL质粒IOyL双蒸水补足至20 μ L回收酶切产物，进行连接，连接体系如下融合基因片段5yLpCAMBIA1300 载体1 μ LT4DNA 连接酶IUIOX连接缓冲液IyL双蒸水补足至IOyL连接产物采用热击法转化大肠杆菌感受态细胞。挑取阳性克隆，进行质粒提取，酶 切检测和测序，获得用于亚细胞定位的融合表达载体pCam-GmPHRl :GFP。pCam-GFP载体构 建方法同前述。将GFP与真核表达基因35S启动子及终止子连接，利用限制性内切酶将该 序列连接于PCAMBIA1300载体的EcoRI/Hindlll位点，构建成表达载体pCam-GFP，作为空质 粒对照。4.融合表达载体pCam-GmPHRl GFP与空质粒pCam_GFP的基因枪转化采用基因 枪轰击技术将融合表达载体pCam-GmPHRl :GFP和空质粒pCam-GFP转化洋葱内表皮细胞， 转化具体步骤按照基因枪操作说明书进行。5.荧光显微镜观察基因枪轰击后的洋葱内表皮细胞置于荧光显微镜下观察绿 色荧光在细胞内的分布情况。结果如图5所示，表明转化pCam-GmPHRl: :GFP质粒的洋葱内 表皮细胞的细胞核部位有明显的荧光，结果表明GmPHRl编码蛋白主要分布于植物细胞核 中。实施例4GmPHRl基因表达蛋白的功能分析 1. GmPHRl基因的植物超表达载体pBI 121-GmPHRl的构建将pGM-GmPHRl和 PBI121质粒采用Sma I/Sac I双酶切，酶切反应体系如下Sma IIUSac IIUIOXT 缓冲液2yL牛血清蛋白2yL
质粒8 μ L双蒸水补足至20 μ L回收酶切产物，进行连接，连接体系如下GmPHRl 片段5 μ LρΒΙ121 载体IyLT4DNA 连接酶IUIOX连接缓冲液IyL双蒸水补足至10 μ L混勻后，16°C连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5ci，经双酶切检测(图6)，得 到阳性克隆进行测序，得到测序正确的超表达载体pBI121-GmPHRl进行后续试验。2.农杆菌介导法侵染拟南芥采用浸花法(Floral dip)将携带有pBI121_GmPHRl 的农杆菌转入哥伦比亚型拟南芥中。利用载体序列设计一对引物(扩增产物为1348bp)进 行转化植株的PCR检测，部分转化植株的PCR结果如图7所示。引物序列如下PHR5 5' -CCCGGGTACCATGTATCACACAAAGAAATTTTCAC-3‘，PHR6 5' -GTAAAGCACTAAATCGGAACCCTA—3‘。3.转基因拟南芥的耐低磷特性分析选取T2代转基因拟南芥株系3个，空载体株 系1个和野生型拟南芥为材料；每个材料分别种20盆，1株/盆，进行2个磷浓度处理(低 磷处理0. OlmM,对照处理1. OmM)。随后，在植株生长期间，观察拟南芥植株在2种磷处理下 的生长情况，进行耐低磷特性分析。结果如图8所示，表明在适磷处理下，生长24天的转基 因拟南芥与野生型在植株生长上表现基本一致；而在低磷胁迫处理下，GmPHRl超表达转基 因拟南芥与野生型相比，则表现植株叶片较大，叶柄较长，生长势强等特点，表明GmPHRl可 以提高转基因拟南芥在低磷条件下的耐低磷能力，GmPHRl具有提高拟南芥耐低磷能力的功 能。序列说明SEQ ID No. 1为大豆GmPHRl基因的核苷酸序列；SEQ ID No. 2为大豆GmPHRl的氨 基酸序列；SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示为引物 PHRl 和 PHR2 ； SEQ ID No. 5 和 SEQID No. 6 所示为引物 PHR3 和 PHR4 ；SEQ ID No. 7SEQ ID No. 8 所示为引物 PHR5 和 PHR6。
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权利要求
一种大豆GmPHR1蛋白，其为1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的大豆GmPHRl基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.含权利要求2或3所述基因的转化植物细胞。
7.制备权利要求1所述蛋白的方法，其特征在于，将大豆GmPHRl基因构建到原核表达 载体中，通过在大肠杆菌中发酵制备。
8.权利要求2或3所述的基因在培育耐低磷植物新品种中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是在植物体内过量表达大豆 GmPHRl基因，提高转基因植物对低磷胁迫的抗性。
全文摘要
本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一种大豆的GmPHR1基因及其编码的蛋白和应用。本发明提供一种大豆的GmPHR1蛋白，1)、由SEQ ID No.2所示氨基酸组成的蛋白质；或2)、在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明还提供编码上述蛋白的基因，及其在培育耐低磷植物新品种中的应用。GmPHR1的转基因植物与野生型相比表现出更强的耐低磷胁迫的能力。
文档编号C12N5/10GK101985465SQ20101052835
公开日2011年3月16日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年9月14日
发明者常文锁, 张俊红, 张彩英, 李喜焕, 王运杰 申请人:河北农业大学