专利名称：苹果fpps基因的三处突变及其鉴定方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及苹果FPPS基因启动子区的三处突变与苹果 虎皮病性状的关系、FPPS等位基因序列及突变鉴定方法。
背景技术：
苹果(MalusdomesticaBorkh.)是我国果树产业中重要的大宗水果。虎皮病是苹 果和梨贮藏过程中发生的一种重要生理病害，严重影响果实的外观和商品价值。虎皮病 的发生与α -法尼烯(alpha-famesene)有密切关系(胡小松等，2002)。苹果α -法尼烯 的合成涉及3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR，3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A)、法尼基焦磷酸合酶(FPPS, farnesyl diphosphate synthase)禾口 α -法尼烯合酶 (AFS, alpha-farnesenesynthase)等酶基因(Rupasinghe et al.，1998 ；苑克俊等，2002)。 采用一种HMGR的竞争性抑制剂处理果实，几乎完全抑制α-法尼烯和虎皮病发生(Ju and Curry, 2000)。这说明，有可能通过控制α -法尼烯合成的相关酶基因来控制虎皮 病，研究相关酶基因是有意义的。目前人们已获得苹果AFS基因的CDNA序列，进行了该基因的原核表达研究 (Pechous andWhitaker, 2004 ；李萌等，2006)。 已有研究表明，易发虎皮病品种苹果的 AFS基因转录表达水平比抗病品种苹果高2.5倍(Pechous et al., 2005)。抗虎皮病品种 与易发病品种AFS基因序列存在差异，其中一个碱基变异发生在RxR序列模式上(苑克 俊等，2007b) ； Beuning等(2010)认为该碱基变异与苹果虎皮病发生无关。有关HMGR 基因的研究报道也较多(Rupasinghe et al，2001 ； Pechous andWhitaker, 2002) 但对于 α-法尼烯合成途径中的另一个关键酶基因(苹果法尼基焦磷酸合酶基因FPPS)，目前仅 见在GenBank中有一个FPPS基因的cDNA序列，我们有一篇易发虎皮病苹果品种FPPS 基因启动子及5’ UTR序列的研究报道(苑克俊等，2009)，未见找出与苹果虎皮病性状 有关的等位基因和碱基突变研究报道。本研究通过测序获得金冠和皇家嘎拉两个抗虎皮病苹果品种以及青香蕉和红 星两个易发病苹果品种的FPPS基因启动子及5’ UTR序列，分析FPPS基因启动子及 5’ UTR序列在抗虎皮病品种与易发病苹果品种间的差异，寻找影响苹果虎皮病发生的等 位基因以及FPPS基因启动子序列中与苹果虎皮病性状有关的碱基突变，开发可用普通琼 脂糖电泳检测的分子标记用来鉴定基因突变、进而鉴定苹果品种或杂交后代的果实虎皮 病性状。参考文献[1]胡小松，肖华志，王晓霞，2002，苹果α-法尼烯和共轭三烯含量变化与贮 藏温度的关系，园艺学报，31(2) 169-172[2]李萌，隋娜，张元湖，孟庆伟，2006，苹果AFS基因的克隆与原核表达，园 艺学报，33(1) 122-124[3]苑克俊，孙玉刚，张大鹏，胡小松，2002，苹果贮藏期间发生虎皮病的生理生化基础及其防治，植物生理学通讯，(5) 505-510[4]苑克俊，刘庆忠，李勃，张力思，2007b，苹果α-法尼烯合酶基因组结构和 序列的多态性分析，园艺学报，34(4) 1003-1006[5]苑克俊，刘庆忠，艾呈祥，魏海蓉，2009，苹果基因邻近未知序列的PCR扩 增方法，农业生物技术学报，17(6) 1083-1088[6]Beuning L., Green S.，and Yauk Y.K., 2010, The genomic sequence of AFS-I—analpha-farnesene synthase from the apple cultivar iRoyal Gala’，Frontiers ofAgriculture in China, 4(1) 74-78[7]Ju Z.G., and Curry E.A., 2000, Lovastatin inhibits α -farnesene synthesis withoutaffecting ethylene production during fruit ripening in 'Golden Supereme' apples, Journal of the American Society for Horticultural Science，125(1) 105-110[8]Pechous, S.W., Whitaker, B.D., 2002.Cloning and bacterial expression of a3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase cDNA (HMGl) from peel tissue ofapple fruit.J.Plant Physiol. 159 (8) 907-916[9]Pechous S.W.，and Whitaker B.D., 2004, Cloning and bacterial expression of an (Ε, Ε) - α -farnesene synthase cDNA from peel tissue of apple fruit, Planta, 219 (1)
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发明内容
本发明找出影响苹果虎皮病发生的等位基因以及FPPS基因启动子序列中与苹果 虎皮病性状相关的三处碱基突变，提供检测这些突变、进而鉴定苹果果实虎皮病性状的 分子标记方法和测序方法。本发明解决问题所采用的技术方案是根据苹果FPPS基因(GenBank登录号 FJ263960)序列以及我们研究该FPPS基因时获得的测序图谱序列设计引物，利用设计的 引物对金冠和皇家嘎拉两个抗虎皮病苹果品种，以及青香蕉和红星两个易发病苹果品种 的基因组DNA进行PCR扩增，对这些苹果品种的PCR扩增产物进行测序，通过检查测 序图谱寻找是否有杂合的多态性位点，对于有多态性位点的杂合基因利用等位基因特异 性引物鉴定出其等位基因序列，通过序列比对寻找抗虎皮病苹果品种和易发病苹果品种间的基因突变，然后分析这些苹果品种的基因突变与果实虎皮病性状的关系，找出与苹 果果实虎皮病性状相关的突变，开发用普通琼脂糖电泳检测突变的分子标记方法用来鉴 定苹果果实虎皮病性状，也可通过测序方法获得突变位点碱基信息鉴定苹果果实虎皮病 性状。本发明的有益效果是(1)本发明通过实验新找出苹果FPPS基因启动子序列中 三处突变与苹果果实虎皮病性状相关，可用来开发鉴定苹果果实虎皮病性状的方法。(2) 利用本发明可鉴定苹果品种和杂交后代的FPPS基因突变和果实虎皮病性状，在苹果杂交 育种中对苹果杂交后代进行早期选择，舍弃一部分植株，节省杂交后代的管理与筛选成 本。本发明为培育抗虎皮病苹果品种提供了一种简单易用、节省成本的分子标记育种预 选手段。这里需要说明的是本发明所用六个苹果品种金冠、青香蕉、皇家嘎拉、红 星、国光、富士全部为生产上栽培的品种，公众能得到；本发明核苷酸序列表的序列1 提供金冠苹果-个FPPS等位基因的880bp序列，序列2提供青香蕉苹果FPPS基因的 158bp序列，序列3提供我们已报道的另外670bp青香蕉苹果FPPS基因序列(GenBank登 录号 FJ263960)。
图1是金冠苹果PCR扩增产物在四个位点的测序图谱。图中数字为四个位点在 FPPS基因转录起始点上游的位置，字母为各位点的碱基；图2是四个苹果品种的果实虎皮病性状与本发明找出的FPPS基因转录起始点上 游-262bp、_321bp、_434bp、_440bp与_600bp处突变位点的碱基信息;图3是本发明第一个实施例四个苹果品种PCR扩增产物的电泳图，图中M.DNA 分子量标记，数字和bp为标记大小与单位，1.金冠，2.皇家嘎拉，3.国光，4.青香蕉；图4是第二个实施例五个苹果品种的果实虎皮病性状与本发明找出的FPPS基因 转录起始点上游_262bp与_434bp两处突变位点的碱基信息；
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。本发明测序方法检测突变实施步骤步骤1，试材金冠和皇家嘎拉两个抗虎皮病苹果品种，青香蕉和红星两个易 发病苹果品种的叶或花。步骤2，基因组DNA提取试材研磨后立即加入预热至65°C的0.6mL 2% CTAB 提取缓冲液[2 % CTAB，100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 2% PVP-40, 2% β-巯基乙醇]，在65°C水浴中提取30min，这期间轻轻倒置样 品试管3次。取出加入0.6mL氯仿异戊醇(24 1)，轻轻翻转，充分混勻，12000rpm 离心lOmin。将上清液转入另一个新试管，加入等体积经_20°C预冷的异丙醇，轻轻摇 勻，在12000rpm离心IOmin后将上清液移去。试管中的DNA球用500 μ L冷的70%乙 醇(_20°C )漂洗2次，将试管置于室温下晾干，加入30 50 μ L灭菌无离子水或0.2Χ的 TE,再加入1 μ LRNase A (2.5mg/ml)处理除去RNA，在4°C冰箱中保存备用，暂时不用的DNA则冷冻保存。步骤3，PCR扩增首先，在突变位点两侧设计正向和反向引物。这 里，利用我们已报道的两个引物βχ和f4X进行PCR扩增，正向引物βΧ序列为 TGTAAGGCGCTAATAAAC，反向引物 f4x 序列为 ATTTCAGAACGGAGTACAC (苑克俊 等，2009，见前面参考文献)。PCR反应液(20 μ L)含有0.5 μ L (25ng)基因组DNA和 19.5 μ L反应混合物，一份混合物由0.4 μ L dNTPs(10mmol/L)、2 μ LlOx Taq缓冲液、 0.5 μ L 正向引物(10ymol/L)、0.5 μ L 反向引物(10ymol/L)、0.25 μ L (5U)的 Taq DNA 聚合酶和15.85 μ L水组成。PCR反应35个循环，每一循环包括94°C变性30s、56°C退 火Imin和72°C引物延伸2min。步骤4，电泳检查将3 μ LPCR产物、6 μ L水和1 μ L上样染料混合，溴化乙 锭染色，在120V电压、1.2%琼脂糖胶上进行电泳检查PCR产物。步骤5，PCR产物测序由专门的生物技术公司进行。如图1所示，在测序 图谱上发现金冠苹果FPPS基因转录起始点上游有四个多态性位点-262G/A、-321Τ/ C、-434Τ/Α、-440C/A。青香蕉和红星两个苹果品种测得的序列完全相同，其相应于上 述四个位点的碱基分别为-262Α、-321Τ、-434Α、-440Α,没有呈现多态性，也就是它 们与金冠苹果测得的序列在上述四个位点有差异。步骤6，等位基因测序根据测得的序列以及在金冠苹果FPPS基因转录 起始点上游-262bp多态性位点处的G/A碱基设计两个反向的等位基因特异性引物 f4p (CAATTTACGAATACATTGTGAC)禾口 f4q (CAATTTACGAATACATTGTGAT)，正向引
物可以继续利用βχ。实际上，我们以前在设计βχ引物时，在它上游还获得一段序列， 虽然不能作为测序结果用，但有些部分用来设计引物还是可以的。为获得更长的序列， 这里我们利用其部分序列fip(CAACGACAGCCTGGATGG)作为正向引物。将引物βρ和f4p配对进行PCR扩增和测序，获得皇家嘎拉苹果的i^psl-l等位 基因序列485bp，结合利用前面βχ和f4x引物的测序结果，获得金冠苹果的:f^psl-l等 位基因序列880bp，获得金冠苹果的fppsl-2等位基因序列834bp ；将引物βρ和f4q配对 进行PCR扩增和测序，并结合利用前面βχ和f4x引物的测序结果，获得青香蕉这个易 发病苹果品种的i^psl_3等位基因序列828bp。前面利用引物βχ和f4x配对进行PCR扩 增和测序，我们已获得红星这个易发病苹果品种的fppsl-3等位基因序列。这些结果表 明，等位基因fppsl-Ι序列在青香蕉和红星两个易发病苹果品种中不存在，在两个抗虎皮 病苹果品种中存在，表明i^psl-l等位基因序列与苹果抗虎皮病性状相关。将等 位基因序列与fppsl-3等位基因序列比对，在FPPS基因转录起始点上游_262bp、-434bp 和-600bp三处位点发现突变。分析这些突变与苹果品种果实虎皮病性状的关系，结果如 图2所示在_262bp位点金冠和皇家嘎拉两个抗虎皮病苹果品种的FPPS基因都含有碱基 G、而青香蕉和红星两个易发病苹果品种的FPPS基因都不含有碱基G ；在_434bp位点金 冠和皇家嘎拉两个抗虎皮病苹果品种的FPPS基因都含有碱基T，而青香蕉和红星两个易 发病苹果品种的FPPS基因都不含有碱基T ；在_600bp位点金冠和皇家嘎拉两个抗虎皮病 苹果品种的FPPS基因都含有碱基C，青香蕉这个易发病苹果品种的FPPS基因不含有碱 基C。这表明新找出_262bp、_434bp和_600bp三个位点突变与苹果果实虎皮病性状相 关，PCR产物测序新获得的突变位点碱基信息可直接用来鉴定苹果品种的果实虎皮病性状，也可用来开发可鉴定苹果品种果实虎皮病性状的分子标记。本发明特异性引物分子标记方法检测突变实施步骤步骤1，试材同上述测序方法。步骤2，基因组DNA提取同上述测序方法。步骤3，PCR扩增根据上述新找出的_262bp、_434bp和_600bp三个位点的 突变设计与苹果果实虎皮病性状相关的等位基因特异性引物检测突变。例如，可以根 据-434bp位点突变设计:φρ3 -1等位基因特异性引物作为正向引物，以f4x作为反向引 物进行PCR扩增。PCR反应液(20 μ L)含有0.5yL(25ng)基因组DNA和19.5 μ L反 应混合物，一份混合物由0.4 μ LdNTPs (10mmol/L)、2 μ L IOx Taq缓冲液、0.5 μ L正向 引物(10ymol/L)、0.5 μ L 反向引物(10ymol/L)、0.25 μ L(5U)的 Taq DNA 聚合酶和 15.85 μ L水组成。PCR反应35个循环，每一循环包括94°C变性30s、56°C退火Imin和 72 °C引物延伸2min。步骤4，电泳检查PCR产物将3 μ LPCR产物、6 μ L水和1 μ L上样染料混 合，溴化乙锭染色，在120V电压、1.2%琼脂糖胶上进行电泳检查PCR产物。某苹果品 种PCR扩增产物出现一条带时，该品种果实虎皮病性状可鉴定为抗虎皮病；某苹果品种 PCR扩增产物没有出现带时，该品种苹果果实虎皮病性状可鉴定为易感虎皮病。H日月CAPS好椒昨體泖丨制聚步骤1，试材同上述测序方法。步骤2，基因组DNA提取同上述测序方法。步骤3，PCR扩增鉴于CAPS分子标记是指切割扩增的多态性序列标记 (Cleavedamplified polymorphic sequence)，新找出的 _262bp 位点是一个可被 Nsp I (或 Afl III或PciI或Mae III或Fat I)限制性内切酶酶切的位点，新找出的_600bp位点是一个可被 Fnu4H I限制性内切酶酶切的位点，_262bp和_600bp位点突变与苹果果实虎皮病性状相 关，表明可利用新获得的_262bp和_600bp位点突变开发CAPS分子标记鉴定苹果果实虎 皮病性状。这里以_262bp位点两侧设计的两个引物βχ和f4x为例说明。以βχ作为正 向引物，以f4x作为反向引物进行PCR扩增。PCR反应液(20 μ L)含有0.5 yL (25ng)基 因组DNA和 19.5 μ L 反应混合物，一份混合物由 0.4 μ LdNTPs (10mmol/L)、2 μ LlOx Taq 缓冲液、0.5口1^正向引物(1(^11101/0、0.5口1^反向引物(10口11101/0、0.25yL(5U)的 Taq DNA聚合酶和15.85 μ L水组成。PCR反应35个循环，每一循环包括94°C变性30s、 56°C退火Imin和72 °C引物延伸2min。步骤4，电泳检查PCR产物将3 μ LPCR产物、6 μ L水和1 μ L上样染料混合， 溴化乙锭染色，在120V电压、1.2%琼脂糖胶上进行电泳检查PCR产物。步骤5，酶切实验取5μ LPCR产物加入试管中，再加入2μ L反应缓冲液 (IOx)、1 μ L (10U)限制性内切酶 Nsp I (或 Afl III 或 Pci I 或 Mae III 或 Fat I 或 Fnu4H I)
和12 μ L水，在适宜酶切温度水浴2 3h进行酶切，上述各酶的适宜酶切温度可从购买 的限制性内切酶说明书上查到。步骤6，电泳检查酶切产物20 μ L酶切产物加5 μ L上样染料混合，溴化乙锭 染色，在120V电压、1.2%琼脂糖胶上进行电泳检查酶切产物。某苹果品种PCR扩增产 物被酶切时，出现比PCR扩增产物带较小的带，该品种可鉴定为抗虎皮病品种；某苹果品种PCR扩增产物没有被酶切时，仅出现一条PCR扩增产物带，该品种可鉴定为易发虎 皮病品种。实施例1 特异件引物分子标记法检测突变、鉴定苹果品种或杂交后代果实虎 皮病件状步骤1，试材国光、青香蕉、金冠和皇家嘎拉四个苹果品种的叶或花，其中 皇家嘎拉是金冠的杂交后代。步骤2，基因组DNA提取试材研磨后立即加入预热至65°C的0.6mL 2% CTAB 提取缓冲液[2 % CTAB，100mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl, 2% PVP-40, 2% β-巯基乙醇]，在65°C水浴中提取30min，这期间轻轻倒置样 品试管3次。取出加入0.6mL氯仿异戊醇(24 1)，轻轻翻转，充分混勻，12000rpm 离心lOmin。将上清液转入另一个新试管，加入等体积经_20°C预冷的异丙醇，轻轻摇 勻，在12000rpm离心IOmin后将上清液移去。试管中的DNA球用500 μ L冷的70%乙 醇(_20°C )漂洗2次，将试管置于室温下晾干，加入30 50 μ L灭菌无离子水或0.2Χ的 TE,再加入1 μ LRNase A (2.5mg/ml)处理除去RNA，在4°C冰箱中保存备用，暂时不用 的DNA则冷冻保存。步骤3，PCR扩增以βρ作为正向引物，以根据_262bp位点突变设计的 fppsl-Ι等位基因特异性引物f4p作为反向引物进行PCR扩增。PCR反应液(20 μ L)含有 0.5 μ L (25ng)基因组DNA和19.5 μ L反应混合物，一份混合物由0.4 μ LdNTPs (lOmmol/ L)、2 μ LlOx Taq 缓冲液、0.5 μ L 正向引物(10ymol/L)、0.5 μ L 反向引物(IOymol/ L)、0.25 μ L (5U)的Taq DNA聚合酶和15.85 μ L水组成。PCR反应35个循环，每一循 环包括94°C变性30s、56°C退火Imin和72 °C引物延伸2min。步骤4，电泳检查PCR产物将3 μ LPCR产物、6 μ L水和1 μ L上样染料混合， 溴化乙锭染色，在120V电压、1.2%琼脂糖胶上进行电泳检查PCR产物，获得分子标记 结果如图3所示。步骤5，苹果品种果实虎皮病性状分析鉴于新找出的_262bp位点突变与苹果 果实虎皮病性状相关，表明利用新获得的_262bp突变位点碱基信息开发的分子标记可鉴 定苹果品种果实虎皮病性状。本实施例苹果品种中，金冠及其杂交后代皇家嘎拉两个品 种PCR扩增产物出现一条带，可鉴定为抗虎皮病品种，实际上它们确实是抗虎皮病的； 青香蕉和国光两个苹果品种PCR扩增产物没有出现该条带，可鉴定为易发虎皮病品种， 实际上它们确实是易发虎皮病的。^MM 2 禾U用测丨序方法获f导突变位点碱言肩、鉴定苹果品种或杂交后代的虎 皮病性状步骤1，试材富士、国光、青香蕉、红星、金冠五个苹果品种的叶或花，其 中富士是国光的杂交后代。步骤2，基因组DNA提取同前述分子标记法。步骤3，PCR扩增以βχ作为正向引物，以f4x作为反向引物进行PCR扩增。 PCR反应液(20 μ L)含有0.5 μ L(25ng)基因组DNA和19.5 μ L反应混合物，一份混合 物由 0.4yL dNTPs(10mmol/L)、2 μ LlOx Taq 缓冲液、0.5 μ L 正向引物(10 μ mol/L)、 0.5口]^反向引物(1(^11101/0、0.25 μ L(5U)的TaqDNA聚合酶和 15.85 μ L水组成。PCR反应35个循环，每一循环包括94°C变性30s、56°C退火Imin和72°C引物延伸2min。步骤4，电泳检查将3 μ LPCR产物、6 μ L水和1 μ L上样染料混合，溴化乙 锭染色，在120V电压、1.2%琼脂糖胶上进行电泳检查PCR产物。步骤5，PCR产物测序由专门的生物技术公司进行。获得测序图谱后，检查 在FPPS基因转录起始点上游_262bp、-434bp两个位点的碱基。步骤6，苹果品种果实虎皮病性状分析以_262bp位点突变为例。鉴于新找出 的苹果FPPS基因转录起始点上游_262bp位点突变与苹果果实虎皮病性状相关，表明利 用新获得的_262bp突变位点碱基信息可鉴定苹果品种或杂交后代的果实虎皮病性状。本 实施例五个苹果品种中，金冠苹果的FPPS基因_262bp位点含有G，该品种果实虎皮病性 状可鉴定为抗虎皮病，实际上该品种确实是抗虎皮病的；富士、国光、青香蕉、红星苹 果的FPPS基因_262bp位点不含有G，这四个品种苹果果实虎皮病性状可鉴定为易感虎皮 病，实际上这四个品种确实是易发虎皮病的。我们也可以采用_434bp位点突变进行分析。鉴于新找出的_434bp位点突变与 苹果果实虎皮病性状相关，表明利用新获得的_434bp突变位点碱基信息可鉴定苹果品种 或杂交后代的果实虎皮病性状。本实施例苹果品种中，金冠苹果的FPPS基因_434bp位 点含有T，该品种果实虎皮病性状可鉴定为抗虎皮病，实际上该品种确实是抗虎皮病的； 富士、国光、青香蕉、红星苹果的FPPS基因_434bp位点不含有T，这四个品种苹果果实 虎皮病性状可鉴定为易感虎皮病，实际上这四个品种确实是易发虎皮病的。实施例3 利用CAPS分子标记法检测突变、鉴定苹果品种虎皮病性状步骤1，试材金冠、皇家嘎拉、富士、国光、红星、青香蕉六个常见苹果品 种的叶或花。步骤2，基因组DNA提取同前述分子标记法。步骤3，PCR扩增以βχ作为正向引物，以f4x作为反向引物进行PCR扩增。 PCR反应液(20 μ L)含有0.5 μ L(25ng)基因组DNA和19.5 μ L反应混合物，一份混合 物由 0.4yLdNTPs(10mmol/L)、2 μ L IOx Taq 缓冲液、0.5yL 正向引物(10ymol/L)、 0.5口]^反向引物(1(^11101/0、0.25 μ L(5U)的TaqDNA聚合酶和 15.85 μ L水组成。PCR 反应35个循环，每一循环包括94°C变性30s、56°C退火Imin和72°C引物延伸2min。步骤4，酶切实验取5μ LPCR产物加入试管中，再加入2μ L反应缓冲液 (IOx), IuL(IOU)限制性内切酶Nsp I和12 μ L水，在37°C水浴2 3h进行酶切。步骤5，电泳检查酶切产物20 μ L酶切产物加5 μ L上样染料混合，溴化乙锭 染色，在120V电压、1.2%琼脂糖胶上进行电泳检查酶切产物。本实施例六个苹果品种 中，金冠和皇家嘎拉两个苹果品种，其FPPS基因的_262bp位点是一个可被Nsp I限制 性内切酶酶切的位点，故PCR扩增产物可被酶切，电泳后出现比PCR扩增产物带较小的 带，可鉴定为抗虎皮病品种，实际上这两个品种确实是抗虎皮病的；富士、国光、红星 和青香蕉四个苹果品种，其FPPS基因的_262bp位点不是一个酶切位点，故PCR扩增产 物不被酶切，仅出现一条PCR扩增产物带，可鉴定为易发虎皮病品种，实际上这四个品 种确实是易发虎皮病的。
权利要求
1.苹果FPPS基因的一处突变，其特征是在FPPS基因转录起始点上游_262bp处 (对应于序列表SEQ ID No 1所述序列477bp处)的碱基发生与苹果果实虎皮病性状相 关的杂合突变A —G/A(或者说等位基因突变A —G)；基于该处突变可开发检测方法鉴 定苹果果实虎皮病性状。
2.苹果FPPS基因的一处突变，其特征是在FPPS基因转录起始点上游_434bp处 (对应于序列表SEQ ID No 1所述序列305bp处)的碱基发生与苹果果实虎皮病性状相 关的杂合突变A —T/A(或者说等位基因突变A—T)；基于该处突变可开发检测方法鉴 定苹果果实虎皮病性状。
3.苹果FPPS基因的一处突变，其特征是在FPPS基因转录起始点上游_600bp处 (对应于序列表SEQ ID No 1所述序列139bp处)的碱基发生与苹果果实虎皮病性状相 关的杂合突变G — C/G或者突变G — C ；基于该处突变可开发检测方法鉴定苹果果实虎 皮病性状。
4.一种检测上述权利1或2或3所述突变的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤步骤1 提取DNA样本；步骤2:利用上述权利1或2或3所述突变设计一个等位基因特异性引物，利用FPPS 基因序列一个普通正向引物； 步骤3:进行PCR扩增； 步骤4:电泳检查PCR产物。
5.—种检测上述权利1或2或3所述突变的测序方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤1 提取DNA样本；步骤2:利用上述权利1或2或3所述突变设计两个等位基因特异性引物，在上述权 利1或2或3所述突变位点一侧利用FPPS基因序列一个与两个等位基因特异性引物配对 的引物；步骤3:进行PCR扩增；步骤4 普通琼脂糖电泳检测PCR产物；步骤5: PCR产物测序检测突变。
6.—种检测上述权利1或2或3所述突变的测序方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤1 提取DNA样本；步骤2 在上述权利1或2或3所述突变两侧利用FPPS基因设计一个正向引物和一 个反向引物；步骤3:进行PCR扩增；步骤4 普通琼脂糖电泳检测PCR产物；步骤5: PCR产物测序、在测序图谱上检查上述权利1或2或3所述突变相应位点的碱基。
7.—种检测上述权利1或3所述突变的CAPS分子标记方法，其特征在于，包括以下 步骤步骤1 提取DNA样本；步骤2 在上述权利1或3所述突变两侧利用FPPS基因设计引物；步骤3:进行PCR扩增； 步骤4:电泳检查PCR产物；步骤5 用可切割上述权利1或3所述突变处序列的限制性内切酶酶切PCR产物； 步骤6:普通琼脂糖电泳检测酶切产物。
8.苹果的一个FPPS等位基因，它的核苷酸序列如序列表SEQID No: 1所述，其特 征是该等位基因转录起始点上游_262bp、-434bp和_600bp处(分别对应于序列表SEQ ID No 1所述序列477bp、305bp和139bp处)的碱基分别为G、T和C，该等位基因与 苹果抗虎皮病性状相关。
9.根据权利要求1或2或3所述的突变，其特征是可以用来鉴定苹果品种及杂交后 代的果实虎皮病性状，因此可对苹果杂交后代的果实虎皮病性状进行早期选择，为苹果 果实虎皮病性状改良提供一种有效的分子育种手段。
全文摘要
苹果FPPS基因的三处突变及其鉴定方法本发明属生物技术领域，为培育抗虎皮病苹果品种提供了一种简单易用、节省成本的分子标记育种预选手段。利用苹果FPPS基因序列设计引物，以苹果基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增片段。对抗虎皮病苹果品种和易感虎皮病苹果品种的PCR扩增片段进行测序和分析，在FPPS基因转录起始点上游-262bp、-434bp与-600bp三处找出与苹果虎皮病性状相关的基因突变。通过分子标记或测序方法检测突变，可鉴定苹果品种及杂交后代果实虎皮病性状，对苹果杂交后代果实虎皮病性状进行早期选择，节省后代植株的管理与筛选成本。
文档编号C12N15/52GK102010905SQ201010527099
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者刘庆忠, 艾呈祥, 苑克俊, 魏海蓉 申请人:山东省果树研究所