植物耐逆性相关蛋白GmNF-YC17及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种植物耐逆性相关蛋白GmNF-YC17及其编 码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 干旱、高盐和低温等逆境胁迫严重制约着大豆的生长、发育。因此，了解大豆对逆 境条件的应答与信号传导机制，提高大豆品种的抗逆性，成为大豆遗传研究及品种改良的 重要任务之一。
[0003] 在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的 变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植 物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生 物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。
[0004] 在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平 上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱 导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因 的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁 迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋 白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等）合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物； 第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白 激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。
[0005] 转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发 生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，激活 或抑制转录。转录因子的DNA结合区决定了它与顺式作用元件结合的特异性，而转录调控 区决定了它对基因表达起激活或是抑制作用。此外，其自身活性还受到核定位及寡聚化等 作用的影响。
[0006] 目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的 AP2(APETALA2)/EREBP (乙烯应答兀件结合蛋白，ethylene responsive element binding protein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP (basic region/leucine zipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY 转录因子家族、结合CCAAT-box的主要核转录因子的CBF (CCAAT binding factor)类转 录因子、含有碱性螺旋-环-螺旋（bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇（Trp cluster)的MYB家族。这些转录因子家族，除WRKY家族不参与植物的水胁迫反应外，其它 四个家族均参与调节植物对干旱、高盐和低温等的逆境胁迫反应。
[0007] NF-Y是一类结合顺式作用元件CCAAT-box的转录因子，特异的识别并结合许 多真核生物组成型、诱导性和细胞周期依赖性基因的启动子或增强子中的顺式作用元件 CCAAT-box，进而在转录水平调控这些基因的表达。NF-Y是由NF-YA、NF-YB和NF-YC三个不 同亚基组成的杂合三聚体。NF-YB蛋白与NF-YC蛋白通过彼此的HFM保守域，采用头尾相接 的方式形成异源二聚体互作平台，吸引NF-YA蛋白结合到这个二聚体平台从而形成具有活 性的异源三聚体核转录因子。NF-Y通过NF-YA亚基上的DNA结合域结合到靶基因启动子部 分的CCAAT盒，执行转录激活或转录抑制功能。NF-Y的三个亚基的保守域分别具有不同的 蛋白结构域，其中NF-YA保守域具有DNA结合结构域（DNA binding domain)和与NF-YB/ C异源二聚体互作结构域（subunit interaction domain)。NF-YB和NF-YC蛋白保守域则 由组蛋白折叠基序（Histone-fold motif)构成。其中NF-YB与H2B组蛋白折叠基序相似， 而NF-YC与H2A组蛋白折叠基序相似，组蛋白基序由三个α螺旋和两个环组成，负责H2A/ Η2Β二聚体的形成。
[0008] 到目前为止，已在拟南芥、大豆、玉米、水稻等植物中克隆到NF-Y基因。功能研究 表明，过表达拟南芥的AtNF-YBl显著提高转基因拟南芥的抗旱性，进一步研究发现过表达 拟南芥AtNF-YBl的同源基因 ZmNF-YB2,在缺水的条件下转基因玉米可以显著增强抗旱性。 转基因玉米通过提高气孔导度、降低叶片温度、防止叶片萎蔫，从而在干旱条件下维持正常 的光合作用，提高了玉米的产量。此外，拟南芥AtNF-YA5被干旱和ABA诱导表达，在维管 束及保卫细胞中特异表达，能够通过降低气孔开度，减少水份蒸腾量，以及激活逆境响应基 因，在干旱条件下维持细胞正常渗透势，通过保持细胞正常生理功能来提高植物的抗旱性。 由于植物的逆境耐性是由多基因调控的复杂性状，依靠导入单个功能性蛋白基因很难实现 植物抗逆性的综合提高。因此，利用一个关键转录因子促进多个功能基因的表达，增强植物 的抗逆性，已经成为植物抗逆基因工程的研究热点。
【发明内容】
[0009] 本发明的一个目的是提供一种植物耐逆性相关蛋白GmNF_YC17及其编码基因。 [0010] 本发明提供的蛋白质，为结合CCAAT-box的核转录因子蛋白，名称为GmNF-YC17， 来源于大豆属大豆（Glycine max L·)，是如下（a)或（b):
[0011] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0012] (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且与植物耐逆性相关的由序列1衍生的蛋白质。
[0013] 序列表中序列1的氨基酸残基序列是由123个氨基酸残基组成的蛋白质，其中从 第23个氨基酸残基到87个氨基酸残基为保守的组蛋白折叠基序。
[0014] 为了使a)中的GmNF_YC17便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组 成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0015] 表1.标签的序列
[0016]
( I ' ' '
(
[0017] 上述1)中的GmNF-YC17可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 到。上述1中的GmNF-YC17的编码基因可通过将序列表中序列2的自5'末端第1-372位 碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基 对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0018] 编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0019] 上述DNA分子，为如下1) _4)中任一种DNA分子：
[0020] 1)编码区为序列表中序列2所示的的DNA分子；
[0021] 2)编码区为序列表中序列2自5'末端第1-369位核苷酸所示的的DNA分子；
[0022] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码耐逆性相关蛋白的DNA分 子；
[0023] 4)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码耐逆性相关蛋白的DNA 分子。
[0024] 序列2中的cDNA序列由1604个核苷酸组成，开放阅读框架为自5'端第1至372 位喊基。
[0025] 上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下杂交，然后用 2 X SSC, 0· 1%SDS 和 I X SSC, 0· 1%SDS 各洗膜一次。
[0026] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0027] 上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体，得到表达上述蛋白质的载体。
[0028] 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体 包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基 因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导 (Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非 翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前 可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子、玉 米的泛素启动子（Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使 用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这 些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读 框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可 以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于 对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在 植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等)、 具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因 (如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆 境筛选转化植株。
[0029] 在本发明的实施例中，表达载体为YEP-GAP，对应的重组载体为 YEP-GAP-GmNF-YC17，YEP-GAP-GmNF-YC17为将上述DNA分子插入YEP-GAP的多克隆位点得 到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5'端第1至372位核苷酸所示的DNA片段插入 YEP-GAP的BamHI和XhoI酶切识别位点之间得到的重组载体；
[0030] 表达载体为 pBI121，对应的重组载体为 pBI121-GmNF-YC17，pBI121-GmNF-YC17 为 将上述DNA分子插入pBI121的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表的序列2自5' 端第1至372位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的Sma I和SpeI酶切识别位点之间得 到的重组载体。
[0031] 扩增上述DNA分子或其任意片段的引物对。
[0032] 所述弓丨物对为 GmNF-YC17-BHI 和 GmNF-YC17-XI 或 GmNF-YC17-121F 和 GmNF-YCl7-12IR ：
[0033] GmNF-YC17 - BHI :5'-CGGGATCCATGAGACAAGCTGGTGCATA-3' ；
[0034] GmNF-YC17-XI :5'-CCGCTCGAGAG