专利名称：一种出芽短梗霉黑色素的提取方法
技术领域：
本发明属于生物技术提取领域，特别涉及酸沉醇沉工艺提取出芽短梗霉黑色素的方法。
背景技术：
出芽短梗霉(AureobasidiumpulIulans)又名出芽范霉(Pullulariapullulans)，分类属于半知菌纲，是一种具有酵母型和菌丝形态的多形真菌，广泛存在于植物茎、叶、果实表面及花粉、树蜜中，耐高渗透压。可作为单细胞蛋白、细胞壁多糖、胞外多糖、果胶酶、色素等的生产菌株，其主要产物是短梗霉多糖，另外在多糖的分泌过程中，我们也常常发现会伴随着黑色素的产生。黑色素(Malannin)是一类普遍存在于生物界结构复杂多样的酚类或吲哚类生物大分子色素的总称，它为生物体提供结构性强度或保护生物免受紫外线、电离辐射、重金污染、低温和高温等环境胁迫的伤害。黑色素不仅是一种光保护剂、抗辐射剂、螯合剂、生物抗氧剂和免疫促进剂，而且还是一类生物半导体材料和光电传递材料；近年来的研究还发现黑色素具有抗蛇毒、抑制艾滋病病毒复制、治疗帕金森症等作用。由此可见，黑色素在医药、化妆品、食品、电子等方面有着广泛的应用前景。黑色素的制备方法很多，可以通过化学方法合成黑色素，如申请号为96117642. 3，名称为《食用合成黑色素的制造方法》的中国发明专利，公开了一种食用合成黑色素的制造方法，它以食用合成色素单色亮兰、柠檬黄或/和日落黄、胭脂红/和蕨菜红，以染料含量100%计，各原料配比为单色亮兰17%-37%、柠檬黄或/和日落黄25-60%、胭脂红或/和蕨菜红20-43%，然后加入上述原料总质量I 5倍的水搅拌混合均匀，再经干燥可制得膏状、粒状或粉状产品。由该方法制成的黑色素具有耐光性强、热稳定好的特点，但长期食用以化学原料合成的黑色素对身体会有一定的影响。此外，黑色素也可以从动物毛发、植物等材料中提取，如申请号为200710017344. 3，名称为《一种杏仁皮中提取和纯化黑色素的方法》，公开了一种从杏仁皮中提取和纯化黑色素的方法，该方法以杏仁皮为原料，采用碱性水溶液提取，酸水解杂质，反复有机溶剂洗涤和反复碱溶解后酸化使之沉淀和纯化，冻结-解冻后去离子水反复洗涤除去Cl—，最后真空干燥得到杏仁皮黑色素成品。由该方法制备的黑色素，溶于碱性水溶液，不溶于水和常见的有机溶齐U，氧化程度低，纯度较高。在众多制备黑色素的方法中，天然黑色素以安全性高，应用范围广等特点备受消费者的青睐，目前还没有发现从出芽短梗霉发酵液中提取黑色素的相关报导。黑色素是一种广泛存在于生物体中的一类天然色素，它是通过多羟基酚(极易结合蛋白)氧化而形成结构不规则的非均质的类多酚聚合体。黑色素又可分为三类真黑色素、棕黑色素、异黑色素，不同种类来源的黑色素在结构上有着细微的差异。黑色素有很多重要的生物学功能，它能通过与蛋白质的交联起到强化结构的作用，同时黑色素还能提供一些机械力，并且保护蛋白质不被降解。在黑色素形成过程中，正醌的产生具有进化上的重要性，因为它们是保守的，特别是那些亲核性的基团，如巯基、(-SH)和氨基(-NH2)，使其获得抗生素特性。黑色素具有光吸收和光衍射的特性，也被广泛利用。黑色素除赋予生物体某些特殊防御作用外，还具有外表修饰、抗辐射、抗氧化等功能。黑色素的光吸收特性，最显著的是由于其高度的共轭效应而产生的广谱光吸收特性。这种色素显黑是其吸收多数可见光的结果，甚至还包括一些低能量的辐射。黑色素，尤其是真黑色素，表现出显著的氧化还原性，并且由于在正醌和多聚物邻苯二酚部分之间的电子离域，使其产生很多半醌自由基。黑色素可以参与一些单价或双价的氧化还原反应，并且光吸收的结果使这种色素产生光氧化，使其所含羰基数增加，从而改变黑色素的吸收特性，即所谓即刻色素变黑反应(iro)。这种光氧化过程产生超氧化的自由基。螯合效应黑色素还具有很强的阳离子螯合特性，主要通过如羧基和去质子化羟基这些阴离子起作用。在生物体中，黑色素的生物合成始于L-酪氨酸的氧化。最关键的一步是酪氨酸在酪氨酸酶的催化下氧化为多巴醌，接下来是与多巴醌的歧化相关联的步骤，使其自发环化从而产生吲哚-2-羧基酸-5，6-醌(多巴色素)，紧接着在一种与酪氨酸酶相关联的蛋白质催化下产生互变异构化，此蛋白质(TRP-2)称为多巴色素异构酶。接下来就是产生的5，6- 二羟基吲哚-2-羧基酸的氧化作用(很可能由另一种与酪氨酸酶相关联的蛋白质催 化，TRP-1)。在现有的出芽短梗霉黑色素的提取工艺中，提取得到的黑色素量很少，而通过改进后的工艺其产生的黑色素的量明显提高，并能使黑色素完全析出。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种出芽短梗霉黑色素的提取方法，对出芽短梗霉黑色素发酵液采用酸沉醇沉的提取方法，使得成本大大降低。本发明的技术方案如下出芽短梗霉黑色素提取方法如下发酵结束后的出芽短梗霉黑色素发酵液过滤或者离心除去菌体，取IOOmL发酵液，用5mol/LHCl调pH值至2 3，充分振荡，静置一段时间，在搅拌的同时加入等体积有机溶剂使其充分沉淀，用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物，于50°C真空干燥至恒重。所述发酵液离心转速为5000r/min,离心IOmin,除去菌体。所述有机溶剂为无水乙醇、无水甲醇或无水丙酮中任意一种。所述有机溶剂为浓度20% 100%的乙醇。所述有机溶剂乙醇的优选浓度为40%。所述黑色素发酵液取IOOmL进行旋转蒸发浓缩，浓缩比为10% 50%。所述黑色素发酵液的优选浓缩比为30%。所述静置可以为恒温水浴中静置30min，水浴温度为0°C 100°C。所述水浴温度优选为80 V。所述出芽短梗霉黑色素发酵方法为装液量18L，接种量5% (V/V)，溶氧20%，初始搅拌转速400r/min 500r/min,与溶氧联动,通风比I. 2vvm,培养温度25°C,pH 6. O,培养时间3 5d。本发明菌种使用天津科技大学申请中菌种，申请号为CN200910071018，发明名称为一种大量产生β -聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培养方法，
公开日期是2011. 02. 23。该专利中公开了出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans),菌种保藏号为CGMCC3337，2009年10. 14日保藏。该菌株于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)。有益效果本发明改变了现有生产工艺步骤，对出芽短梗霉黑色素发酵液利用酸沉醇沉的提取方法，不仅将出芽短梗霉黑色素的产量提高到每IOOmL黑色素发酵液产黑色素I. 5g左右，而且避免了原料的浪费，降低了生产成本，提高了原料的利用率，减少了过度加入强酸强碱溶液弓I起的黑色素原有结构的破坏。
图I为实施例4中醇沉所用乙醇浓度与黑色素得率的关系。 图2为实施例5中发酵液旋转蒸发的浓缩比与黑色素得率的关系。图3为实施例6中水浴温度与黑色素得率的关系。
具体实施例方式下面通过具体的实施方案叙述本发明中出芽短梗霉黑色素的提取方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。实施例I :装液量18L，出芽短梗霉接种量5% (V/V)，溶氧20%，初始搅拌转速400r/min 500r/min(与溶氧联动)，通风比I. 2vvm,培养温度25°C,pH6. 0，培养3 5d。培养结束后，发酵液5000r/min离心IOmin除去菌体，提取方法为取IOOmL发酵液，用5mol/L HCl调pH值至2 3左右，充分振荡，静置一段时间，在搅拌的同时加入等体积无水乙醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50°C真空干燥至恒重。菌种使用天津科技大学申请中菌种，申请号为CN200910071018，发明名称为一种大量产生β -聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉ΤΚΡΜ00006及其培养方法，
公开日期是2011.02.23。该专利中公开了出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans),菌种保藏号为CGMCC3337，2009年10. 14日保藏。该菌株于2009年10月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)。实施例2:装液量18L，出芽短梗霉接种量5% (V/V)，溶氧20%，初始搅拌转速400r/min 500r/min(与溶氧联动)，通风比I. 2vvm,培养温度25°C,pH6. 0，培养3 5d。培养结束后，发酵液5000r/min离心IOmin除去菌体，提取方法为取IOOmL发酵液，用5mol/L HCl调pH值至2 3左右，充分振荡，静置30min，在搅拌的同时加入等体积无水甲醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50°C真空干燥至恒重。实施例3 装液量18L，出芽短梗霉接种量5% (V/V)，溶氧20%，初始搅拌转速400r/min 500r/min(与溶氧联动)，通风比I. 2vvm,培养温度25°C,pH6. 0，培养3 5d。培养结束后，发酵液5000r/min离心IOmin除去菌体，提取方法为取IOOmL发酵液，用5mol/L HCl调pH值至2 3左右，充分振荡，静置一段时间，在搅拌的同时加入等体积无水丙酮使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50°C真空干
燥至恒重。表I
实施例出芽短梗霉黑色素得率(g/100mL)
实施例I Λ5
实施例2IToo
实施例3 Γδ 实施例4装液量18L，出芽短梗霉接种量5% (V/V)，溶氧20%，初始搅拌转速400r/min 500r/min(与溶氧联动)，通风比I. 2vvm,培养温度25°C,pH6. 0，培养3 5d。培养结束后，发酵液5000r/min离心IOmin除去菌体，提取方法为取IOOmL发酵液，利用旋转蒸发浓缩发酵液30%，用5mol/L HCl调pH值至2 3左右，充分振荡，静置一段时间，在搅拌的同时加入等体积浓度分别为20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液使其沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50°C真空干燥至恒重。实施例5装液量18L，出芽短梗霉接种量5% (V/V)，溶氧20%，初始搅拌转速400r/min 500r/min(与溶氧联动)，通风比I. 2vvm,培养温度25°C,pH6. 0，培养3 5d。培养结束后，发酵液5000r/min离心IOmin除去菌体，提取方法为取IOOmL发酵液，利用旋转蒸发浓缩发酵液分别为10%、20%、30%、40%、50%，用5mol/LHCl调pH值至2 3左右，充分振荡，静置一段时间，在搅拌的同时加入等体积无水乙醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50°C真空干燥至恒重。实施例6装液量18L，除芽短梗霉接种量5% (V/V)，溶氧20%，初始搅拌转速400r/min 500r/min(与溶氧联动)，通风比I. 2vvm,培养温度25°C,pH6. 0，培养3 5d。培养结束后，发酵液5000r/min离心IOmin除去菌体，提取方法为取IOOmL发酵液，利用旋转蒸发浓缩发酵液30%，用5mol/L HCl调pH值至2 3左右，充分振荡，分别在0°C、20°C、40 V、60°C、80°CU00 V恒温水浴中静置30min，在搅拌的同时加入等体积无水乙醇使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50°C真空干燥至恒重。
权利要求
1.ー种出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，黑色素提取方法如下发酵结束后的出芽短梗霉黑色素发酵液过滤或者离心除去菌体，取IOOmL发酵液，用5mol/L HCl调pH值至2 3，充分振荡，静置一段时间，在搅拌的同时加入等体积有机溶剂使其充分沉淀，用600目的滤布过滤弃上清，得黒色粗提物，于50°C真空干燥至恒重。
2.如权利要求I所述的ー种出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述发酵液离心转速为5000r/min,离心IOmin,除去菌体。
3.如权利要求I所述的ー种出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述有机溶剂为无水こ醇、无水甲醇或无水丙酮中任意ー种。
4.如权利要求I所述的ー种出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述有机溶剂为浓度20% 100%的こ醇。
5.如权利要求I或4所述的ー种出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述有机 溶剂こ醇的优选浓度为40%。
6.如权利要求I所述的ー种出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述黑色素发酵液取IOOmL进行旋转蒸发浓缩，浓缩比为10% 50%。
7.如权利要求I或6所述的ー种出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述黑色素发酵液的优选浓缩比为30%。
8.如权利要求I所述的ー种出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述静置可以为恒温水浴中静置30min，水浴温度为0°C 100°C。
9.如权利要求I或8所述的ー种出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述水浴温度优选为80°C。
10.如权利要求I所述的ー种出芽短梗霉黑色素的提取方法，其特征在于，所述出芽短梗霉黑色素发酵方法为装液量18L，接种量5%(V/V)，溶氧20%，初始搅拌转速400r/min 500r/min，与溶氧联动，通风比I. 2vvm,培养温度25°C, pH 6. 0，培养时间3 5d。
全文摘要
本发明涉及一种出芽短梗霉黑色素的提取方法，是利用出芽短梗霉的发酵生产，将发酵液除去菌体后进入提取过程，提取方法为取100mL发酵液，用5mol/LHCl调pH值至2～3左右，充分振荡,静置30min，在搅拌的同时加入等体积有机溶剂使其充分沉淀，利用600目的滤布过滤弃上清，得黑色粗提物于50℃真空干燥至恒重。利用传统的碱溶酸沉的方法得到的黑色素固体粉末质量很少，而利用本发明酸沉醇沉的方法，固体物质析出之后溶液的颜色变为无色状态，表明黑色素完全析出而且易于收集，便于后续的稳定性研究和精制工作。
文档编号C09B67/14GK102732048SQ20121017051
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者乔长晟, 汪建明, 赵博 申请人:天津北洋百川生物技术有限公司