专利名称：出芽短梗霉菌株和其制备方法及用于生产无色素茁霉多糖的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种以出芽短梗霉 (Aureobasidiumpullulans)为原始菌株，通过紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变 和筛选获得的不分泌色素、茁霉多糖产量高的茁霉多糖生产菌株——出芽短梗霉 (Aureobasidiumpullulans)菌株W24，同时还涉及该菌株的制备方法以及该菌株在生产无 色素茁霉多糖方面的应用。
背景技术：
茁霉多糖，又名普鲁兰或短梗霉多糖，是出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) 以淀粉糖为原料发酵产生的细胞外纯天然高分子多糖。它的结构可以看作是麦芽三糖通过 α _1，6糖苷键聚合而成，所以，分子中既有α_1，4糖苷键，又有α_1，6糖苷键。易溶于水， 安全无毒、可食用、低热值；可塑性、成膜性好、簿膜隔气性佳；用于包装具有保色、保香、保 鲜、抗氧化等功效。茁霉多糖膜最特殊的性质是比其他高分子膜的透气性能低，氧、氮、二 氧化碳和香气等气体几乎不能通过，使用茁霉多糖薄膜，能有效阻止水分，氧、氮、二氧化碳 等气体在果蔬内外的交换，抑制果蔬的呼吸作用，有效地减少了果蔬营养物质的耗损。例 如，茁霉多糖丙酸醋溶液喷于冷冻干燥的青菜，不用防潮袋可保存5个月，颜色和形状变化 小，烹调后仍保持新鲜风味。对于油脂类含量高的果实，如花生、核桃、杏仁、豆类、干鱼、贝 类，干燥的薯条、萝卜类，在表面喷涂极薄的茁霉多糖膜能有效防止氧化作用。涂在鸡蛋上 还能提高鸡蛋强度，增加表面洁度。而茁霉多糖不易被体内消化酶消化，热量比一般糖类产 品低一半；在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染。在化妆品、药品、保健品行 业中可作为填充剂和粘结成型剂，在医药工业中还可作为血浆代用品；在石油工业中，可作 为三次采油的驱油剂；另外，在烟草制造工业、农业种子保护等领域也有广泛的应用。日本 Hayashibara公司生物化学研究所最近同美国辉瑞(Pfizer)公司合作成功开发出以茁霉 多糖为原料制成的硬质胶囊，这种硬质胶囊新产品的崩散性、不透氧性和稳定性都很好，目 前已推入世界市场，由辉瑞公司下属的Capsugel公司以NP capsTM的品名正式上市销售。 最近，美国辉瑞公司将茁霉多糖用于生产一种新型健齿口香糖如Listerine Pocketpaks, 已在欧美等地成为热销产品。因此，茁霉多糖是一种具有极大经济价值和开发潜力的多功 能新型生物材料，具有广阔的市场前景。面对国外茁霉多糖产业的快速发展，采用育种技术提高茁霉多糖菌种生产水平、 降低色素产量，建立先进的茁霉多糖发酵和提取工艺，降低生产成本，摆脱国外技术垄断， 是我们急待解决的问题。我国北方玉米种植广泛，采用现代高新技术开发玉米化工等系列 产品产业化高效生产技术是发展北方地区经济的可行之路。本项目采用紫外(UV)诱变和 亚硝基胍(NTG)诱变获得不产色素的高产茁霉多糖生产菌株；采用生物统计优化技术建立 以玉米为主要原料的出芽短梗霉发酵生产茁霉多糖生产工艺。降低茁霉多糖生产成本，实 现茁霉多糖的国产化生产，争取以此带动国内的多糖生产企业并赶超国外同行业水平。同 时提升我国农业高技术的自主创新能力与国际竞争力都具有重要意义。本专利成果可以充分利用丰富的玉米资源，促进可再生资源产业的高效、优质、快速发展，能够满足玉米深加 工生产企业需求，创造良好的经济效益和社会效益，具有较好的产业化优势和广阔的市场 发展前景。
发明内容
本发明的目的之一是以出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)为原始菌株， 通过紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变和筛选，获得不分泌色素、茁霉多糖产量高的茁 霉多糖生产菌株，获得的菌株其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)，已 于2010年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝 阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO. 3945。出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24是一种多形态真菌，有酵母样和真菌 菌丝体两种形态，这两种形态的形成受培养基成分、培养条件等各种因素的影响，它们可以 相互转变。在查氏琼脂培养基上生长良好，形成疏松边缘不整齐的真菌性菌落，菌落粘稠， 白色，最终成为黄色或黑色，有皱褶并发亮，皮革状。色泽变化由中央向边缘扩展，边缘有时 可带白色环。新生菌丝壁较簿，细而无色透明，横隔少，老龄菌丝壁厚，色由暗转变黑。菌丝 弯曲有隔，可以横裂形成芽管再发芽。分生孢子产生于菌丝的乳头状突起上，椭圆形。出芽 短梗霉(Aureobasidium pullulans) W24在含糖培养基中生长良好，培养基pH5. 5 7. 5之 间，培养温度26°C 32°C，发酵过程中以酵母样细胞为主，所得产品茁霉多糖不引起任何 生物学毒性和异常状态，广泛用于食品、化妆、医药等工业。最近，茁霉多糖被我国卫生部正 式批准允许在部分食品中使用。本发明的目的之二是提供一种上述不分泌色素、茁霉多糖产量高的茁霉多糖生产 菌株——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24的制备方法；该制备方法通过紫外 线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变和筛选，易于实施、简洁、高效。本发明的目的之三是提供一种利用本发明获得的菌株——出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans) W24,以玉米浆为氮源发酵生产无色素茁霉多糖的方法。原始菌株——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)购自中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，菌株的编号是CGMCC N0. 3. 837。最佳培养温度为28°C，发酵 生产茁霉多糖过程中PH —般控制在6. 0左右，发酵过程中出芽短梗霉会分泌出与黑色素 (melanin)类似的黑色或墨绿色物质，这种物质牢固地粘附在茁霉多糖上，很难除去，增多 了下游处理操作，增加了生产成本。所以，选育低色素高产量的菌株是从根本上解以上问题 的方法。本发明的步骤为第一步至第三步所用培养基为液体培养基(质量比)蔗糖5%、酵母膏 0.2%、(NH4) SO4 0.04%, K2HPO4O. 2%, MgSO4 · 7H20 0. 01%, NaCl 0. 2%，其余为水；pH = 5. 5 7. 5、115°C、30min 灭菌第一步，原始菌株的培养及孢子悬浮液的制备挑取一环原始菌株——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于装液体培 养基的试管中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下摇床培养48 56h ；再按2% 20%体积比的接种量接种于装有液体培养基的三角瓶中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下 摇床培养72 96h ；然后向三角瓶中加入灭菌的玻璃珠，充分振荡，使孢子脱落，用四层纱 布过滤，再将所得全部孢子转移到装有新鲜液体培养基的三角瓶中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下摇床培养8 12h，使孢子活化萌发，用血球计数板计数孢子数，调整(浓度 过大时，添加无菌水稀释，浓度过小时先通过离心收集菌体再用无菌水稀释到所需要浓度) 孢子浓度，得到孢子浓度为107/ml数量级的孢子悬浮液；第二步，菌种诱变原始菌株经第一步培养处理后，分别采用紫外线(UV)(功率为15W)或亚硝基胍 (NTG)两种不同的诱变方法。紫外线(UV)诱变预热紫外灯和磁力搅拌器各30min，然后取5ml、孢子浓度为 IOVml数量级的孢子悬浮液放置于直径6cm的培养皿中，再放入灭菌的磁力搅拌珠，使培养 皿距离紫外灯15cm，打开磁力搅拌器，使菌液均勻接受紫外线照射，分为三个诱变组，各照 射3min、5min和lOmin，之后将菌液在红光下用无菌水做梯度稀释，每个诱变组取稀释梯度 为10-5、10_6、10-7的菌液(以原菌液浓度看做1，稀释一次是原菌液浓度的10—1依次)，然后 涂布培养皿平板，每组每个梯度各涂布10个培养皿平板；另外，取不经过紫外线(UV)诱变 的菌液做空白对照组，稀释浓度、涂布方法同诱变组；所有培养皿平板25 32°C避光培养3 天；亚硝基胍(NTG)诱变取1. 8ml孢子浓度为107ml数量级的孢子悬浮液，加入 0. 2ml亚硝基胍(NTG)母液，混勻后静置反应90min，之后加入198ml无菌水终止反应，用无 菌水做梯度稀释，取稀释梯度为10-5、10_6、10-7的菌液(以原菌液浓度看做1，稀释一次是原 菌液浓度的10—1依次)，然后涂布培养皿平板，每个梯度各涂布10个培养皿平板，另外，取 不经过亚硝基胍(NTG)诱变的菌液做空白对照组、稀释浓度，涂布方法同诱变组；所有培养 皿平板25°C 32°C培养3天。所述亚硝基胍(NTG)母液配制方法为取Ig亚硝基胍(NTG)加入IOml丙酮作为 助溶剂，取Ig亚硝基胍(NTG)丙酮溶液加入9ml磷酸盐缓冲液，此为亚硝基胍(NTG)母液。第三步，菌株的筛选选择菌落直径大(测量直径)、颜色浅(肉眼观察)的菌落，在相应培养皿平板 上对菌落做标记，挑取一环每个做标记的菌落分别接种于试管(装有液体培养基)，25 32 0C >150 200rpm摇床培养48 56h之后按2 % 20 %体积比的接种量接种在装有 液体培养基的三角瓶中，25°C 32°C、150 200rpm摇床培养96 108h，测茁霉多糖产 量、测发酵液OD值、生物量，比较发酵液颜色(OD值比较)，观察粗多糖颜色，选择颜色浅 和产量高的相应标记菌落做为下一次诱变的出发菌株；然后经过与上述步骤相同的24轮 诱变获得目的菌株(茁霉多糖产量为26g/L，提取得到的粗茁霉多糖为白色)出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans)W24。对上述获得的菌株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24进行稳定性试 验、产物性质分析，结果表明，出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24发酵后的发 酵液为白色或淡黄色，而原始菌株发酵液为黑色或墨绿色，出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24发酵制得的茁霉多糖颜色为白色，原始菌株发酵制得的茁霉多糖颜色为黑 色，采用岛津高效液相色谱仪(HPLC)对商品茁霉多糖(日本Hayashibara公司产品)和出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24发酵生产得到的茁霉多糖进行分析(见附图1)，结果表明产品茁霉多糖和商品茁霉多糖(日本Hayashibara公司产品)相当，无差异。应用本发明所述的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24可以进一步生产 无色素茁霉多糖，我们对不同碳源(包括蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖糖浆和乳糖)、氮源(包 括硫酸铵、酵母抽提物(Yeast extract)、硝酸铵、玉米浆)及不同浓度进行了发酵试验，其 主要工艺步骤为按质量百分比计算，液体培养基含有碳源2% 20%、氮源0. 1 % 3%、 K2HPO4O. 2%,MgSO4 ·7Η20 0. 01%,NaCl 0. 2%，其余为水；ρΗ = 5. 5 7. 5、115°C、30min 灭菌。挑取一环经斜面保存的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) W24接种于装有 液体培养基的试管中，于28 32°C、150 200rpm条件下摇床培养48 56h ；再按2% 20%体积比的接种量接种于装有液体培养基的三角瓶中，于25 32°C、150 200rpm条 件下摇床培养48 56h，得到芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans) W24的纯培养物；再按 2% 20%体积比的接种量将芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) W24的纯培养物接种 于装有液体培养基的发酵设备中，发酵液温度为25 32°C、搅拌转速为150 200rpm，发 酵85 105h，经后处理得到无色素茁霉多糖。前面技术方案中，各个步骤中，芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24菌株的 接种量为5% 15%，最佳实施方案中芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)W24菌株接种 量为10% ；前面技术方案所述的各步骤中，各处步骤中，发酵培养的温度为28°C 32°C，培 养基的ρΗ为6. 0 7. 0，最佳实施方案中发酵培养的温度为28°C，培养基的ρΗ为6. 5 ；进一步优选实施方案中，本发明使用蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖中的一种或 几种作为初始碳源；初始氮源为硫酸铵、硝酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母抽提物、玉米浆中的 一种或几种。在更进一步的实施方案中，蔗糖的浓度为5% 15%，酵母抽提物(酵母膏)的浓 度为0. 1.5%、玉米浆的浓度0. 2. 0% ；在最佳实施方式中，蔗糖浓度为10%、 酵母膏浓度为0. 2%、玉米浆浓度为0. 4% (质量比)，得到的茁霉多糖产量最高，为26g/L。本发明所使用的分析方法包括茁霉多糖、生物量和多糖成分分析。(1)茁霉多糖产量的测定发酵培养结束后，发酵液沸水浴15min，降温后离心 (6000rpm, 15min)。取上清液10mL，加入2倍体积的无水乙醇，混合均勻，将混合物在4°C下 静置过夜，离心(6000rpm，15min)。弃上清液，将获得的多糖在80°C烘干至恒重，电子天平 称重；(2)生物量细胞密度用紫外分光光度计测定0D6(l(lnm。将发酵液离心后收集菌体， 蒸馏水洗涤，重悬于蒸馏水中，调整细胞密度0D_为1.0左右，取50mL菌体溶液于105°C干 燥至衡重，称重并计算；(3)茁霉多糖成分分析采用岛津高效液相色谱仪(HPLC)对商品茁霉多糖和此菌株发酵生产得到的茁霉多糖进行对比分析。
图1 商品茁霉多糖㈧与本发明制备的茁霉多糖⑶高效液相色谱法(HPLC)分析图；图2 不同种类不同浓度的氮源对茁霉多糖产量的影响曲线图；由图一可以得出，经过高效液相色谱法(HPLC)分析，商品茁霉多糖(A)与本发明 制备的茁霉多糖(B)其成分组成无差异，属于同一种物质。通过观察图2(见附图2)，可以明显发现相同的菌株，当以酵母膏、(NH4) SO4(浓度 均为为0. 04% )为氮源，酵母膏浓度为0. 2%时，茁霉多糖的最高产量为16. 76g/L ；当以玉 米浆、(NH4) SO4 (浓度均为为0.04%)为氮源，玉米浆浓度为0.4%时，多糖的最高产量为 21. 62g/L ；在不添加其他氮源，仅以玉米浆为氮源时，玉米浆浓度为0. 4%，多糖的最高产 量为12.05g/L。因此，可以得出结论以玉米浆为主要氮源生产茁霉多糖比以酵母膏为主 要氮源生产的茁霉多糖产量高。
具体实施例方式实施例1 菌种的选育(1)菌种初级诱变所用培养基为液体培养基(质量比)蔗糖5%、酵母膏 0.2%, (NH4) SO4 0. 04%, K2HPO4O. 2%, MgSO4 · 7H20 0. 01%, NaCl 0.2%，其余为水，pH 6. 5、115°C、30min 灭菌第一步，原始菌株的培养及孢子悬浮液的制备挑取一环原始菌株-出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于试管(装 液体培养基)，28°C，180rpm，摇床培养48h，按10%的接种量(体积比)接种于装有液体 培养基的三角瓶中，28°C，ISOrpm，摇床培养72h ；然后向三角瓶中加入无菌的玻璃珠，充分 振荡，使孢子脱落，用四层纱布过滤，将所得全部孢子转移到装有新鲜液体培养基的三角瓶 中，28°C，ISOrpm摇床培养8h，使孢子活化萌发，用血球计数板计数孢子数，调整孢子浓度， 制得孢子浓度为107ml的孢子悬浮液。第二步，菌种诱变原始菌株经第一步培养处理后，分别采用紫外线(UV)(功率为15W)和亚硝基胍 (NTG)两种不同的诱变方法。紫外线(UV)诱变预热紫外灯和磁力搅拌器30min，取5ml、孢子浓度为107ml 的孢子悬浮液放置于直径6cm的培养皿中，放入灭菌的磁力搅拌珠，使培养皿距离紫外灯 15cm,打开磁力搅拌器，菌液均勻接受紫外线照射，分三组，各照射3min、5min、IOmin,之后 在红光下做梯度稀释，每组分别取10_5、10_6、10_7梯度的菌液涂布培养皿平板，每组每个梯 度各涂布10个培养皿平板，另外，取不经过紫外线(UV)诱变的菌液做空白对照组，稀释浓 度，涂布方法同诱变组，所有培养皿平板28°C避光培养3天。亚硝基胍(NTG)诱变取1. 8ml孢子浓度为107ml的孢子悬浮液，加入0. 2ml亚 硝基胍(NTG)母液，混勻后静 置反应90min，之后加入198ml无菌水终止反应，做梯度稀释， 每组分别取10_5、10_6、10_7梯度的菌液涂布培养皿平板，每组每个梯度各涂布10个培养皿 平板，另外，取不经过亚硝基胍(NTG)诱变的菌液做空白对照组，稀释浓度，涂布方法同诱 变组，所有培养皿平板28°C避光培养3天。所述亚硝基胍(NTG)母液配制方法为取Ig亚硝基胍(NTG)加入IOml丙酮作为助溶剂，取Ig亚硝基胍(NTG)丙酮溶液加入9ml磷酸盐缓冲液，此为亚硝基胍(NTG)母液。第三步，菌株的筛选
对经紫外线或亚硝基胍诱变的菌株，选择直径大(测量直径)、颜色浅(肉眼观 察)的菌落，在相应培养皿平板上对菌落做标记，挑取一环每个做标记的菌落分别接种于 试管(装有液体培养基)，28°C、180rpm摇床培养48h之后按10%的接种量(体积比)接种 在三角瓶中(液体培养基)，28°C、ISOrpm摇床培养96h，测茁霉多糖产量、测发酵液OD值、 生物量，比较茁霉多糖颜色(0D值比较)，选择颜色浅和产量高的相应标记菌落做为下一次 诱变的出发菌株，经过24轮诱变获得目的菌株(茁霉多糖产量为26g/L，提取得到的粗茁霉 多糖为白色)出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) W24。(2)出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) W24的遗传稳定性实验将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24分别进行液体培养基(28°C、 ISOrpm摇床培养48h)传代培养20次，涂布平板，计算茁霉多糖产量和比较产品色泽。结果 表明，将出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans) W24突变菌株经20次传代培养，茁霉多糖 产量和发酵性状没有发生显著变化，表明出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24具有 很好的遗传稳定性。实施例2 以玉米浆为氮源生产茁霉多糖在茁霉多糖生产过程中，原材料的价格是产品成本的一个重要影响因素。筛选廉 价的发酵培养基对于降低茁霉多糖的生产成本是非常必要的。因此，我们对酵母膏、玉米浆 等营养物质进行优化，从而获得适于大规模生产的发酵培养基。(1)初始酵母膏浓度对发酵的影响培养基(质量比)分别以0. 1%、0. 2%、0. 3%、0.4%和0. 5%酵母膏为氮源，蔗 糖为碳源，其浓度 10%，其余为(NH4) SO4 0. 04%, K2HPO4 0. 2%, NaCl 0. 2%、MgSO4 · 7H20 0. 01 %、水，pH 6. 5进行摇瓶发酵试验，280C、180rpm摇床培养3天，研究不同酵母膏浓度对 茁霉多糖产量的影响(表1)。结果表明，酵母膏浓度在0.2%时，茁霉多糖产量最高，最高 产量为16. 76g/L。表1.不同酵母膏浓度对发酵生产茁霉多糖的影响
权利要求
一种出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，其于2010年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3945。
2.权利要求1所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的制备方法，其步骤如下A、原始菌株的培养及孢子悬浮液的制备挑取一环原始菌株——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于装有液体培 养基的试管中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下摇床培养48 56h ；再按2% 20% 体积比的接种量接种于装有液体培养基的三角瓶中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下 摇床培养72 96h ；然后向三角瓶中加入灭菌的玻璃珠，充分振荡，使孢子脱落，用四层纱 布过滤，再将所得全部孢子转移到装有新鲜液体培养基的三角瓶中，于25°C 32°C、150 200rpm条件下摇床培养8 12h，使孢子活化萌发，用血球计数板计数孢子数，调整孢子浓 度，得到孢子浓度为107ml数量级的孢子悬浮液；液体培养基的质量配比为蔗糖5%、酵 母膏 0.2%、(NH4) SO4 0. 04%, K2HPO4 0. 2%、MgSO4 · 7H20 0. 01%, NaCl 0.2%，其余为水; 培养基的pH为5. 5 7. 5、115°C条件下进行30min灭菌。B、菌种诱变原始菌株经上一步处理后，分别采用紫外线或亚硝基胍两种不同的诱变方法进行菌种 诱变；C、菌株的筛选选择菌落直径大、颜色浅的经菌种诱变后的菌落，在培养皿平板上对菌落做标记，挑取 一环每个做标记的菌落分别接种于装有液体培养基的试管中，25 32°C、150 200rpm摇 床培养48 56h，之后按2% 20%体积比的接种量接种在装有液体培养基的三角瓶中， 25 V 32°C、150 200rpm摇床培养96 108h，测茁霉多糖产量、测发酵液OD值、生物 量，比较发酵液颜色，观察粗多糖颜色，选择颜色浅和产量高的相应标记菌落做为下一次 诱变的出发菌株；然后经过与上述步骤相同的24轮诱变获得目的菌株，即为出芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans)。
3.如权利要求2所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的制备方法，其特征 在于紫外线诱变首先是预热紫外灯和磁力搅拌器各30min，然后取5ml、孢子浓度为IO7/ ml数量级的孢子悬浮液放置于直径6cm的培养皿中，再放入灭菌的磁力搅拌珠，使培养皿 距离紫外灯15cm，打开磁力搅拌器，使菌液均勻接受紫外线照射，分为三个诱变组，各照射 3min,5min和lOmin，之后将菌液在红光下用无菌水做梯度稀释，每个诱变组取稀释梯度为 10_5、10_6、ΙΟ"7的菌液，然后涂布培养皿平板，每组每个梯度各涂布10个培养皿平板；所有 培养皿平板25 32°C避光培养3天，得诱变菌种。
4.如权利要求2所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的制备方法，其特征 在于亚硝基胍诱变是取1. 8ml孢子浓度为107ml数量级的孢子悬浮液，加入0. 2ml亚硝 基胍母液，混勻后静置反应90min，之后加入198ml无菌水终止反应，用无菌水做梯度稀释， 取稀释梯度为10-5、10_6、10-7的菌液，然后涂布培养皿平板，每个梯度各涂布10个培养皿平 板；所有培养皿平板25°C 32°C培养3天，得诱变菌种；所述亚硝基胍母液的配制是取Ig 亚硝基胍加入IOml丙酮作为助溶剂，取Ig亚硝基胍丙酮溶液加入9ml磷酸盐缓冲液，即为 亚硝基胍母液。
5.如权利要求2 4任何一项所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的制 备方法，其特征在于各个步骤中，芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌株的接种量为 5% 15%，发酵培养的温度为28°C 32°C，培养基的pH为6. O 7. O。
6.权利要求1所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)在用于生产无色素茁霉 多糖方面的应用。
7.如权利要求6所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)在用于生产无色素茁 霉多糖方面的应用，其特征在于生产无色素茁霉多糖的步骤为先挑取一环经斜面保存的 出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于装有液体培养基的试管中，于28 32°C、 150 200rpm条件下摇床培养48 56h ；再按2% 20%体积比的接种量接种于装有液 体培养基的三角瓶中，于25 32°C、150 200rpm条件下摇床培养48 56h，得到芽短梗 霉(Aureobasidium pullulans)的纯培养物；再按2% 20%体积比的接种量将芽短梗霉 (Aureobasidium pullulans)的纯培养物接种于装有液体培养基的发酵设备中，发酵液温 度为25 32°C、搅拌转速为150 200rpm，发酵85 105h，经后处理得到无色素茁霉多 糖；液体培养基的质量配比为初始碳源2% 20%、初始氮源0. 3%、K2HP04 0.2%, MgSO4 · 7Η200· 01%, NaCl 0. 2%，其余为水；pH 为 5. 5 7. 5，115°C进行 30min 灭菌。
8.如权利要求7任何一项所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)的制备 方法，其特征在于各个步骤中，芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌株的接种量为 5% 15%，发酵培养的温度为28°C 32°C，培养基的pH为6. 0 7. 0。
9.如权利要求6或7所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)在用于生产无色 素茁霉多糖方面的应用，其特征在于以蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖中的一种或几种 作为初始碳源；以硫酸铵、硝酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母抽提物、玉米浆中的一种或几种为 初始氮源。
10.如权利要求8所述的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)在用于生产无色素 茁霉多糖方面的应用，其特征在于芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)菌株的接种量为 5% 15%，发酵培养的温度为28°C 32°C，培养基的pH为6. 0 7. 0。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种以出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)为原始菌株，通过紫外线(UV)和亚硝基胍(NTG)诱变和筛选获得的不分泌色素、茁霉多糖产量高的茁霉多糖生产菌株——出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)W24，该菌株于于2010年06月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.3945。同时还涉及该菌株的制备方法以及利用该菌株在生产无色素茁霉多糖方面的应用。当蔗糖浓度为10％、酵母膏浓度为0.2％、玉米浆浓度为0.4％(质量比)时，制备得到的茁霉多糖产量最高，达到26g/L。
文档编号C12P19/10GK101988036SQ20101052801
公开日2011年3月23日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者冯印, 刘杰, 王玉华, 胡耀辉, 苏安祥 申请人:吉林农业大学