与植物耐逆性相关蛋白ZmPMP3及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：与植物耐逆性相关蛋白ZmPMP3及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与植物耐逆性相关蛋白ZmPMP3及其编码基因与应用。
背景技术：
干旱、盐渍、低温、氧胁迫等许多非生物胁迫严重的威胁了作物的生长，进而导致环境的不断恶化。在世界范围内，非生物逆境都是造成作物减产的主要原因，每年平均占据作物减产的50%。非生物逆境胁迫通过对植物产生一系列的形态学，生理生化状态及分子水平的影响，从而影响的植物的生长及产量。植物作为一个复杂的生物系统，在应答非生物胁迫时，往往产生一系列生化分子和基因水平的变化。植物体内联系细胞内外的细胞膜，能够直接感知来自于细胞外部的物理化学信号，于此同时，做为细胞与外界相连的介质，当细胞受到外界胁迫时，往往也对细胞膜产生了不可逆转的破坏。近年来的研究揭示，细胞膜的蛋白组分和膜结构在外界胁迫条件下发生了变化，以防御外来胁迫对细胞的伤害。因此认为，一些胁迫相关的膜蛋白在感知外界信号，保护和修复细胞膜方面起到一定的作用。iS^jft,(Arabidopsis thaliana), /Jn^ (Triticum aestivum), /Jcfg (Oryza sativa L·)，大麦(hordeum vulgure)，长 燕麦(fophopyrum elongatum)，山羊草(Aneurolepidium chinense)，星星草(Puccinellia tenuiflora)等植物中分别克隆得到了编码与酵母(Saccharomyces cerevisiae)Pmp3p—致性较高的膜蛋白基因。这些基因受到干旱，冷，和盐胁迫诱导，编码一类低分子量的膜蛋白。酵母(Saccharomyces cerevisiae)Pmp3p是一种含有55个氨基酸的酸性疏水蛋白。缺失了 PMP3的酵母突变体与野生型对照相比，增强了对钠离子和潮霉素B的敏感性，同时也抑制了 Trklp和Trk2p突变体菌株生长对钾离子的依赖性。Navarre和Goffeau认为Pmp3p作为一种质膜蛋白起到维持细胞膜电势，保证细胞内外的离子动态平衡的作用。由于MPM3蛋白是一种普遍存在的低分子量跨膜蛋白，且与 Escherichia coli 的 P77M0，线虫(Caenorhabditis elegans)中的 P;34655、Q20516、Q22702、Q22701、Q22700，以及与植物中一些胁迫诱导表达的基因编码的蛋白具有极高的同源性。目前还未从玉米中发现类似的蛋白。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种与植物耐逆性相关蛋白ZmPMP3及其编码基因。本发明所提供的蛋白质，名称为ZmPMP3，人工合成，是如下1)或2)或3)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；3)将序列2或序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性和/或保水力相关的由1)衍生的蛋白质。上述序列表中序列2或序列4均由58个氨基酸残基组成。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述与植物耐逆性相关的蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。本发明所提供的蛋白质的编码基因为所述编码基因为如下1)-8)中任一所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第87位-283位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’末端第88位-264位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列3所示的DNA分子；5)序列表中序列3自5，末端第88位-264位核苷酸所示的DNA分子；6)序列表中序列3自5’末端第88位-283位核苷酸所示的DNA分子；7)在严格条件下与1)或2)或3)或4)或5)或6)限定的DNA分子杂交且编码所述与植物耐逆性和/或保水力相关蛋白质的DNA分子；8)与1)或2)或3)或4)或5)或6)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有 75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与所述植物耐逆性和/或保水力相关蛋白质的DNA分子。其中，序列表中序列1由389位脱氧核糖核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自 5'末端第88位-264位碱基。序列表中序列4由389位脱氧核糖核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第88位-264位碱基。所述严格条件也可为在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用 2 XSSC,0. 1% SDS 和 1XSSC,0. 1% SDS 各洗膜一次。含有上述蛋白编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为在pCAMBIA3301的Nco I和BstE II位点间插入所述编码基因得到的pCAMBIA3301-ZmPMP3。扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供培育耐逆性和/或保水力提高的转基因植物的方法。本发明所提供的方法，是将所述的编码基因导入目的植物得到的转基因植物，所述转基因植物的耐逆性和/或保水力高于所述目的植物。所述转基因植物的保水力高于所述目的植物为所述转基因植物的离体叶片保水率高于所述目的植物；所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。 所述编码基因是通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。所述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物优选为拟南芥。本发明的实验证明，用克隆的方法得到ZmPMP3基因，将其导入拟南芥中得到的转基因拟南芥，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的耐逆性和/或保水率高于野生型拟南芥，耐逆性表现在耐旱性和/或耐盐性，保水率主要是叶片的保水率高于野生型拟南芥。本实验得到的ZmPMP3基因和转基因拟南芥在植物遗传育种方面有重要的意义。


图1为ZmPMP3基因在酵母突变体中的过表达图2为ZmPMP3亚细胞定位。图3为ZmPMP3的PCR扩增 4 为 pCAMBIA3301-ZmPMP3 的酶切鉴定图。图 5 为农杆菌 GV3101/pCAMBIA3301-ZmPMP3 的 PCR 鉴定图。图6为SDS法小提转基因拟南芥基因组。图7为转基因拟南芥基因组PCR检测bar基因结果。图8为转基因拟南芥基因组PCR检测ZmPMP3基因结果。图9为转基因拟南芥株系的萌发数统计结果图10为转基因拟南芥株系的系的生物重统计图11为转基因拟南芥株系的株系的生物重图12为完成全生育期拟南芥株数统计13为300mM NaCl处理前的拟南芥图14为300mM NaCl处理两天后的拟南芥图15为300mM NaCl处理两周后，在对照组和300mM NaCl处理下的ck和株系6图16为离体叶片保水率统计图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、ZmPMP3的获得及其功能的研究一、ZmPMP3 的获得各种耗材、酶及试剂限制性内切酶(NEB)、T4连接酶(ftOmega)购自北京原平皓生物技术有限公司； 大肠杆菌感受态T0P10、卡那霉素、taq酶、2XPfu PCR Master Mix购于天根生化科技(北京)有限公司；DNA marker均购自北京全式金生物技术有限公司；PEG3000 (polyethylene glycol，聚乙二醇)、carrier DNA、YPD培养基、LiAc缓冲液、TE缓冲液购于泛基诺(北京)生物技术有限公司；Aureobasidin A (TaKaRa)、pAURl23 载体(TaKaRa)、pMD18_T 质粒 (TaKaRa)购于六合通(北京)生物科技有限公司；腺嘌呤、葡萄糖、dNTP mix购于鼎国生物有限责任公司。载体及酵母菌株YR93-31 M tt (Mayumi Inada, Akihiro Ueda, Weiming Shi, Tetsuko Takabe(2005). A stress-inducible plasma membrane protein 3(AcPMP3)in a monocotyledonous halophyte, Aneurolepidium chinense, regulates cellular Na+and K+accumulation under salt stress. Planta 220 :395_402，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)是不含有酵母PMP3基因的突变体。YR93-1 M tt (Mayumi Inada, Akihiro Ueda, Weiming Shi, Tetsuko Takabe. (2005)A stress-inducible plasma membrane protein 3(AcPMP3)in a monocotyledonous halophyte, Aneurolepidium chinense, regulates cellular Na+and K+accumulation under salt stress. Planta 220 :395_402，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)是含有酵母PMP3基因的菌株，以该菌株作为对照。亚细胞定位用瞬时表达载体pBI221-GFP(Ying Fu, Ying Gu, Zhiliang Zheng, Geoffrey ffasteneys,Zhenbiao Yang. (2005)Arabidopsis Interdigitating Cell Growth Requires Two Antagonistic Pathways with Opposing Action on Cell Morphogenesis. Cell, Vol. 120，687-700，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)。含有酶切位点引物序列构建pBI221-GFP亚细胞定位载体引物GFP-F 5、-TATCTAGAATGTCGGAGGGGACTGCCAACTGCG-3、GFP-R5、-ATGCCGCGGTAGTTGTTCTTGGTGATGGCGTAG-3、构建pAUR123表达载体引物Ml-PAUR-Fl 5' -TGGGGTACCAAGAAGCATCGGCAGCAT-3‘Ml-PAUR-Rl 5' -TATGAGCTCACGCAGATACAGAGACAT-3‘YPDA 液体培养基(IOOml)YPD 培养基0. 8g0.2% 腺嘌呤1.5ml加ddH20至95ml，调pH至6. 5，高压灭菌加入5ml灭菌的40%葡萄糖。YPDA固体培养基(IOOml)同YPDA液体培养基，只是需加入2g琼脂，再高压灭菌。AbA 为抗生素 Aureobasidin A 的缩写主要仪器基因枪系统(Bio-rad)、真空旋转干燥仪(concentrator 5301，印pendorf)、恒温培养箱、激光共聚焦显微镜(LEICA TCS SP2 confocal laser scanning system)、显微镜 (OLYMPUS, BH-2)。l、ZmPMP3 的获得提取玉米(Zea mays L.)骨干自交系CN165 (中国农业科学院作物科学研究所王天宇研究院创制)的cDNA，用Ml-full-F/Ml-full-R引物进行PCR扩增，得到389bp的片段，将该片段连接到 PMD18-T (TaKaRa)上，得到 pMD18-T/ZmPMP3_l。也可人工合成序列1，用Ml-full-F/Ml-full-R引物进行PCR扩增，将该片段连接到 pMD18-T (TaKaRa)上，同样得到 pMD18-T/ZmPMP3_l。Ml-full-F :5~-AGCGAAAGGAGAGAAGGAATC-3、Ml-full-R 5~-CATGGGGTGGGTACGGTAG-3"以 pMD18-T/ZmPMP3-l 为模板，用 Ml-full-F和 Ml-full-R作为引物进行PCR扩增， 得到约389bp的PCR产物。将该PCR产物送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列1 自5 ‘末端第1-389位核苷酸，该PCR产物的基因命名为ZmPMP3，该基因的编码区为序列表中序列1的自5 ‘末端第88-264位核苷酸，该基因编码的蛋白命名为ZmPMP3，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。序列1由389个核苷酸组成，序列2由58个氨基酸组成。2、酵母遗传转化A 酵母表达载体的获得将上述1得到的pMD18-T/ZmPMP3_l用Kpn I和I进行双酶切，得到的片段与经过同样酶切得到的PAUR123载体片段连接，得到连接产物转入大肠杆菌感受态ToplO 中，得到转化子，将转化子提取质粒，送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列1自5 ‘末端第1-389位核苷酸插入到pAUR123载体的Kpn I和Mc I酶切位点得到的载体，命名为 pAUR123-ZmPMP3，pAUR123-ZmPMP3中ZmPMP3的编码区DNA片段位于启动子PADHl下游，该重组载体为酵母过表达载体。具体如下1)扩增ZmPMP3的编码区DNA，弓丨入酶切位点PCR 扩增体系(50 μ 1)pMD18-T/ZmPMP3-l0.85 μ 1Ml-PAUR-Fl2· 5 μ 1 (10 μ Μ)Ml-PAUR-Rl2· 5 μ 1 (10 μ Μ)2 X Pfu PCR Master Mix25 μ 1ddH2019. 15 μ 1PCR 扩增程序94°C IOmin94°C 30sec56°C 30sec72 °C Imin72 °C IOmin4°C保温，；35个循环。电泳检测目的条带后纯化回收。2)pAUR123-ZmPMP3-l 重组载体50 μ 1体系分步酶切步骤1)纯化后 PCR 产物(50ng/ μ 1) 25 μ 1Bufferl5μ 1ddH2017. 5μ 1Kpn I1 μ 1Sac I1 μ 1BSA0. 5μ 130°C水浴酶切池；跑琼脂糖凝胶，切胶回收，得到酶切DNA片段。pAUR123 载体酶切50 μ 1体系(同时酶切三管)分步酶切质粒(lOOng/μΙ)30 μ 1Bufferl5μ 1Kpn I1 μ 1
Sac I1 μ 1BSA0. 5μ 1ddH2012. 5μ 137°C水浴酶切池，1%琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收载体大片段。将酶切后DNA片段与酶切后载体大片段连接10 μ 1 体系:载体 QOng/μ 1)1μ 1片段(50ng/yl)7μ 1Τ4 Buffer1 μ 1Τ4 连接酶Ιμ 16°C空气浴12h;转化大肠杆菌感受态ToplO，菌液PCR筛选阳性克隆，得到 pAUR123-ZmPMP3。质粒提取质粒小提试剂盒(天根公司)(1)接种单菌落白斑于5ml含有Amp抗性的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培养过夜。(2)柱平衡步骤将吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入500μ1平衡液， 12000rpm离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(注使用当天处理的吸附柱)(3)将菌液转入Eppendorf管中，12000rpm离心30sec，尽可能除净上清，收集菌体。加入250 μ 1溶液P1，重悬菌体。(注此步一定要彻底悬开，否则会影响菌体的裂解， 导致质粒提取量和纯度偏低)(4)加入250 μ 1溶液Ρ2，上下轻轻翻转混合4 6次，使菌体充分裂解，此时菌液应变得清亮，如未变清亮，则说明菌体过多，未裂解充分。(注混合时不要剧烈，以免打断大肠杆菌基因组DNA，造成提取的质粒中混有大肠杆菌基因组DNA)(5)加入350 μ 1溶液Ρ3，立即上下轻轻翻转混合6 8次，此时应出现白色絮状沉淀。12000rpm离心lOmin，离心管底部形成沉淀。(6)取上清于柱平衡处理过的吸附柱中，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液，此步可多次收集。(7)在吸附柱中加入700μ 1漂洗液，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液。(8)在吸附柱中加入500μ 1漂洗液，12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液。(9)将吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min，以尽量除去漂洗液。(10)室温放置数分钟，尽可能除去残留的漂洗液。(11)取出吸附柱放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间部位不少于50μ1 65 70°C水浴预热的洗脱缓冲液，室温放置2min，12000rpm离心lmin。(12)为了获得更多的纯化产物，将(11)中离心得到的溶液再重新加入吸附柱， 12000rpm 离心 lmin。(1 取1 μ 1质粒进行电泳检测，根据DNA marker初步判定其质量和浓度B、酵母遗传转化(1)挑取YR93-31酵母菌斑于IOmlYPDA液体培养基中，30°C 220rpm过夜培养。
(2)取适量于50ml液体培养基中，30°C 220rpm培养至0D600为0. 4。(3) 25°C 下，IOOOrpm 离心 5min 收集菌。(4)弃上清，用IOml无菌水重悬菌体。(5)25°C 下，IOOOrpm 离心 5min，弃上清，用 Iml IXTE 重悬菌体。(6) 300C 200rpm 摇菌 30min。(7)每个反应准备2 μ g得到的pAUR123-ZmPMP3重组质粒，处理的carrier DNA 10μ 1于1. 5ml离心管中。注carrier DNA用前处理沸水煮lOmin，冰上Imin ；再沸水煮lOmin，冰上lmin。(8)从(6)中取 200 μ 1 T (7)中。(9)每个反应加入600 μ 1 PEG溶液。(10)30°C 200rpm摇菌30min后，加入70μ 1 DMSO轻轻颠倒混勻，勿涡漩。(11)42°C热击 15min，冰上 lmin。(12) 12000rpm离心30sec，收集菌体于管底。(13)用 0. 5ml IXTE 重悬菌体。(14)取200 μ 1涂布于YPDA (AbA抗性)固体培养基。(15)酵母平板30°C倒置培养3天。得到转化子即为阳性克隆，命名为YR93-31/pAUR123-ZmPMP3。3、ZmPMP3_l基因在酵母突变体中的过表达(1)挑取YR93-31/pAUR123-ZmPMP3单克隆于AbA抗性YPDA液体培养基中摇菌48hr至饱和。(2)按1 100转接以上菌液一次后，摇菌36hr，此时OD6tltl约为1.0，稀释菌液至 OD600 = 0 . 30 ( 3)将稀释好的菌液分别再稀释10倍、500倍、1000倍，并取此稀释好的菌液 6 μ 1,分别接种于含有NaCl和 AbA 的 YPDA 固体培养基(YPDA+25mM NaCl+0. 5 μ g/L AbA) 和含有AbA的YPDA固体培养基(YPDA+0. 5 μ g/L AbA)中，30°C倒置培养48小时，观察菌株的生长状况。采用同样的方法将水稻同源基因0sLti6a转入菌株YR93-31中得到重组菌 YR93-31/pAUR123-0sLti6a,已经有研究证明0sLti6a能够互补菌株YR93-31的功能，将重组菌YR93-31/pAUR123-0sLti6a作为阳性对照，用于比较衡量ZmPMP3_l基因对酵母突变体的功能的补充程度。以YR93-1 (未发生pmp3基因缺失突变的菌株)为对照菌株1，接种在不含AbA抗性的YPDA培养基(YR93-1不能生长在含AbA抗性的YPDA培养基中，只有转化了重组质粒的YR93-31菌株能够生长在含AbA抗性的YPDA培养基中)和含有NaCl的YPDA固体培养基(YPDA+25mM NaCl)中。以YR93-31作为对照菌株2，分别接种于含有NaCl和AbA的YPDA固体培养基 (YPDA+25mM NaCl+0. 5 μ g/L AbA)和含有 AbA 的 YPDA 固体培养基(YPDA+0. 5 μ g/L AbA)中。结果如图1 所示，图中为 YR93-1、YR93-31、YR93-31/pAUR123_0sLti6a(pAUR123-0sLti6b)、YR93-31/pAUR123-ZmPMP3(pAUR123-ZmPMP3-l)菌株在 YPDA 及 25mM NaCl+YPDA培养基中的生长状况；从左至右分别为稀释1000、500、10和1倍的菌液。从图中看出，在对照培养基(YPDA)中，四种菌株长势基本一致，YR93-31的长势似乎还要强于其他菌株；而在25mM NaCl处理下，四种菌株的长势均减弱，但YR93-31菌株的长势均低于其他3个菌株，因此，推测ZmPMP3-l基因可能与细胞内的Na+代谢相关。3、洋葱表皮中亚细胞定位1)、亚细胞定位表达载体pBI221-ZmPMP3_GFP的获得pBI221-GFP载体酶切采用)(ba I和&ic II双酶切pBI221_GFP载体，得到酶切后 BI221-GFP 载体。30 μ 1体系酶切目的片段pMD18-T/ZmPMP3-l(300ng/μ 1)2 μ 1Buffer33μ 1BSA0. 3μ 1ddH2022. 7 μ 1Xba I1 μ 1Sac II1 μ 1370C 2hr ；跑1 %琼脂糖凝胶，跑的时间要尽量长些，切胶回收，得到酶切后片段。酶切后片段与酶切后的pBI221-GFP连接10 μ 1 体系:酶切后 pBI221-GFPQ0ng/y 1)0. 8 μ 1酶切后片段(IOOng/ μ 1)7. 2μ 1Buffer1 μ 1Τ4 连接酶Ιμ 16°C 12hr ；转化大肠杆菌感受态ToplO，得到转化子，提取转化子的质粒送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列1自5 ‘末端第1-177位核苷酸插入到pBI221-GFP载体的 Xba I 和 Sac II 切位点得到的载体，命名为 pBI221-ZmPMP3_GFP。pBI221-ZmPMP3_GFP 中ZmPMP3的编码区位于启动子CaMV35S下游。洋葱材料的准备在超净工作台中，将洋葱剥去外表皮之后，切取第三、四层的鳞茎成约如m2的方块，轻轻剥下表皮，使内表皮与MS固体培养基贴紧，尽可能较少气泡，培养皿用ParafilmH 口备用。手提式基因枪子弹制作(1)准备Iml, 200 μ 1,20μ 1移液枪，无水乙醇一瓶，timer,记号笔，纸巾。(2)称20mg(0. 02g) PVP放入一干燥洁净的1. 5ml离心管内，加入Iml无水乙醇，使其溶解，浓度为20mg/ml的母液。(3)吸出12. 5μ 1母液，稀释至5ml，使其终浓度为0. 05mg/ml。(4)称2. mg 1 μ M金粉，放入一干燥洁净的1. 5ml离心管内用Iml无水乙醇进行3 次清洗(涡旋，短暂离心，吸出。注意此时有少量金粉被粘在管壁上)。(5)加入ΙΟΟμΙ 0.05Μ亚精胺，涡旋混勻，超声波处理5 IOsec (去除电荷)。(6)加入25μ 1上述得到的pBI221-ZmPMP3-GFP(l μ g/μ 1)混勻。边涡旋边加入
10100 μ 1 IM CaCl2，室温静置 lOmin。(7)用Iml无水乙醇清洗5次，方法同上。(8)用3ml 0. 05mg/ml PVP将金粉稀释在一个IOml的大离心管中。(9)打开N2总阀，调整减压阀，使N2压力在0.4左右，用纯度为99. 997% N2干燥管15min。停止N2气流，然后切割管，使其长于平台10cm。(10)将切割的管的一端与注射器相连，涡旋金粒子溶液并迅速将该溶液转入该切割的管，使其每一末端均留有6cm的空隙。(11)迅速将上步盛有溶液的管置于支持物上并使溶液在管中停留3min，标记其充满的位置。用注射器缓慢移动溶液刚好经过右侧标记。使管旋转180°，将溶液全部倒
出ο(12)使管旋转30sec，打开队在0. ；35 0. 4rpm，旋转5min。(13)将管从支持架上取出，停止队气流。切开封闭的管，将子弹放入盛有干硅胶的容器。基因枪轰击洋葱表皮(1)将制好的子弹装入基因枪。(2)将基因枪与氦气罐相连，压力为150 300psi。(3)打开预先准备的放有洋葱表皮的培养皿，将基因枪对准洋葱表皮进行轰击，每块洋葱表皮打两枪。(4) 26 0C，黑暗条件下培养Mhr。以空载体pBI221-GFP为对照。亚细胞定位荧光信号观察取出黑暗条件下培养Mh的洋葱表皮于载玻片上，加上一滴水，盖上盖玻片，注意不要有气泡，放于荧光共聚焦显微镜上观察绿色荧光信号，其中激发波长为488nm，扫描波长为 500-5;35nm。结果见图2所示，其中，A为质壁分离前的亚细胞定位结果；B.质壁分离后的亚细胞定位结果，C为转化pBI221-GFP空载体的对照。在对照的洋葱表皮细胞的细胞核、细胞质和细胞膜均能检测到GFP荧光，表明与空载体pBI221-GFP相比，ZmPMP3定位于细胞膜中。 ZmPMP3亚细胞定位的结果现实，该基因位于细胞膜发挥作用，很可能参与膜的离子转运相关生理过程。实施例2、转ZmPMP3拟南芥的获得及功能研究植物双元表达载体pCAMBIA3301 (以下简称 p3301，Canberra, Australia,由该文中王国英教授提供，Zhao J.，Sun Z.，Zheng J.，Guo X.，Dong Z.，Huai J.，Gou M. ,He J. , Y. Jin, Wang J. and Wang G. , Cloning and characterization of a novel CBL-interacting protein kinase from maize, Plant Mol Biol 69 (2009) :661-674. ,^ 众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)和根癌农杆菌GV3101 (Zhao J. , Sun Ζ.， Zheng J. , Guo X. , Dong Ζ. , Huai J. , Gou Μ. , He J. , Y. Jin, Wang J. and Wang G. . (2009) Cloning and characterization of a novel CBL-interacting protein kinase from maize, Plant Molecular Biology，69 :661-674.，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)
常用培养基和溶液的配制YEB液体培养基(IL)酵母提取物Ig牛肉膏5g蛋白胨5g蔗糖5gMgSO4. 7H200. 5g加蒸馏水定容至1L，调PH至7.0，高压灭菌。YEB固体培养基每升液体培养基中加入15g琼脂粉，高压灭菌。含有抗生素的YEB培养基在高压灭菌后的YEB培养基中，当温度降至50°C左右时加入所需抗生素(100mg/L 的 Rif，100mg/L 的 Kan)，摇勻。含有PPT的MS选择性培养基高压灭菌后的MS培养基在温度降至50°C左右时加入终浓度为7mg/L的PPTj^ 勻。bar基因引物Barp-F 5' -GCGGTCTGCACCATCGTC-3‘Barp-R 5‘ -GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3‘带有酶切位点引物M1-3301-F1 5~ -CATCGGCACCATGGCGGAGGGGACT-3‘(下划线为 NcoI 酶切位点，该位点原序列是T，但在构建载体的过程中在该位置引入了酶切位点，为了匹配酶切位点所以将该序列的T改成了 G。)M1-3301-R1 _ATGGGTCACCGTCGGCAAGGATGAC_3~RT-PCR 所用引物 ZmPMP3-I-RT-F 5~-CAACTGCGTGGACATCCTGA-3、ZmPMP3-I-RT-R :5:GGCGTAGATGGCGTAGATGA_3、Ms培养基、D-marmitol (D_甘露醇)(sigma)购自经科宏达生物技术有限公司； NaCl购自于鼎国生物有限责任公司。拟南芥act in引物Actin-F 5' -ATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGT-3‘actin-R 5' -GAAACATTTTCTGTGAACGATTCC-3‘l、pCAMBIA3301_ZmPMP3 载体的获得以 pMD18-T/ZmPMP3-l 为模板，用 M1-3301-F1 和 M1-3301-R1 进行扩增，得到的 PCR 产物，经过测序，该PCR产物具有序列中序列3自5 ‘末端第87-283位核苷酸，该PCR产物基因的编码区为序列3自5 ‘末端第88-264位核苷酸。将上述PCR产物经过NcoI和BstEII双酶切与经过同样酶切得到的pCAMBIA3301 载体片段连接，得到的连接产物转化大肠杆菌感受态ToplO，得到转化子，提取转化子的质粒经过PCR和酶切鉴定，均为阳性的送去测序，结果为该质粒为将序列表中序列3自5 ‘末端第88-283位核苷酸插入到pCAMBIA3301载体(以下简称p3301)的NcoI和BstEII酶切
12位点得到的载体，命名为pCAMBIA3301-ZmPMP3。pCAMBIA3301_ZmPMP3中ZmPMP3的编码区位于启动子CaMV35S下游，为植物超表达载体。具体如下扩增ZmPMP3的编码区DNA，弓丨入酶切位点50 μ 1 体系重组质粒 pMD18-T/ZmPMP3_l0. 85 μ 1M1-3301-F12. 5 μ 1(10 μ Μ)M1-3301-R12. 5 μ 1(10 μ Μ)2 X Pfu PCR Master Mix25 μ 1ddH2019. 15 μ 1PCR 扩增程序94°C IOmin ；94°C 30sec ；68°C 30sec ；72 °C Imin ；72 °C IOmin ；4°C保温，；35个循环。电泳检测目的条带后纯化回收，得到纯化后PCR产物。结果见图3所示，其中泳道 1、2、3分别为DNA maker, PCR扩增的负对照结果、PCR扩增得到的带有酶切位点的目的条带，箭头所指为目的条带，可以看出得到177bp的目的片段。构建p3301_ZmPMP3 50 μ 1体系分步酶切上述得到的纯化后PCR产物(50ng/ μ 1)25 μ 1Buffer35 μ 1ddH2017. 5μ 1Nco I1 μ 137 °C2h加入Iml无水乙醇，4°C下，12000rpm离心30min ；倒掉无水乙醇，吹干。力口入:Buffer35 μ 1ddH2043. 5 μ 1BSA0. 5 μ 1BstEII1 μ 1600C 2h ；跑1 %琼脂糖凝胶，切胶回收，得到酶切后PCR产物。p3301载体酶切30 μ 1体系(同时酶切三管)分步酶切ρ3301 质粒(50ng/μ 1)10 μ 1Buffer33 μ 1ddH2014. 7μ 1Nco I1 μ 137 °C 2h加入Iml无水乙醇，4°C下，12000rpm离心30min ；倒掉无水乙醇，吹干。
力口入:Buffer33 μ 1ddH2025. 7 μ 1BSA0· 3 μ 1BstEII1 μ 160°C 2h ；跑琼脂糖凝胶，跑的时间要尽量长些，切胶回收，得到酶切后P3301。连接9. 8μ1 体系:酶切后的 p330K20ng/y 1)0. 8 μ 1酶切后 PCR 产物(50ng/ μ 1)7 μ 1Buffer1 μ 1T4 连接酶1 μ 116°C 12h ；转化大肠杆菌感受态ToplO，菌液PCR筛选阳性克隆。菌液PCR筛选阳性克隆10 μ 1体系新鲜菌液1 μ 1M1-3301-F1 和 Ml-3301_Rl(10yM)2X0. 5μ 1Taq0. 5 μ 1Buffer1 μ 1dNTP1 μ 1ddH205. 5 μ 1使用琼脂糖凝胶电泳，检测PCR结果，得到177bp的片段为PCR阳性克隆。酶切检测将PCR阳性克隆提取质粒用NcoI和BstEII双酶切，结果见图4所示，泳道1、2均为酶切鉴定的电泳结果，泳道3为DNA marker,箭头所指为目的条带，从图中看出，得到得到177bp的片段，将该质粒命名为pCAMBIA3301-ZmPMP3。2、转ZmPMP3拟南芥的获得1)拟南芥Sf ^ M it ^f Columbia(Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia) (DIRK VALVEKENS, MARC VAN MONTAGU, MIEKE VAN LIJSEBETTENS. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 85, pp. 5536-5540,公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。)种子先用75%的酒精消毒lmin，再用0.5% NaClO (ν/ν)消毒lOmin，超净台中，用灭菌ddH20漂洗5次，每次lmin，点种到MS固体培养基上，4°C春化3d，然后放置于光照培养箱，22°C 16h光照/8h黑暗条件下生长约一周后移栽于装有蛭石营养土(1 1)的小盒内继续培养。2)、农杆菌感受态细胞的制备(1)挑取根癌农杆菌GV3101单菌落于:3ml YEB液体培养基中(含Rif+ 100 μ g/ ml)J8°C振荡培养过夜。(2)取过夜培养菌液1 %接种于YEB液体培养基(Rif+ 100 μ g/ml)中，28°C振荡培养至0D600为0. 5，需4h。
(3)冰浴 3Omin, 4°C 5OOOrpm 离心 5min，弃上清。(4)力卩IOml 0. 15M NaCl悬浮农杆菌细胞，4°C 5000rpm离心5min，去上清。(5)加入Iml预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴24h内使用或分装成每管200 μ 1， 液氮中速冻lmin，置-76°C保存备用。3)、植物表达载体转化农杆菌GV3101/pCAMBIA3301-ZmPMP3的获得(1)取 200 μ 1 GV3101 感受态细胞，加入 1 μ g 构建好的 pCAMBIA3301_ZmPMP3，液氮中速冻lmin，37°C水浴5min，然后加入Iml不含抗性的YEB液体培养基，28°C 140rpm,慢速振荡培养4h。O) IOOOOrpm离心30sec，弃上清，加入0. Iml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有 100 μ g/ml Kan 和 125 μ g/ml Rif 的 YEB 平板上，培养约 36 48h。(3)挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB培养液(含100 μ g/ml Kan和125 μ g/ mlRif)中，28°C振荡培养过夜。(4)进行菌液PCR鉴定，引物为M1-3301-F1和M1-3301-R1，结果见图5所示，其中， 泳道2-8均为农杆菌GV3101的菌液PCR结果，泳道1为DNA marker,泳道9为PCR反映中的负对照，从图中看出，得到177bp的片段为PCR阳性克隆，将PCR鉴定阳性克隆提取质粒， 送去测序，结果为该质粒为pCAMBIA3301-ZmPMP3，含有该质粒的阳性克隆命名为GV3101/ pCAMBIA3301-ZmPMP3o4)、拟南芥的转化沾花法(floraldipping)(1)用1)得到的生长大约三周的野生型拟南芥Columbia(Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia)进行转化，且在转化的前一天浇足水，转化之前剪掉所有果荚。(2)按1 1000比例将活化的阳性克隆菌液GV3101/pCAMBIA3301-ZmPMP3转接于 500ml具有卡那霉素抗性的YEB液体培养基中，28°C振荡培养至0D600为1. 2(培养Mh)。(3)4°C 4000rpm 离心 15min 集菌。(4)用200ml渗入缓冲液(1 XMS大量元素+5%蔗糖)重悬菌体，使0D600为0. 8， 加siliet 40 μ 1 (0. 2%0，体积百分含量)。(5)将拟南芥花蕾浸入中，侵染lmin。(6)用保鲜膜或保鲜袋包裹植株，16°C黑暗条件下放置Mhr后，放于正常条件下生长，得到TO代转ZmPMP3拟南芥。收获TO代转ZmPMP3拟南芥的种子，为Tl代转ZmPMP3拟南芥种子。3、转基因株系的筛选与鉴定l)ppt除草剂喷雾筛选阳性转基因株系(1)将Tl代转ZmPMP3拟南芥种子经4°C春化处理后直接播种于装有蛭石营养土(1 1)的托盘中，正常条件下生长20天，用0.5%。(体积百分含量)的PPt除草剂(日本明治制药株式会社，吸取500 μ Ippt原液，溶解于IL蒸馏水中，获得体积百分比为0. 5%ο 的工作液，用此液喷施拟南芥幼苗。)喷雾筛选，每天一次连续喷3天，一周后，观察结果，由于表达载体Ρ3301上的ppt抗性基因在转化时能够随目的基因一起整合到植物基因组中， 所以经除草剂PPt筛选后可以正常生长的植株理论上应该是转基因阳性植株，结果为得到35株生长正常植株，即为ppt筛选阳性Tl代转ZmPMP3拟南芥。移栽ppt筛选阳性Tl代转ZmPMP3拟南芥植株继续培养，每小盒种2株。每个 PPt筛选阳性Tl代转ZmPMP3拟南芥生长至2片叶时小量提取DNA，进行PCR鉴定，引物为 M1-3301-F1和M1-3301-R1，结果为得到177bp的片段的植物即为阳性Tl代转ZmPMP3拟南芥，得到14株阳性Tl代转ZmPMP3拟南芥。2)通过基因组PCR鉴定拟南芥阳性植株A =SDS法小量提取35株PPT筛选鉴定为阳性Tl代转ZmPMP3拟南芥总DNASDS 提取缓冲液(IOOml)Tris-HCl(lmol/L pH8. 0) IOmlEDTA (0. 5mol/L pH8. 0)IOmlNaCl (lmol/L)50ml (或 2. 9g 固体)灭菌ddH20 定容至 100ml。SDS裂解缓冲液SDS 提取缓冲液20% SDS = 15 1 (V/V)步骤(1)取适量的PPT鉴定为阳性Tl代转ZmPMP3拟南芥叶片放入1. 5ml离心管中，力口液氮充分研磨成粉末(最好只加一次液氮去研磨)。(2)加入800 μ 1 65°C预热的SDS裂解缓冲液，充分混勻后，65°C下抽提20min，期间再混勻2次。(3)加入 250 μ 1 5mol/L KAc，冰上放置 5min。(4) 12000rpm,离心lOmin，吸取上清至一新的离心管中。(5) 12000rpm,离心5min，吸取上清至一新的离心管中。(6)加入600 μ 1异丙醇混勻。(7) 40C 12000rpm，离心 15min(8)弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀2次。(9) 12000rpm离心3min，真空抽干或超净台吹干。(10)加入20 μ 1 1 XTE或灭菌ddH20溶解DNA沉淀，_20°C保存。纯化(1)上述(10)中加入 RNase 1 μ 1，37°C消化 30min。(2)补灭菌ddH20至总体积600 μ 1。(3)加入300 μ 1苯酚，震荡混勻5 IOmin ；加入300 μ 1氯仿，震荡混勻5min。(4) 12000rpm,离心lOmin，吸取上清至一新的离心管中。(5)加入600 μ 1氯仿，震荡混勻anin。(6) 12000rpm,离心2min，吸取上清至一新的离心管中。(7)加入1/10体积的NaAc混勻，再加入2 3倍体积的冷无水乙醇，4°C静置 30mino(8) 4°C I2OOOrpm,离心 2Omin,弃上清。(9) 75%乙醇洗沉淀2次。(10) 12000rpm离心3min，真空抽干或超净台吹干。
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(11)加入20 μ 1 lXTE或灭菌ddH20溶解DNA沉淀，-2(rC保存备用，得到DNA。经过电泳检测，结果如图6所示，得到基因组DNA。B:进行PCR鉴定以上述获得的基因组DNA为模板，用引物Barp-F 5' -GCGGTCTGCACCATCGTC-3‘ 和 Barp-R 5 ‘ -GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3 ‘进行 PCR 鉴定，检测 bar 基因。用引物 M1-3301-F1 和 M1-3301-R1，进行 PCR 鉴定，检测 ZmPMP3 基因。20 μ 1反应体系10XPCR buffer2μ 1dNTP mix0. 4 μ 1Barp-F 和 Barp-R (或 M1-3301-F1 和 M1-3301-R1) (ΙΟμΜ) 各 0. 5 μ 1阳性T1 代植株 DNA1. 5 μ 1Taq polymerase (2. 5U/ μ 1)0. 6 μ 1ddH2013. 5μ 1PCR扩增程序94°C IOmin ；94°C 30sec ；63°C (bar 基因)/58°C (ZmPMP3_l 基因)；30sec，72°C 2min，33 个循环；72°C IOmin ;4°C保温。琼脂糖凝胶电泳检测结果，图7为阳性Tl代转基因拟南芥基因组PCR检测bar 基因结果，泳道1为对照，转空载体拟南芥基因组PCR扩增结果；泳道2-13为转ZmPMP3拟南芥株系基因组PCR扩增结果；泳道14为野生型拟南芥株系基因组PCR扩增结果；泳道15 为正对照，质粒pCAMBIA3301-ZmPMP3的PCR扩增结果；泳道16为DNA marker。图8为Tl代转基因拟南芥基因组PCR检测ZmPMP3结果，泳道1为DNA marker (同图10)；泳道2为为对照，转空载体拟南芥基因组PCR扩增结果；泳道2_12为转pCAMBIA3301-ZmPMP3基因拟南芥株系基因组PCR扩增结果；泳道13为正对照，质粒 pCAMBIA3301-ZmPMP3的PCR扩增结果；泳道14为野生型拟南芥株系基因组PCR扩增结果。从图中看出，PCR扩增目的基因和bar基因进行鉴定，能够扩增出230bp的目的条带和470bp的bar基因为阳性Tl代转基因拟南芥，得到14株阳性Tl代转基因拟南芥，证明ZmPMP3基因已经整合到拟南芥基因组中。而对照的转空载体植株拟南芥株系只有470bp 的bar条带，野生型拟南芥中无此带。3)从阳性Tl代转ZmPMP3拟南芥上收获的种子为T2代种子，将上述T2代种子点种在含有除草剂(7mg/L ppt)的MS培养基上进行筛选，将生长有四片叶的成活阳性植株移栽到装有蛭石营养土(1 1)的小盒内继续培养，并收获种子得到T3代转ZmPMP3拟南芥。T3代转ZmPMP3拟南芥经ppt筛选表现为100 %抗性的株系，再进行PCR鉴定，方法同 2)，结果得到阳性T3代转ZmPMP3拟南芥纯合株系，从阳性T3代转ZmPMP3拟南芥纯合株系中随机挑选12个株系继续繁育，得到T4代转ZmPMP3拟南芥种子。播种T4代转ZmPMP3拟南芥种子，得到T4代转ZmPMP3拟南芥纯合株系，采用2) 的方法，进行PCR鉴定，得到12个T4代转ZmPMP3拟南芥纯合株系。
采用同样的方法将空载体pCAMBIA3301转入野生型拟南芥 Columbia (Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia)中，得到转空载体拟南芥，经过同样的PCR鉴定，结果为没有目的基因ZmPMP3。4)拟南芥总RNA提取及反转录酶从12个"Γ4代转ZmPMP3拟南芥纯合株系选取6个编号为4、5、6、8、11和12株系进行real time-PCR分子检测，以野生型拟南芥和T4代转空载体拟南芥为对照。具体如下使用天根植物总RNA提取试剂盒提取编号为4、5、6、8、11和12的T4代转ZmPMP3拟南芥纯合株系及对照拟南芥叶片总RNA，并使用invitrogen M-MlV反转录酶第一链合成试剂盒获得cDNA。通过实时定量PCR方法，使用Sybergreen染料。20 μ 1反应体系ZmPMP3-I-RT-F 和 ZmPMP3_l-RT-R(10 μ Μ)2X0. 4 μ 1Τ4 代植株1 μ 12 X Pfu PCR subygreen Mix10 μ 1ddH206. 8 μ 1PCR扩增程序94°C Imin ；94°C 5sec,60°C 5sec,72°C 31 sec，；40个循环。以actin基因作为对照。结果为与野生型拟南芥和转空载体拟南芥相比，编号为4、5、6、8、11和12的T4 代转ZmPMP3拟南芥纯合株系均可以检测到ZmPMP3-l的表达(177bp片段)，而野生型和转空载体拟南芥植株中没有检测到。野生型、转空载体拟南芥植株、编号为4、5、6、8、11和12 的jM代转ZmPMP3拟南芥纯合株系中均有actin基因的表达QOObp片段)。4、转基因株系的表型鉴定A 对T4代转ZmPMP3拟南芥纯合株系进行盐胁迫(NaCl)和干旱胁迫(D_甘露醇) 处理，观察表型，具体如下1)萌发率统计将消毒的野生型拟南芥(CK)、转空载体拟南芥及编号为6和11的 T4代转ZmPMP3拟南芥纯合的种子均分别点种到含不同浓度NaCl (0，150mM)以及不同浓度 D-mannitol (0,300和;350mM)的MS培养基上，4°C黑暗条件春化3天，然后移至22°C、16hr 光照(100 μ E πΓ2 s-1) /8hr黑暗的光照培养箱中萌发，分别在MS培养基、150mM NaCl+MS培养基以及300mM D-mannitol+MS、350mM D+MS培养基中统计培养3、4、5天后的萌发数。每个重复40粒种子，每个处理设置独立的5个重复，结果取平均数。统计中，以长出两片绿色子叶为标准。结果如下如图9所示，在MS培养基㈧中，野生型(ck)在萌发3、4、5天的萌发率分别为99%、100%、 100%;而6号114代转ZmPMP3拟南芥株系的在萌发3、4、5天的萌发率分别为98. 5^^99%,99%。在150mM NaCl+MS培养基⑶中，野生型(ck)在萌发3、4、5天的萌发率分别为 20%,22. 5%,25% ；而6号T4代转ZmPMP3拟南芥株系的在萌发3、4、5天的萌发率分别为 51. 7%,60%,61. 2%，明显高于ck中的萌发率。在300mM D-mannitol+MS培养基(C)中，野生型(ck)在萌发3、4、5天的萌发率分别为Μ. 2%、90. 8%、96. 7% ；而6号"Γ4代转ZmPMP3拟南芥株系的在萌发3、4、5天的萌发率分别为60%、84.4%、90% ；而11号T4代转ZmPMP3拟南芥株系的在萌发3、4、5天的萌发率分别为 85. 6%,95. 6%,96. 7%。在350mM D_mannitol+MS培养基(D)中，野生型(ck)在萌发4、5天的萌发率分别为47. 5%,82. 5% ;6号T4代转ZmPMP3拟南芥株系在萌发4、5天的萌发率分别为80%、 86. 7% ;11号"Γ4代转ZmPMP3拟南芥株系在萌发4、5天的萌发率分别为76. 9%、85%。野生型拟南芥与转空载体拟南芥结果无显著差异。因此，6、11号T4代转ZmPMP3 拟南芥株系在早期的萌发率明显高于ck，说明ZmPMP3除响应盐的胁迫外，在萌发早期也响应旱胁迫。2)生物重统计将消毒的野生型拟南芥(CK)、转空载体拟南芥及编号为6、11、12的T4代转 ZmPMP3拟南芥纯合的种子按照1)的方法处理，不同的是分别在如下培养基中培养1)MS 培养基；2) 150mMNaCl+MS 培养基；3) 175mMNaCl+MS 培养基；4) 300mM D-mannitol+MS 培养基；统计以上生长2周的各组各株系拟南芥幼苗的生物重(整株幼苗的重量，包括地上部和根)。每个称取株系20株拟南芥，试验重复3次，结果取平均数。结果如图10和11所示，其中，在MS培养基中，ck、6号T4代转ZmPMP3拟南芥、11号T4代转ZmPMP3拟南芥、12 号 T4 代转 ZmPMP3 拟南芥的生物重分别为 0. 14225g、0. 14675g、0. 179g、0. 17875g ； 在150mM NaCl+MS培养基中，ck、6号T4代转ZmPMP3拟南芥、11号T4代转 ZmPMP3拟南芥、12号T4代转ZmPMP3拟南芥的生物重分别为0. 0835g,0. 10625g、0. 1215g、 0.09275g ；在175mM NaCl+MS 培养基中，ck、6 号！"4 代转 ZmPMP3 拟南芥、11 号！"4 代转 ZmPMP3 拟南芥、12号T4代转ZmPMP3拟南芥的生物重分别为0. 067g、0. 0914g、0. 0947g、0. 0444g ；在300mM D-mannitol+MS 培养基中，ck、6 号 T4 代转 ZmPMP3 拟南芥、11 号 T4 代转ZmPMP3拟南芥、12号T4代转ZmPMP3拟南芥的生物重分别，0. 0467g、0. 0387g、0. 0554g, 0.053go可见，6、11号株系的生物重在盐胁迫下均显著高于ck，而11、12号(最好能与盐胁迫的株系一致)株系在渗透胁迫下的生物重明显高于ck。野生型拟南芥和转空载体拟南芥结果无显著差异。3)成熟植株的全生育期的鉴定将消毒的野生型拟南芥(作为对照CK)、转空载体拟南芥及编号为4、5、6、11、12的 T4代转ZmPMP3拟南芥纯合的种子点种到MS固体培养基上于4°C黑暗条件下春化3d，移至22°C、每天16hr光照(100 μ E m_2 sl/Shr黑暗的光照培养箱中垂直放置生长5d，然后将幼苗移栽至含有重量比为1 1的营养土-蛭石组成的混合土的小盆中继续培养，使用植物营养液浇透，至拟南芥生长4周，分为两组处理胁迫组向各株系浇灌含有300mM NaCl水溶液进行胁迫处理，每周浇灌一次，保持土壤湿润；对照组向各株系浇灌蒸馏水，每周浇灌一次，保持土壤湿润；处理两周后(浇灌300mM NaCl两周后)观察各株系表型，统计存活率。移栽时， 每盆种植5株，每3盆(15株)为一个重复，试验设置3个重复。 使用植物营养液浇透，至拟南芥生长4周时观察表型，结果如图13所示，此时拟南芥进入生殖生长阶段时，野生型拟南芥(对照CK)、编号为5、6、11的T4代转ZmPMP3拟南芥均刚刚抽薹。野生型拟南芥和转空载体拟南芥结果无显著差异。编号为4、12的T4代转 ZmPMP3拟南芥与编号为5、6、11的T4代转ZmPMP3拟南芥结果无显著差异。处理两天后，观察胁迫组各株系表型，结果如图14所示，经300mM NaCl水溶液胁迫处理两天后，野生型拟南芥(作为对照CK)和编号为4、5、6、11、12的T4代转ZmPMP3拟南芥低端莲座叶均开始变黄。野生型拟南芥和转空载体拟南芥结果无显著差异。处理两周后，观察表型，结果如图15所示，其中NaCl处理ck为经300mM NaCl水溶液胁迫处理的野生型拟南芥，对照ck为用蒸馏水浇灌处理的野生型拟南芥，NaCl处理株系6为经300mM NaCl水溶液胁迫处理的编号为6的T4代转ZmPMP3拟南芥，对照株系6为用蒸馏水浇灌处理的编号为6的T4代转ZmPMP3拟南芥。编号为5、11的T4代转ZmPMP3 拟南芥与编号为6的T4代转ZmPMP3拟南芥结果无显著差异。野生型拟南芥和转空载体拟南芥结果无显著差异。处理两周后的拟南芥部分株系抽出的薹开始萎蔫变黄，此时的拟南芥已经不能进一步完成生殖生长，不结实并开始死亡，因此在盐胁迫处理两周后，统计能够完成全生育期 (即可以收获种子的植株)的拟南芥株数，实验重复三次，结果取平均数。结果如下经300mM NaCl水溶液胁迫处理后，能够完成全生育期的野生型拟南芥(作为对照 CK)株数为2. 67株;经300mM NaCl水溶液胁迫处理后，能够完成全生育期的编号为4的T4代转 ZmPMP3拟南芥株数为3. 34株；经300mM NaCl水溶液胁迫处理后，能够完成全生育期的编号为5的T4代转 ZmPMP3拟南芥株数为5株；经300mM NaCl水溶液胁迫处理后，能够完成全生育期的编号为6的T4代转 ZmPMP3拟南芥株数为9. 67株；经300mM NaCl水溶液胁迫处理后，能够完成全生育期的编号为11的T4代转 ZmPMP3拟南芥株数为3. 34株；经300mM NaCl水溶液胁迫处理后，能够完成全生育期的编号为12的T4代转 ZmPMP3拟南芥株数为3. 34株；经蒸馏水处理的对照组中，能够完成全生育期的野生型拟南芥(作为对照CK)株数为5株；
经蒸馏水处理的对照组中，能够完成全生育期的编号为4的T4代转ZmPMP3拟南芥株数为5株；经蒸馏水处理的对照组中，能够完成全生育期的编号为5的T4代转ZmPMP3拟南芥株数为5株；经蒸馏水处理的对照组中，能够完成全生育期的编号为6的T4代转ZmPMP3拟南芥株数为5株；经蒸馏水处理的对照组中，能够完成全生育期的编号为11的T4代转ZmPMP3拟南芥株数为5株；经蒸馏水处理的对照组中，能够完成全生育期的编号为12的T4代转ZmPMP3拟南芥株数为5株；部分结果作图12所示，可以看出，过表达ZmPMP3基因的转基因拟南芥在生殖生长期表现了良好的耐盐性。B、离体叶片保水力将消毒的野生型拟南芥(作为对照CK)、转空载体拟南芥及编号为5、6的T4代转 ZmPMP3拟南芥纯合的种子点种到MS固体培养基上于4°C黑暗条件下春化3d，移至22°C、每天16hr光照(100 μ E m_2 s—1)/8hr黑暗的光照培养箱中垂直放置生长5d，然后将幼苗移栽至含有重量比为1 1的营养土-蛭石组成的混合土的小盆中继续培养，使用植物营养液浇透，至拟南芥生长6周(此实验为了鉴定转基因拟南芥对水分的保持能力，是衡量植株耐渗透胁迫的指标之一。)，将6周大拟南芥的地上部分整株剪下，称取鲜重a。将其置于空气中(23°C，湿度40% ) 后再次称取重量b。然后与90°C烘干24h后至恒重，称取重量c。 根据公式计算保水率。实验重复三次，结果取平均值。WRC(%) =b-c/a-cX100结果如下Ck的保水率为75. 49% ；株系5的保水率为77. 98% ；株系6的保水率为79.02%。野生型拟南芥和转空载体拟南芥结果无显著差异。结果作图如图16所示，可以看出株系5、6的WRC显著高于ck，说明编号为5、6的 T4代转ZmPMP3拟南芥野生型拟南芥比野生型拟南芥的叶片保水力高。
权利要求
1.一种蛋白质，是如下1)或幻或幻的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；3)将序列2或序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且与植物耐逆性和/或保水力相关的由1)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)-8)中任一所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)序列表中序列1自5’末端第87位-283位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列1自5’末端第88位-264位核苷酸所示的DNA分子；4)序列表中序列3所示的DNA分子；5)序列表中序列3自5’末端第88位-264位核苷酸所示的DNA分子；6)序列表中序列3自5’末端第88位-283位核苷酸所示的DNA分子；7)在严格条件下与1)或幻或幻或4)或幻或6)限定的DNA分子杂交且编码所述与植物耐逆性和/或保水力相关蛋白质的DNA分子；8)与1)或2)或3)或4)或5)或6)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、 至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有 97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与所述植物耐逆性和/或保水力相关蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达品.ο
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为将权利要求2或3所述的编码基因插入载体PCAMBIA3301的多克隆位点得到的重组表达载体。
6.一种培育耐逆性和/或保水力提高的转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性和/或保水力高于所述目的植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述转基因植物的保水力高于所述目的植物为所述转基因植物的叶片保水率高于所述目的植物；所述耐逆性为耐旱性和/或耐盐性。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于权利要求2或3所述编码基因是通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中。
9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物优选为拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种与植物耐逆性相关蛋白ZmPMP3及其编码基因与应用。本发明提供了的蛋白质，名称为ZmPMP3，来源于玉米，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性和/或保水率相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的实验证明，用克隆的方法得到ZmPMP3基因，将其导入拟南芥中得到的转基因拟南芥，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥的耐逆性和/或保水率高于野生型拟南芥。本实验得到的ZmPMP3基因和转基因拟南芥在植物遗传育种方面有重要的意义。
文档编号C12N15/63GK102453083SQ20101052558
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者付静, 刘颖慧, 宋燕春, 张登峰, 李会勇, 王天宇, 石云素, 黎裕 申请人:中国农业科学院作物科学研究所