专利名称：一种以腺病毒表达系统产生的人逆转录泡沫病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种以腺病毒表达系统产生的人逆转录泡沫病毒载体。
背景技术：
基因治疗作为常规药物治疗的替代或(和)补充疗法，正以日新月异的速度发展。 基因治疗对象已从单基因遗传病扩展到多基因遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、艾滋病以及 神经系统疾病，目前全球已有1，340种基因治疗方案用于临床。基因治疗的载体主要有非 病毒性载体和病毒性载体。非病毒性载体虽然制备简单、拥有较大的外源基因携带容量，但 是其转染效率较低、外源基因不能长期表达并常有细胞毒性。病毒性载体的优点是转导效 率高、外源基因能够实现长期表达，但是其安全性、免疫原性是主要问题。因此构建安全、有 效的基因载体一直是基因治疗的瓶颈。腺病毒载体(Adenovirus Vector，AdV)是已经进入人类基因治疗临床实验的载体 之一。与其他病毒载体相比较，腺病毒载体显著的优点是1)能非常容易地获得高滴度的 病毒载体，未经浓缩的病毒载体即可达到lX109pfu/ml ；2)能在体外体内有效地转导各种 组织来源细胞；3)其介导的基因转移不依赖细胞是否分裂。腺病毒载体也存在明显缺点， 病毒基因组不能整合到宿主细胞基因组中导致转移基因不能长期表达。逆转录病毒是人们熟知的能整合到宿主细胞基因组中的一大类病毒，其中正逆转 录病毒亚科(Orthoretrovirinae)的伽马逆转录病毒属(Gamma—retrovirus)禾口慢病毒属 (Lentivirus)的成员都有应用为病毒载体的，但是它们具有的潜在致病性限制了临床上的 使用。泡沫病毒亚科是逆转录病毒科的第二个亚科，长期的研究确认其无致病性，现在正成 为病毒载体开发的“明星”。人泡沫病毒(Human Foamy Virus, HFV)显示出作为基因表达 载体的良好的应用前景1)迄今为止没有HFV与人类疾病直接相关的研究报道，HFV载体有 很高的安全性；2)HFV自然感染发生率极低，人体没有相应抗体，HFV载体不易被血清灭活； 3)HFV宿主广泛；4)HFV具有比其它逆转录病毒更复杂的复制调控过程，在缺乏反式激活因 子Bel-I时，HFV启动子不能启动病毒复制，因此HFV易于构建复制缺陷型载体，保证其安全 性；5) HFV载体可以有效地整合于宿主细胞染色体，实现长期稳定地表达外源基因；6) HFV 整合位点多为基因表达序列外的CpG岛，其整合对宿主基因表达无明显影响。目前，德国和 美国都在积极开发相关的泡沫病毒载体并应用于造血干细胞的基因治疗研究。本发明的完 成人在国内外率先开展将HFV作为载体进行神经系统疾病基因治疗的研究，已成功构建了 复制缺陷型HFV载体，并运用该载体介导谷氨酸脱羧酶基因进行了神经系统疾病基因治疗 的探索。但是，由于HFV独特复杂的复制过程，有效的HFV载体包装细胞系难以建立，目前 HFV载体的产生依赖多个质粒的瞬时共转染，导致产生的载体滴度低下，一般未经浓缩的滴 度约IO3-IO4转导单位/ml。经过费时费力的超速离心等方法浓缩后，病毒载体方可达到应 用浓度(》IO5转导单位/ml)，这大大限制了 HFV载体在体外和体内的应用。兼具有腺病毒高滴度和逆转录病毒稳定表达特性的腺病毒-人泡沫病毒嵌合 载体(AdY-HFV Chimeric Vector)可能提供解决办法。嵌合病毒(Chimeric or HybridViruses)并非新概念，多年前病毒学家们就将其作为一种工具在使用，例如，假型病毒 (Pseudotype Viruses)改变病毒表面糖蛋白为另外一种病毒的，以改变病毒亲嗜性。前期 有研究者希望结合腺病毒和逆转录病毒的优点构建了腺病毒-鼠白血病病毒(AdV-MLV)嵌 合载体并进行了相应研究，结果显示AdV-MLV嵌合载体兼具有高滴度和稳定表达的特性， 但是由于MLV安全性问题，MLV载体在临床实验时引发两名儿童白血病样的疾病，研究遭到 终止。因此认为以更具优点更安全的HFV替代MLV,以腺病毒系统提高HFV载体滴度，构建 具有高滴度和稳定表达特性的AdV-HFV嵌合载体应该是替代AdV-MLV载体的有效方案，同 时也是显著提高HFV载体滴度使HFV载体能进行体内应用的有效方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种安全、高效的逆转录病毒载体，其没有任 何病毒编码序列，避免了野生型病毒载体可能产生的风险，但仍能够有效地表达外源基因。本发明提供的逆转录病毒载体来源于人泡沫病毒(HFV)，但仅包含1)HFV病毒复制装配所必需的顺式序列(CAS)。在本发明中，“顺式序列”指DNA分 子中具有特殊功能的转录因子结合位点和其它调控基序。详细的说，顺式序列包括CASl和 CAS2两部分。其中CASl包含引物结合位点、包装信号Φ的序列；CAS2包括病毒转录活性 所必须的一段来源于pol基因的序列。2) HFV病毒的长末端重复序列(LTR)。3)改造的增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的编码序列。该序列来源于pEGFPAl质 粒。详细的说，根据pEGFP-Nl质粒中所携带的经过改造的eGFP基因序列设计引物，扩增包 含eGFP编码框架的片段。兼具腺病毒高滴度和HFV安全、能稳定表达优点的AdV-HFV嵌合载体是生产HFV 载体的基础，这些嵌合载体包括1)对HFV病毒基因组进行精减，仅保留HFV LTR和其复制装配所必需的顺式序列 CAS,并插入eGFP序列作为报告基因，构建的pAdV-HFVcis嵌合质粒载体；2)HFV的结构蛋白基因(gag、pol和env基因)插入AdV载体质粒中，构建的 pAdV-Gag、pAdV-Pol 和 pAdV-Env。本发明分别构建了四个携带HFV病毒蛋白、以及HFV基因组上必要顺势序列的 AdV-HFV质粒载体(附图1)。经过转染细胞，可以获得四种AdV-HFV嵌合病毒载体。这四 种嵌合病毒载体可以作为种子，不断感染细胞，产生高低度的HFV病毒载体。本发明避免了 原有的需要不断制备HFV质粒，并且需要多个质粒的瞬时共转染才能产出HFV载体的繁琐、 费时的生产过程。而且本发明所产生的HFV病毒载体不经浓缩即可达到IO5转导单位/ml， 滴度明显高于现有技术所制备的HFV病毒载体。本发明的HFV病毒载体可以进一步的含有一个可用于进行基因治疗的目的基因。 仅当需要该基因表达时，可以切除eGFP的编码序列，插入目的基因的编码序列。或者还 可以进一步的在eGFP上游引入IRES(内部核糖体进入位点，internal ribosomal entry site)，目的在于表达两个或更多个外源基因。本发明的HFV病毒载体可以进一步含有一个 可筛选的标记基因，例如NEO(新霉素抗性)基因。
图1 =AdV-HFV嵌合载体基因组结构示意图。ITR :AdV反向末端重复序列，Pqime 人 巨细胞病毒早期启动子，Ad DNA 腺病毒载体必需序列，5LTR/3LTR =HFV长末端重复序列， φ HFV 包装信号，pA :SV40polyA。图2 制备PAdV-Gag的方法。图3 制备pAdV-Pol的方法。图4 制备pAdV-Env的方法。图 5-1 和 5-2 ；制备 pAdV-HFVcis 的方法。图 6 :pShuttle-gag、pShuttle-pol、pShuttle-env 的酶切鉴定图。质粒本发明 所构建的 pShuttle-gag、pShuttle-pol、pShuttle-env 重组质粒；EcoR V、Nco I、Nhe I 表 示用相应的限制性内切酶进行单酶切后的电泳结果；Apa Ι/Κρη I表示进行双酶切后的电 泳结果。最左侧标注的为Marker条带大小。图 7 :pShuttle-HFVcis 的 PCR 鉴定图。5LTR-CAS1、CAS2、3LTR 和 eGFP 分别表示 以pShuttle-HFVcis为模板，用相应引物进行PCR得到的扩增产物的电泳结果。最左侧标 注的为Marker条带大小。图 8 :pAdV-Gag、pAdV-Pol、pAdV-Env 和 pAdV-HFVcis 的酶切鉴定图。pAdV-Gag、 pAdV-Pol、pAdV-Env和pAdV-HFVcis分别代表相应质粒载体进行I-CeuI/PI_Sce I双酶切 后的电泳结果。最左侧标注的为Marker条带大小。图9 =HFV病毒载体感染BHK-21细胞后eGFP的表达。IiT1、1(Γ2和1(Γ3分别表示不 同稀释浓度的含有HFV病毒载体的上清液感染ΒΗΚ-21细胞后，HFV病毒载体所携带的eGFP 的表达情况。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例1 载体pAdV-Gag的构建载体pAdV-Gag的构建过程见附图2。具体的说，为了获得人泡沫病毒gag编码序 列，以pHSRV13作为PCR模版、SEQ ID NO. 1 (GAGF)和2 (GAGR)的合成寡核苷酸作为引物进 行PCR。用含IOOng模版质粒DNA和1 μ 1各种引物(IOpmol/ μ 1)的50 μ 1 PCR反应液进 行30次PCR扩增反应循环，每次循环为94°C 30秒(变性),64°C 30秒(退火)和72°C 2分 钟(聚合)。对gag的扩增片段进行Apa I和Kpn I酶切，插入pShuttle载体(Clontech， USA)的Apa I-Kpn I位点，产生pShuttle-gag。对构建的pShuttle-gag进行酶切鉴定， EcoR V单酶切得到约6. Ikb 一条带，Apa I/Kpn I双酶切得到4. Ikb和2. Okb两条带，验证 正确(附图6)。对pShuttle-gag 进行 I-Ceu I 和 ΡΙ-Sce I 酶切，插入 pAdeno-X ViralDNA (Clontech, USA)的 I-Ceu I 和 PI-Sce I 位点，产生 pAdV-Gag 质粒载体。对 pAdV-Gag进行酶切鉴定，I-Ceu I/PI-Sce I双酶切获得约32. 7kb和3. 3kb的两条带，验证 正确(附图8)。实施例2 载体pAdV-Pol的构建载体pAdV-Pol的构建过程见附图3。具体的说，为了获得人泡沫病毒pol编码序列，以PHSRV13作为PCR模版、SEQ ID NO. 3 (POLF)和4 (POLR)的合成寡核苷酸作为引物进 行PCR。用含IOOng模版质粒DNA和1 μ 1各种引物(IOpmol/ μ 1)的50 μ 1 PCR反应液进 行30次PCR扩增反应循环，每次循环为94 °C 30秒(变性)、63°C 30秒(退火)和72 °C 3 分30秒(聚合)。对pol的扩增片段进行Apa I和KpnI酶切，插入pShuttle载体的Apa I-Kpn I位点，产生pShuttle-pol。对构建的pShuttle-pol进行酶切鉴定，Nco I单酶切 得到约1. 9kb和5. 7kb两条带，Apa I/Kpn I双酶切得到4. Ikb和3. 5kb两条带，验证正确 (附图6)。对pShuttle-pol 进行 I-Ceu I 和 ΡΙ-Sce I 酶切，插入 pAdeno-X Viral DNA 的 I-Ceu I 和 PI-Sce I 位点，产生 pAdV-Pol。对 pAdV-Pol 进行酶切鉴定，I-CeuI/PI-Sce I 双酶切获得约32. 7kb和4. 8kb的两条带，验证正确(附图8)。实施例3 载体DAdV-Env的构建载体pAdV-Env的构建过程见附图4。具体的说，为了获得人泡沫病毒env编码序 列，以PHSRV13作为PCR模版、SEQID N0. 5 (ENVF)和6 (ENVR)的合成寡核苷酸作为引物进行 PCR0用含IOOng模版质粒DNA和1 μ 1各种引物(IOpmol/ μ 1)的50 μ 1 PCR反应液进行 30次PCR扩增反应循环，每次循环为94 °C 30秒(变性)、65°C 30秒(退火)和72 °C 3分 种(聚合)。对env的扩增片段进行Apa I和KpnI酶切，插入pShuttle载体的Apa I-Kpn I位点，产生pShuttle-env。对构建的pShuttle-env进行酶切鉴定，NheI单酶切得到约 2. 8kb和4. 3kb两条带，Apa I/Kpn I双酶切得到4. Ikb和3. Okb两条带，验证正确(附图 6)。对pShuttle-env 进行 I-Ceu I 和 ΡΙ-Sce I 酶切，插入 pAdeno-X Viral DNA 的 I-Ceu I 和 PI-SceI 位点，产生 pAdV-Env。对 pAdV-Env 进行酶切鉴定，I-CeuI/PI-Sce I 双 酶切获得约32. 7kb和4. 3kb的两条带，验证正确(附图8)。实施例4 载体pAdV-HFVcis的构建载体pAdV-HFVcis的构建过程见附图5-1，5-2。以pHSRV13作为PCR模版，SEQ ID NO. 7(51F)和8(51R)的合成寡核苷酸作为引物进行PCR扩增5LTR-CAS1片段；SEQ ID N0. 9 (CAS2F)和10 (CAS2R)的合成寡核苷酸作为引物进行PCR扩增CAS2片段；SEQ ID NO. 1K3LTRF)和12(3LTRR)的合成寡核苷酸作为引物进行PCR扩增3LTR片段。扩增体系同 上文所述，三个片段的退火温度分别为63°C、59°C和63°C，聚合时间分别为1分种、2分30 秒和1分30秒，其他条件均如上文所述。对5LTR-CAS1片段分别进行NheI和ApaI酶切， 插入 pShuttle 载体的 NheI-ApaI 位点，产生 pShuttle_5LTR_CASl。对 CAS2 片段进行 XbaI 酶切，插入 pShuttle-5LTR-CASl 的 XbaI 位点，产生 pShuttle-5LTR-CASl_CAS2。对 3LTR 片 段依次进行 BstXI 和 KpnI 酶切，插入 pShuttle-5LTR-CAS-l-CAS2 的 BstXI-KpnI 位点，产 生 pShuttle-5LTR-CASl-CAS2-3LTR。为了获得绿色荧光蛋白EGFP编码序列，以pEGFP-Nl (Clontech，USA)作为PCR模 版、SEQ ID N0. 13 (CENF)和H(CENR)的合成寡核苷酸作为引物进行PCR。用含IOOng模版 质粒DNA和1 μ 1各种引物(IOpmol/ μ 1)的50 μ 1 PCR反应液进行30次PCR扩增反应循 环，每次循环为94°C 30秒(变性)、62°C 30秒(退火)和72°C 2分种(聚合)。对EGFP 的扩增片段进行NotI酶切，插入pShuttle-5LTR-CASl-CAS2-3LTR 的NotI 位点，产生ρ Shuttle-5LTR-CAS1-CAS2-EGFP-3LTR。本载体携带HFV的必要顺式元件，为病毒载体必需序
6列，最终命名为pShuttIe-HFVciS。对构建的pShuttIe-HFVcis 进行 PCR 鉴定。以 IOOng 的 pShuttle-HFVcis 质粒为 模版，分别用上述引物扩增665bp的5LTR-CAS1片段、2038bp的CAS2片段、1149bp的3LTR 片段和1415bp的eGFP片段，结果表明载体构建成功(附图7)。对pShutt le-HFVc is 进行 I-Ceu I 和 ΡΙ-Sce I 酶切，插入 pAdeno-X ViralDNA 的 I-Ceu I 和 PI-Sce I 位点，产生 pAdV-HFVcis。对 pAdV-HFVcis 进行酶切鉴定，I-Ceu I/ PI-Sce I双酶切获得约32. 7kb和6. 6kb的两条带，验证正确(附图8)。实施例5 载体的牛产用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养293a细胞。以4xl05细胞/孔接种6 孔细胞培养板，培养至细胞浓度达到70-80%进行转染(约24小时)。质粒pAdV-Gag、 pAdV-Pol、pAdV-Env和pAdV-HFVcis用Pac I酶切，获得线性的AdV基因组。各取4ug进 行细胞转染。培养10-14天后收集培养基，通过0.45mm滤膜过滤，分别收获含有AdV-Gag、 AdV-Po 1、AdV-Env和AdV-HFV cis重组病毒的上清液。过滤液立即使用或者_80°C冻存。用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养BHK-21细胞。以2xl06个细胞接种 IOcm的细胞培养皿，培养至细胞浓度达到70%进行感染。等比例混合四种病毒(AdV-Gag、 AdV-Pol、AdV-Env和AdV-HFVcis)的过滤液，加入细胞进行孵育感染，4天后收获HFV病毒 载体。细胞培养液低速离心后通过0. 45um滤膜，得到含有病毒载体颗粒的上清；同时细胞 经消化浓缩于小体积培养液中，反复冻融三次，离心并过0. 45um滤膜去除细胞碎片，得到 含有病毒载体颗粒的上清。合并所得的上清，分成小份冻存于-80°C备用。实施例5 载体的滴度测定按IxlO5个BHK-21细胞每孔接种24孔板培养约24小时。用10倍系列稀释的含 有HFV病毒载体的上清液感染细胞，每个稀释浓度重复三个孔。48小时后，利用倒置荧光显 微镜观察eGFP表达的情况(附图9)。用软件计数每孔中表达eGFP的细胞数目，取三孔的 平均值，再根据稀释倍数推算实施例5中由腺病毒介导产生的HFV病毒载体的滴度。实验 重复三次，最后计算出本发明所产生的HFV病毒载体滴度为IO5荧光细胞数目/mL。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
一种以腺病毒表达系统产生的人逆转录泡沫病毒载体，其特征在于，来源于人泡沫病毒HFV，仅包含1)HFV病毒复制装配所必需的顺式序列CAS；2)HFV病毒的长末端重复序列LTR；3)改造的增强型绿色荧光蛋白eGFP的编码序列；该病毒载体还包括AdV HFV嵌合载体，这些嵌合载体包括1)对HFV病毒基因组进行精减，仅保留HFV LTR和其复制装配所必需的顺式序列CAS，并插入eGFP序列作为报告基因，构建的pAdV HFVcis嵌合质粒载体；2)HFV的结构蛋白基因插入AdV载体质粒中构建的pAdV Gag、pAdV Pol和pAdV Env，HFV的结构蛋白基因包括gag、pol和env基因。
全文摘要
本发明公开了一种以腺病毒表达系统产生的人逆转录泡沫病毒载体，来源于人泡沫病毒HFV，仅包含1)HFV病毒复制装配所必需的顺式序列CAS；2)HFV病毒的长末端重复序列LTR；3)改造的增强型绿色荧光蛋白eGFP的编码序列；该病毒载体还包括AdV-HFV嵌合载体，这些嵌合载体包括1)对HFV病毒基因组进行精减，仅保留HFV LTR和其复制装配所必需的顺式序列CAS，并插入eGFP序列作为报告基因，构建的pAdV-HFVcis嵌合质粒载体；2)HFV的结构蛋白基因插入AdV载体质粒中构建的pAdV-Gag、pAdV-Pol和pAdV-Env，HFV的结构蛋白基因包括gag、poi和env基因。
文档编号C12N15/867GK101979606SQ201010526889
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月1日 优先权日2010年11月1日
发明者何小华, 刘万红, 孙燕, 李文鑫, 李治, 杨频, 魏琳岚 申请人:陕西师范大学