专利名称：一种山黧豆LsSYMRK基因及其在促进菌根形成和增加植物生物量方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种山黧豆LSSYMRK基因及其在促进菌根形成和增加植物生物量方面的应用。
背景技术：
菌根(mycorrhiza)是植物和真菌形成的一种互利共生体。泡囊丛枝菌根 (vesicular arbuscular mycorrhiza， VAM， ■禾尔 JA 丰支胃卞艮，AM) ^ 胃巾白勺一力 g。才直物从菌根中主要得到生长发育所需的磷，而菌根真菌得到植物光合作用产物——糖，菌根对于植物的生长发育具有重要意义。共生体形成的过程中，共生受体类似激酶基因 SYMRK(symbiosisrec印tor-like kinase, SYMRK)起到极其关键的作用。SYMRK基因对于其与真菌和细菌的共生是必需的，对于根瘤因子的识别传导起着一个承上启下传承的作用，SYMRK基因在丛枝菌根真菌由根表皮细胞向皮层外层细胞通道中起着重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种山黧豆SYMRK基因，其核苷酸序列如SEQID NO :1所
7J\ ο本发明的第二个目的在于提供一种山黧豆SYMRK基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本发明的第三个目的在于提供一种含有所述山黧豆SYMRK基因的植物表达载体。本发明的第四个目的在于提供用所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。本发明的第五个目的在于提供山黧豆SYMRK基因在促进菌根形成和增加植物生物量方面的应用。本发明的技术路线为1、利用分子生物学方法克隆山黧豆SYMRK基因，命名为=LSSYMRK ；2、构建LsSYMRK植物双元表达载体，用根癌农杆菌转化烟草，获得转LsSYMRK基因烟草；3、用丛枝菌根真菌(AMF)侵染转基因烟草和对照烟草，染色检测烟草根尖的菌根侵染情况，结果表明转基因烟草其根在AMF侵染后的初期，发育比对照快；4、接种丛枝菌根真菌(AMF)后，侧生物量，结果表明转基因植株在生物量上有显
者提尚。本发明克隆了一种山黧豆LsSYMRK基因，构建LsSYMRK双元表达载体，用根癌农杆菌转化烟草，获得转LsSYMRK基因烟草，实验证明LsSYMRK基因能加快烟草菌根的发育，增加植物生物量。
图1是LsSYMRK基因编码的蛋白功能域预测分析图；图2是LsSYMRK基因植物双元表达载体构建流程图；图3是LsSYMRK基因植物双元表达载体p3300-tb-LsSYMRK_N0S质粒图谱；图4是转基因植株PCR检测电泳图，a 转基因植株DNA水平的PCR检测，b 以转基因植株RNA为模板的PCR检测，c 转基因植株RT-PCR检测；1_8为转基因植株，9为野生型植株负对照，10为阳性对照。图5是转基因烟草接种AMF40天后相关基因的相对表达量分析图，图下面为对应的相对定量值，LsSYMRK转基因烟草，WT，野生型对照，误差线为方差。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。实施例1 LsSYMRK基因克隆利用3’ RACE和5’ RACE获得LsSYMRK基因片段两侧的未知序列，具体步骤如下1)利用豆科植物SYMRK基因的保守区域设计特异引物，上游引物LsSYMRK2_5’，下游引物LsSYMRK2-3’，扩增得到LsSYMRK基因中间片段；2)3，RACE 针对 mRNA3，段具有 polyA 的结构特征，利用 Oligo (dT) 18 与 polyA 互补以及已知基因片段特异引物扩增基因的3’端序列；3) 5，RACE 在已知片段序列的上游利用TDT酶添加PolyC片段，然后利用PolyG引物(AAP)锚定上游，已知基因片段特异引物为下游引物扩增整个基因的5’端序列；4)分析已经得到的cDNA序列，然后设计LsSYMRK的编码区全长的上游引物 LsSYMRK5’和下游引物LsSYMRK3’，以Oligo (dT) w逆转录的产物为模板，利用ExTaq进行 PCR扩增，得到LsSYMRK基因全长，经过测序得到全长为2，775bp序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。实施例1所用引物具体序列如表1所示。表 权利要求
1.一种山黧豆SYMRK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.权利要求1所述山黧豆SYMRK基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID N0:2所7J\ ο
3.含有权利要求1或2所述山黧豆SYMRK基因的植物表达载体。
4.用权利要求3所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。
5.权利要求1或2所述山黧豆SYMRK基因在促进菌根形成和增加植物生物量方面的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，公开了一种山黧豆LsSYMRK基因及其在促进菌根形成和增加植物生物量方面的应用。本发明构建了LsSYMRK双元表达载体，用根癌农杆菌转化烟草，获得转LsSYMRK基因烟草，实验证明LsSYMRK基因能加快烟草菌根的发育，增加植物生物量。
文档编号C12N9/12GK102453723SQ201010527478
公开日2012年5月16日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者林忠平, 胡鸢雷, 谭之京 申请人:林忠平