用于防止细胞粘附的肽和组合物及其使用方法【专利说明】[0001]本申请是申请日为2009年9月23日、申请号为200980138283.3,发明名称为"用于防止细胞粘附的肽和组合物及其使用方法"的发明专利申请的分案申请。[0002]相关专利申请案的夺叉参考[0003]本申请案是2009年9月23日申请的PCT/IB2009/006926的美国国家阶段，所述PCT/IB2009/006926主张2008年9月24日申请的美国临时申请案第61/136,673号的优先权，所有这些申请案都以全文引用的方式并入本文中，包括说明书、图式、权利要求书和摘要。
技术领域：
[0004]本发明涉及经分离的天然肽和其用于防止细胞粘附的用途。【
背景技术：
】[0005]微生物可以单个细胞形式在环境中自由游动，生存和繁殖（如浮游生物），或者其可生长成高度有组织的多细胞群落，装入自产聚合物基质（self-producedpolymericmatrix)中，与表面和界面紧密缔合。后一种微生物生活方式被称为生物膜。生物膜的形成代表着一种古老的受保护的生长模式，其允许微生物在不利环境中存活，并使微生物能分散和定植形成新的小生镜[霍尔-斯德雷（Hall-Stoodley)等人，自然微生物学综述（NatRevMicrobiol.)(2004)2(2):95-108]。[0006]生物膜的组成相当复杂，且不同微生物物种的组成不同，而且甚至同一物种在不同环境条件下的组成也不相同。尽管如此，生物膜的形成仍代表着微生物在环境中的正常生活方式，并且所有微生物都能够产生生物膜。先前的研宄揭露，细菌生物膜的形成经过多个蛋白质图谱不同的发展阶段[索尔（Sauer)等人，细菌学杂志（JBacteriol.)(2002)184(4):1140-54]，从附着于表面开始，随后迀移并分化形成小菌落，最终变成熟，涉及基质聚合物的表达。处于每一生物膜阶段内的细菌都展现与浮游生物生长的相同群组细菌明显不同的表型，并具有与之明显不同的特性[索尔（Sauer)等人，细菌学杂志（JBacteriol.)(2004)186(21):7312-26]。[0007]生物膜是导致人类全身感染（例如医院感染）的主要原因。在体内，生物膜可与组织（例如内耳、牙齿、齿龈、肺、心脏瓣膜和泌尿生殖道）缔合。实际上，预计人体65%的细菌感染都由生物膜引起。此外，在形成生物膜后，微生物倾向于改变其特征，有时这种改变是彻底的，以致当生物为附着或聚集生物膜形式时，通常能杀死悬浮培养物中的生物的抗生素剂量对这些微生物完全无效（美国专利第7189351号）。[0008]引入体内的产品（例如隐形眼镜、中心静脉导管、机械心脏瓣膜和起搏器）或提供进入体内的路径的产品所带来的一个主要问题是微生物感染和必定会形成生物膜。由于这些感染难以用抗生素进行治疗，故常常需要取出装置，而这会对患者带来创伤，并增加医疗成本。因此，对于这些医疗设备，此项技术中长期以来一直寻求使这些医疗设备和装置抗微生物的手段和方法。[0009]PCT申请案第TO06/006172号揭示了抗淀粉样蛋白试剂（诸如芳香族化合物）的用途，其可用于抑制生物膜的形成，或使现有生物膜崩解。所述申请案揭示，防止阿尔茨海默氏症（Alzheimer)形成淀粉样纤维的化合物可防止生物膜中纤维的形成，并且得出结论，具有芳香族臂的氨基酸可有效对抗生物膜。然而，这一分析仍局限于全长序列。【
发明内容】[0010]本发明提供广谱天然因子，其可干扰多种微生物中生物膜形成的初始阶段。从这些天然因子中，分离出具有高度保守序列的肽，并且呈现合成构象的这些肽在防止微生物粘附方面显示出较高活性。在数种海洋微生物（包括各种已知种类的海葵）、数种鱼类（包括斑马鱼（Daniorerio/zebrafish))和藓类植物小立碗藓亚种（Physcomitrellapatenssubsp.Patens.)中都发现了这一保守序列。[0011]上文提到的所有因子所显示的活性都仅仅针对防止细菌基质粘附和由此引起的生物膜形成。这些因子没有常常会观察到的由抗生素肽和次级代谢物所显示的致死性细菌活性，其通过强烈的微生物的"生物潜能"对快速自然选择提供较强的选择压力。另一方面，针对细菌定植的多种抑制作用将拮抗细菌存活的基础机制。因此，因其生命力而不太可能适应性改变所述机制。[0012]肖尔（Sher)等人（毒素（Toxicon)45:865-879,2005)使用生物信息学方法鉴别出了水螅表达的假定的生物活性蛋白质和多肽，其可作为其引诱系统（allomonalsystem)的组分。经显示，水螅可表达刺胞动物磷酯酶A2毒素和属于actinoporin家族的溶细胞素的直系同源物，并且表达与毒蛇类磷脂酶、富含半胱氨酸的分泌蛋白（cysteine-richsecretoryproetin，CRISP)、类前动力蛋白多肽和有毒脱氧核糖核酸酶类似的蛋白质。[0013]迄今为止，在从天然来源分离的肽中负责细胞毒性活性的特定序列尚未鉴别出来。[0014]除非另作定义，否则本文中使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所了解相同的含义。尽管与本文中所述方法和材料类似或等效的方法和材料都可用于实施或测试本发明，但下文将描述适合的方法和材料。在出现矛盾的情况下，以本专利说明书（包括定义）为主。此外，材料、方法和实例只是说明性的，且不打算作限制。[0015]本文中使用的术语"包含"和"包括"应理解为详细说明所述特征、整数、步骤或组分，但不排除添加其一个或一个以上其它特征、整数、步骤、组分或群组。本术语涵盖术语"由……组成"和"基本上由……组成"。[0016]短语"基本上由……组成"当用于本文中时，应理解为详细说明所述特征、整数、步骤或组分，但不排除添加其一个或一个以上其它特征、整数、步骤、组分或群组，而这只有当所述其它特征、整数、步骤、组分或群组不会显著改变所主张的组合物、装置或方法的基本和新颖特征时才能满足。[0017]术语"方法"是指用于实现指定任务的方式、手段、技术和程序，包括（但不限于）化学、生物和生物物理
技术领域：
从业人员已知或易于由已知方式、手段、技术和程序开发的方式、手段、技术和程序。[0018]本文中使用的术语"约"是指±10%。[0019]本发明的其它特征和优势将从以下实施方式和权利要求书显而易见。【附图说明】[0020]本文中将参照所附图式以举例方式描述本发明。现将详细说明各图式，应注意，所示细节是示范性的，并且只是出于说明性论述本发明的优选实施例的目的，旨在提供被认为最有用且最易于理解的对本发明原理和概念方面的描述。为此，没有试图以比从根本上理解本发明所需的更多细节显示本发明的结构细节，结合图式进行的描述将使所属领域技术人员了解如何在实践中具体实施本发明的数种形式。[0021]图中：[0022]图1显示水溶性状态的成孔溶细胞素海葵溶细胞素（sticholysin)Ii中IGWYA链的晶体结构，活性区以黄色标示；[0023]图2显示水溶性状态的成孔溶细胞素海葵溶细胞素Ii中IGWYB链的晶体结构，活性区以黄色标示；[0024]图3显示真核成孔溶细胞素等指海葵毒素（equinatoxin)Ii的1KD6A链的结构，活性区以黄色标示；[0025]图4显示等指海葵毒素突变体的三维构造，活性区以黄色标示；[0026]图5是显示不同浓度的合成蛋白在24小时内对绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853生长的影响的柱形图；无杀细菌或细菌生长抑制作用；[0027]图6是显示不同浓度的合成蛋白在24小时内对绿脓杆菌ATCC27853引起的生物膜形成的影响的柱形图；[0028]图7是显示不同浓度的合成蛋白在24小时内对鲍氏不动杆菌（AcinetobacterBaumannii)的临床分离株生长的影响的柱形图；无杀细菌或细菌生长抑制作用；[0029]图8是显示不同浓度的合成蛋白在24小时内对鲍氏不动杆菌的临床分离株引起的生物膜形成的影响的柱形图；[0030]图9是显示选自等指海葵（Actiniaequina)的触手部分对鲍氏不动杆菌引起的生物膜形成的影响的柱形图，其中PBS作为阳性对照物；[0031]图10是显示部分13对各种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌引起的生物膜形成的影响的柱形图；[0032]图11是显示来自迎风海葵属（Anemonia)、垃圾葵属（Aiptasia)和小立碗藓属(藓类植物）的蛋白质浓度为50μg/m"1的粗提取物对绿脓杆菌的影响的柱形图；[0033]图12是显示五种合成肽和来自藓类植物小立碗藓的粗物质的影响的柱形图；[0034]图13显示通过在葡聚糖凝胶（Sephadex)G-IO柱上分离美丽海葵（Aiptasiapulchella)的粗提取物所得到的部分；[0035]图14显示通过再色谱分离图13中的高分子量部分得到的峰；[0036]图15显示利用c-18柱反相高效液相色谱（RP-HPLC)分离图14中的低分子量部分得到的部分；[0037]图16A-B显示根据本发明原理的肽的具有乳化剂臂的环状头的基本结构；和[0038]图17是显示产生具有乳化臂的环状肽的流程图。【具体实施方式】[0039]本发明是包含经分离肽的组合物，所述经分离肽具有一个或一个以上与防止细菌基质粘附和由此引起的生物膜形成，以及任选防止细胞间粘附有关的作用。另外或其它，也可任选提供其它作用。在非限制性实例中，所述肽可从诸如水生生物和藓类植物等生物提取，并任选且优选包含选自由以下组成的群组的序列：YDYNWY、YDYNLY、FDYNFY、FDYNLY、FDYNWY、YDWNLY、YDWHLY和WDYNLY;和其使用方法。其它序列如下文所述。[0040]在医学方面，一个重要问题是微生物生物膜的形成。对于人类来说，生物膜是引起全身感染（例如医院感染）的原因，并且当将产品引入体内（例如隐形眼镜、中心静脉导管、机械心脏瓣膜和起搏器）时会成为关注的重点。[0041]在许多工业中，包括食品业、制药业、涂料工业、水、船业工程业，生物膜也是一个问题，其会带来多种不利的影响，包括加速工业系统的腐蚀、油酸化和生物污损。举例来说，在海洋或淡水环境中，包括冷却或脱盐设施、灌溉站和发电站中的冷却塔、水管和过滤器，以及膜，诸如用于废水和脱盐系统中的膜，生物粘附于任何表面都可能引起生物污损。在养鱼场的水产养殖系统中，也会发生生物污损。[0042]此外，全世界的商业船队每年要消耗约三亿吨燃料。如果不采取抗污损措施，燃料消耗将增加多达40%，相当于每年额外消耗一亿两千万吨燃料。在2000年，预计这一经济成本为约七十五亿美元；近来的预计值达到三百亿美元。[0043]由于在生物膜内生长的微生物高度组织，并且能经受不利的环境，诸如高温和抗微生物剂（例如抗生素），使得很难去除生物膜。[0044]海洋和淡水植物和生物，包括软体水生无脊椎动物、鱼类和藓类植物，都被多种微生物所包围。由于这些植物和生物缺乏特异性免疫，故其会产生数种可防止微生物定植于其体表上的因子。[0045]最"敏感"的生物是属于刺胞动物门的无脊椎动物，包括海葵、珊瑚、水母、水螅虫、水母体和海扇。这些软体生物没有物理防护，诸如鳞或壳，使用蛋白质和次级代谢物来保护其免受周围微生物环境影响。[0046]先前曾报导过，海洋生物（例如海绵动物）产生的次级代谢物展现出抗细菌和抗真菌活性[阿曼德（Amade)等人，同上文]。此外，也已经显示海葵（例如等指海葵）可产生有毒的成孔肽（即等指海葵毒素），其与其它小的抗微生物肽类似，能溶解和杀死真核细胞[安德鲁斯（Anderluh)等人，同上文]。[0047]尽管此项技术中已知，多种蛋白质的全长序列都与其细胞溶解功能有关，但先前尚未鉴别出负责细胞溶解作用的特定肽。[0048]本发明者已经证实，使用液相色谱分离法从海葵获得的数个活性部分能够高水平防止微生物粘附于无生命表面。海葵包括46个科，可见于世界各地的水源。大部分海葵都是固着动物，具有专门的足用来将其锚定于软基质中，或使其附着于岩石和珊瑚上。属于不同属：等指海葵(Actiniaequine)、垃圾葵属和迎风海葵属的数种海葵显示出抗粘附活性。经显示，海葵细胞毒素的N末端区与细胞毒性作用有关[参见：科瑞斯坦（KristanK)，博得思科（PodlesekZ)，霍尼克（HojnikV)，古提雷兹-艾格雷（Gutierrez-AguirreI)，格尼卡（Grn^arG)，特克（TurkD)，刚撒雷兹-玛纳斯（Gonzalez-ManasJM)，雷克（LakeyJH)，马斯克（Ma&kP)，安德鲁斯（AnderluhG)(2004):等指海葵毒素（一种真核成孔毒素）形成孔需要柔性N末端区和稳定的β夹层（Poreformationbyequinatoxin,aneukaryoticpore-formingtoxin,requiresaflexibleN-terminalregionandastablebetasandwich).生物化学杂志（JBiolChem.)279(45):46509-46517]。本发明者也已经在鱼类中鉴别出与海葵细胞毒素C末端区（不涉及细胞毒性的区域）具有某种类似之处的蛋白质。这一蛋白质具有高度保守的区域，功能尚不了解，这一区域也是一个富含Trp的结构域，并且对于蛋白质结合脂质膜极为重要。本发明者还在藓类植物小立碗藓中发现这一区域。[0049]因此，本发明者假定，这一区域提供了一种对于防止生物膜形成特别有效的肽，而这种肽没有细胞毒性活性。本发明者已经表征和分离出一种具有高度有效的抗生物膜特性的天然肽，其包含选自由以下组成的群组的序列：YDYNWY、YDYNLY、FDYNFY、FDYNLY、WDYNLY、FDYNWY、YDWNLY和YDWHLYo[0050]根据一些实施例，所述肽包含由约30、约40或约50个氨基酸构成的一部分序列。[0051]根据一些实施例，所述肽选自由以下组成的群组：LFSVPYDYNWYSNWff、FSVPYDYNLYSNffff,MFSVPFDYNFYSNffff,MFSVPFDYNLYSNffff,MFSVPFDYNLYTNffff,MffSVPFDYNLYSNffff,MFSVPffDYNLYKNffF,MFSVPFDYNLYKNWL,MFSVPFFDYNffYSNffff,LFSVPFDYNLYSNWW、LFSVPYDYNWYSNWW、MASIPYDWNLYQSWA、MASIPYDWNLYSAWA和MASIPYDWHLYNAWA。如下文和以下实例部分中所示，本发明者已经使用串联质谱（MS/MS)分析鉴别出从美丽海葵提取的活性部分。[0052]本发明者使用ClustaLW程序鉴别出数种海葵细胞毒素蛋白的具有生物意义的多重序列比对，并鉴别出适用于聚合酶链反应（PCR)的海葵细胞毒素通用引物。分别扩增来自两种不同海葵即垃圾葵和蛇发海葵（anemoniaviridansm)的250bp细胞毒素蛋白质区的序列Eqt-F:GTRTCGACAACGAGTCRGG，和Eqt-R252:TGACATYCCACCAGTTGCTG。将这些区域翻译成肽，并使用BlastX与基因库（genebank)相比较，显示这些区域是海葵细胞毒素的保守结构域的一部分。如下文实例部分中较为详细地论述以及图5到8中所示，本发明者比较了来自海葵和藓类植物的多种合成肽的活性，并且发现这些肽可防止生物膜形成[图6和8到12]，但不能杀死或抑制细菌生长[图5和7]。[0053]对数种细菌物种展现抗粘附作用（图10)，使得本发明者得出结论，活性物质不具有物种特异性，而是对多种微生物物种都具有活性。[0054]举例来说，已经在以下天然蛋白质中鉴别出保守肽区：[0055][005当前第1页1 2 3 4 5 6