专利名称：与植物耐逆性相关蛋白ZmSAPK8及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与植物耐逆性相关蛋白ZmSAPKS及其编码基因与应用。
背景技术：
全世界有3. 8亿公顷盐碱土地。在我国耕地中有10%为盐渍化土壤，严重影响着现代农业的发展。在人口不断增长的今天，扩大可耕种土地面积，提高耕地单位面积产量以解决粮食问题已经成为亟待解决的问题。与利用工程手段改变环境以适应植物的需要相比，运用生物手段改变植物本身，使之适应环境是更为积极主动且长期有效的措施。因此， 植物基因工程研究已经成为改良作物、提高产量的重要手段，因而克隆获得抗逆性较好的基因已经成为植物基因工程研究的重心。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与植物耐逆性相关蛋白ZmSAPKS及其编码基因。本发明所提供的蛋白质，名称为ZmSAPKS，人工合成，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。上述序列表中序列2由366个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述与植物耐逆性相关的蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。所述编码基因为如下1)或2)或3)或4)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第60-1160位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述与植物耐逆性相关蛋白质的DNA分子；4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且编码与所述植物耐逆性相关蛋白质的DNA分子。其中，序列表中序列1由1386位脱氧核糖核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第60-1160位碱基。所述严格条件也可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用 2 XSSC,0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。含有上述蛋白编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为在pCAMBIA3301的BglII和BstEII位点间插入序列表中序列1的核苷酸得到的pCAMBIA3301-ZmSAPK8。
扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。引物对中的一条引物为序列表中序列3所示的DNA分子，另一条引物为序列表中序列 4所示的DNA分子。本发明的另一个目的是提供培育耐逆性提高的转基因植物的方法。本发明所提供的方法，是将所述的编码基因导入目的植物得到的转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。所述耐逆性为耐盐性。所述编码基因是通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。所述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物优选为拟南芥。本发明的实验证明，用克隆的方法得到ZmSAPKS基因，将其导入拟南芥中得到的转基因拟南芥，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的耐逆性高于野生型拟南芥，耐逆性表现在耐盐性的。本实验得到的ZmSAPKS基因和转基因拟南芥在植物遗传育种方面有重要的
眉、ο
图1为菌液PCR鉴定转化pCAMBIA3301-ZmSAPK8的阳性克隆图2为转基因拟南芥植株的分子检测图3为RT-PCR方法检测转基因纯和株系中ZmSAPK8的表达情况图4为野生型拟南芥与T3代转基因株系在NaCl处理下的存活率图5为野生型拟南芥与T3代转基因株系在NaCl处理下的持绿性图6为盐胁迫对野生型拟南芥及转基因株系的脯氨酸含量的影响
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、ZmSAPK8的获得提取玉米(CN165，Zea mays L.)的DNA， 用正向引物 CCTTCTCACGGAATCCTACCATTA,反向引物TCCAAAGCCCAGTAACCAGGAAG，进行 PCR 扩增，得至Ij 1386bp的片段。也可人工合成序列1，用正向引物CCTTCTCACGGAATCCTACCATTA，反向引物 TCCAAAGCCCAGTAACCAGGAAG 进行 PCR 扩增，同样得到 PCR 产物。将该PCR产物送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列1自5 ‘末端第 1-1386位核苷酸，该PCR产物的基因命名为ZmSAPKS，该基因的编码区为序列表中序列1的自5 ‘末端第60-1160位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为ZmSAPKS，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。序列1由1386个核苷酸组成，序列2由366个氨基酸组成。实施例2、转ZmSAPKS拟南芥的获得及功能研究一、转ZmSAPK8拟南芥的获得1、表达载体构建及PCR分子检测将实施例1得到的PCR产物用如下引物进行再次PCR
正向引物(BglII) TAGATCTATGGCAGGGCCGGCGCCGGA (序列 3，下划线为酶切位
占). /、、、 / 反向引物(BstEII)TTGGTAACCTCACATTGCGTACACAATCTCA(序列 4,下划线为酶切位点)将得到的PCR产物经BglII和BstEII双酶切得到的小片段与经过同样酶切得到的 pCAMBIA3301 (以下简称 p3301，Canberra，Australia，Wang MY, Gu D，Liu TS, Wang ZQ, Guo XY, Hou W, Bai YF, Chen XP, Wang GY. 2007. Overexpression of a putative maize calcineurin B-Iike protein in Arabidopsis confers salt tolerance. Plant Mol Biol. 65:733-746.，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)载体大片段连接， 得到的连接产物转化大肠杆菌感受态ToplO，得到转化子，提取转化子的质粒经过PCR鉴定，正向引物(Bgl II) :TTAGATCTATGGCAGGGCCGGCGCCGGA(序列 3)；反向引物(BstEII) TTGGTAACCTCACATTGCGTACACAATCTCA(序列4)，得到IlOlbp片段的质粒为阳性，经阳性质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列1自5 ‘末端第60-1160位核苷酸插入到 PCAMBIA3301载体(以下简称p3301)的Bgl II和BstEII酶切位点得到的载体，命名为 pCAMBIA3301-ZmSAPK8，且 pCAMBIA3301-ZmSAPK8 中 ZmSAPK8 的编码区位于启动子 CaMV35S 下游，为植物超表达载体。2、GV3101/pCAMBIA3301-ZmSAPK8 的获得将上述pCAMBIA3301-ZmSAPK8 转入根癌农杆菌 GV3101(Wang MY, Gu D，Liu TS, Wang ZQ,Guo XY,Hou W,Bai YF,Chen XP,Wang GY. 2007. Overexpression of a putative maize calcineurin B-Iike protein in Arabidopsis confers salt tolerance. Plant Mol Biol. 65 :733-746.，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)中，在含有 100 μ g/ml Kan和125 μ g/ml Rif的YEB平板筛选，得到的转化子，进行菌液PCR鉴定，正向引物ATGGCAGGGCCGGCGCCGGA ；反向引物TCACATTGCGTACACAATCTCA，结果见图 1 所示， M表示DNA marker，左侧箭头指向IOOObp的条带；泳道1表示以卡那霉素抗性的YEB液体培养基为模板的负对照；泳道2-6表示5个阳性克隆，目的产物如图中右侧箭头所示，得到 IlOlbp的片段为PCR阳性克隆，将PCR鉴定阳性克隆提取质粒，送去测序，结果为该质粒为 pCAMBIA3301-ZmSAPK8，含有该质粒的阳性克隆命名为 GV3101/pCAMBIA3301_ZmSAPK8。常用培养基和溶液的配制YEB液体培养基(IL)酵母提取物Ig牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4. 7H200. 5g加蒸馏水定容至1L，调PH至7. 0，高压灭菌。YEB固体培养基每升液体培养基中加入15g琼脂粉，高压灭菌。含有抗生素的YEB培养基在高压灭菌后的YEB培养基中，当温度降至50°C左右时加入所需抗生素(100mg/L 的 Rif，100mg/L 的 Kan)，摇勻。
3、转ZmSAPK8拟南芥的获得及分子检测(1)转化拟南芥将GV3101/pCAMBIA3301-ZmSAPK8菌株扩大培养，用蘸花法转化野生型拟南芥 Columbia(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia)(Zhang X,Henriques R,Lin SS,Niu Qff, Chua NH(2006)Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols 1 :641_646.，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)，得到TO代转ZmSAPKS拟南芥。收获TO代转ZmSAPK8拟南芥的种子，播种得到Tl代转ZmSAPK8拟南芥。采用相同的方法将空载体PCAMBIA3301导入野生型拟南芥Columbia中，得到转空载体拟南芥。(2)分子鉴定提取Tl代转ZmSAPKS拟南芥叶片的基因组DNA作为模板，分别以特异引物和bar 基因引物进行PCR，特异引物正向引物5'ATGGCAGGGCCGGCGCCGGA-3‘，反向引物5 ‘ TCACATTGCGTACACAATCTCA-3 ‘bar 基因引物Barp-F -GCGGTCTGCACCATCGTC-3 ‘Barp-R 5' -GTACCG GCAGGCTGAAGTCCA-3‘。以野生型拟南芥(W)、水为对照，以质粒pCAMBIA3301-ZmSAPK8为阳性对照。结果见图2A和2B所示，图2A为基因特异引物扩增结果；图2B为bar基因 (PCAMBIA3301上有bar基因)扩增结果；其中，M表示DNA marker，左侧箭头分别指向 IOOObp的条带；泳道1表示阳性对照；泳道2表示野生型WT对照；泳道3表示以H2O为模板的负对照；泳道4-15表示12个T1代转基因株系，从2A看出得到大小为IlOlbp的片段为阳性Tl代转ZmSAPKS拟南芥；负对照和野生型WT均无片段。从图2B中看出，能够扩增出约为500bp的bar基因为阳性Tl代转ZmSAPK8拟南芥，既得到IlOlbp的片段又得到bar 基因的为阳性Tl代转ZmSAPKS拟南芥，共得到15株阳性Tl代转ZmSAPKS拟南芥。野生型拟南芥与转空载体拟南芥结果无显著差异。收获Tl代转ZmSAPKS拟南芥的种子，播种得到T2代转ZmSAPKS拟南芥，收获T2 代转ZmSAPKS拟南芥的种子，播种得到T3代转ZmSAPKS拟南芥。将编号为9-5、8-7、5-1、12-4的T3代转ZmSAPK8拟南芥进行ZmSAPK8表达分析，以野生型拟南芥与转空载体拟南芥为对照，具体为提取编号为9-5、8-7、5-1、 12-4的T3代转ZmSAPKS拟南芥叶片RNA，反转录出cDNA作为模板，以特异引物正向引物ATGCACGACAGCGACCGGTA 和反向引物TGGAAGAAGTAGCGAGCC，进行 RT-PCR，以 Actin基因作为对照，Actin引物为正向引物GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG和反向引物 AACGACCTTAATCTTCATGCTGC,结果见图3所示，图3为野生型和转基因纯合株系中ZmSAPK8 的表达分析，其中WT为野生型拟南芥，可以看出，在编号为9-5、8-7、5-1、12-4的T3代转 ZmSAPKS拟南芥中，ZmSAPKS均得到表达。野生型拟南芥与转空载体拟南芥结果无显著差已升。4、转ZmSAPK8拟南芥表型分析1)耐盐性
将上述获得的编号为8-7 (TL7)、9_5 (TL5)的T3代转ZmSAPKS拟南芥、野生型拟南芥、转空载体拟南芥分别进行如下处理在含有150mM NaCl的MS培养基上，分三个区域点播各株系拟南芥种子(图5B)， 每个株系30粒。在22°C、16小时光照/8小时黑暗条件下，生长10天统计存活率，实验重复三次，结果取平均值。结果如下表1所示
权利要求
1.一种蛋白质，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)或2)或3) 或4)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第60-1160位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述与植物耐逆性相关蛋白质的DNA分子；4与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与所述植物耐逆性相关蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达品.ο
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为将权利要求2或3所述的编码基因插入载体PCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组表达载体。
6.扩增权利要求2或3所述的编码基因全长或其任意片段的引物对，引物对中的一条引物为序列表中序列3所示的DNA分子，另一条引物为序列表中序列4所示的DNA分子。
7.一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于 所述耐逆性为耐盐性。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述编码基因是通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中。
10.根据权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物优选为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种与植物耐逆性相关蛋白ZmSAPK8及其编码基因与应用。本发明提供了的蛋白质，名称为ZmSAPK8，来源于玉米，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，用克隆的方法得到ZmSAPK8基因，将其导入拟南芥中得到的转基因拟南芥，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的耐逆性高于野生型拟南芥，耐逆性表现在耐盐性。本实验得到的ZmSAPK8基因和转基因拟南芥在植物遗传育种方面有重要的意义。
文档编号C12N15/11GK102453085SQ20101052618
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者刘颖慧, 宋燕春, 张登峰, 李会勇, 王天宇, 石云素, 英生, 黎裕 申请人:中国农业科学院作物科学研究所