二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于合成医药技术领域，具体涉及一种具有光控释放一氧化碳性能的二肽 小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，以及该化合物在抗缺血性灌注再损伤方面 的应用。
【背景技术】
[0002] CO是一种剧毒气体，对人体的伤害极大，但近年来研宄表明，CO与NO -样是一种 非常重要且能释放生物信号的分子。实际上，人体内血红素氧合酶降解血红素过程中会不 断产生少量的C〇,它展现出细胞保护、抗炎症性、促进血管舒张、防止缺血再灌注损伤以及 其他治疗功效。
[0003] 为了发展CO治疗的有效形式，一系列一氧化碳释放分子（CO Releasing Molecules，CO-RMs)得以发展。在自然条件下被确定能够释放出CO的化合物存在五种。 第一种是醛类：初步的研宄数据确定了它们的潜在生物活性，但其CO释放速度慢，且其毒 物学性质妨碍了其作为CO-RMs的发展；第二种是草酸类：释放CO的速度太慢；第三种是硼 的碳酸酯：是一种众所周知的CO释放物，然而，这些化合物的化学转换范围受限，且不满足 化合物所应具有的合适药物学特征；第四种是硅的碳酸酯：这类化合物只有在热的有机溶 剂、强的催化剂存在时，才能释放出C0,其高温、强的基础活性的要求表明它们与生物系统 不相容；第五种是金属羰基化合物：具有稳定好，实现可控释放和靶向传输的优势，是一类 极具医学应用前景的C〇-RMs。
[0004] 近年来，随着科学技术的发展，烧伤的皮肤移植、肾移植、肝脏移植等器官移植慢 慢解决以前无法攻克的问题，并且取得了较大的进展，然而仍然存在着这样那样的技术问 题。机体组织器官正常代谢、功能的维持，有赖于良好的血液循环。各种原因造成的局部组 织器官的缺血，常常使组织细胞发生缺血性损伤，但在动物试验和临床观察中也发现，在一 定条件下恢复血液再灌注后，部分动物或患者细胞功能代谢障碍及结构破坏不但未减轻反 而加重，因而将这种血液再灌注后缺血性损伤进一步加重的现象称为缺血再灌注损伤。缺 血再灌注损伤的发生机制主要有：自由基的作用、钙超载的作用、白细胞的作用、高能磷酸 化合物缺乏、内皮素的作用、血管紧张素 II的作用等等，而自由基的氧化作用是重中之重。
[0005] 缺血所引的组织损伤是致死性疾病的主要原因，诸如冠动脉硬化导致的心肌梗 死、脑卒中等。在缺血性疾病抢救和治疗过程中，医学家们渐渐发现，对组织造成损伤的主 要因素，不是缺血本身，而是恢复血液供应后，过量的自由基攻击这部分重新获得血液供应 的组织内的细胞造成的。有许多证据说明仅仅缺血还不足以导致组织损伤，而是在缺血一 段时间后又突然恢复供血（即再灌注）时才出现损伤。在创伤性休克、外科手术、器官移 植、烧伤、冻伤和血栓等血液循环障碍时，都会出现缺血后再灌注损伤。缺血组织再灌注时 造成的微血管和实质器官的损伤主要是由活性氧自由基引起的，这已在多种器官中得到证 明。在缺血组织中具有清除自由基的抗氧化酶类合成能力发生障碍，从而加剧了自由基对 缺血后再灌注组织的损伤。一氧化碳释放法分子释放出的CO具有清除自由基的抗氧化作 用，并且CO具有抗菌消炎的生理作用更增加了一氧化碳释放分子，特别是金属羰基化合物 在抗缺血性灌注再损伤方面的作用，但是现有的金属羰基化合物存在水溶性差、热稳定性 差、毒性大、生物相容性低、一氧化碳的不可控释放等缺点。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于克服现有金属羰基化合物存在的缺点，提供一种 热稳定较好、毒性较低，且具有较好的水溶性和生物相容性，能够实现光控释放一氧化碳， 有效的应用于抗缺血性灌注再损伤的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物， 以及该化合物的制备方法。
[0007] 解决上述技术问题所采用的技术方案是：该二肽小分子修饰的杂N稳定的 Fischer卡宾化合物的结构式如下所示：
[0008]
[0009] 式中M代表Cr、Mo或W，R1、R2、R3、R4各自独立的代表-H、烷基、-C nH2n-R5、苄基中的 任意一种，其中R5代表-H、-OH、-C00H、-NH 2、-SH、-SCH3*的任意一种，η为1~3的整数。
[0010] 上述的Rp R2、R3、R4优选各自独立的代表-Η、C广C 4烷基、苄基中的任意一种。
[0011] 本发明二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的制备方法如下：
[0012] 1、在无水无氧，氮气保护条件下，以无水甲醇为溶剂，将式1所示的Fischer卡宾、 式2所示的氨基酸、弱碱室温反应5~10小时，室温减压旋转蒸发除去溶剂，得到式3所示 的氨基酸修饰的Fischer卡宾，反应路线如下：
[0013]
[0014] 2、在无水无氧条件下，以二氯甲烷为溶剂，将式3所示的氨基酸修饰的Fischer卡 宾与4-二甲氨基吡啶（DMAP)、Ν，Ν' -二环己基碳酰亚胺（DCC)、式4所示的氨基酸甲酯盐 酸盐在冰浴条件下反应18~24小时，采用柱色谱分离，得到二肽小分子修饰的杂N稳定的 Fischer卡宾化合物，反应路线如下：
[0015] 3 ^
[0016] 上述的Fischer卡宾与氨基酸、弱碱、4-二甲氨基吡啶、Ν，Ν' -二环己基碳酰亚胺、 氨基酸甲酯盐酸盐的摩尔比为I: (1~1. 2) : (1~6) : (0. 2~0. 3) : (1. 5~2) : (1~1. 2)， 所述的弱碱为三乙胺、1(20)3或Na 2C03。
[0017] 本发明的有益效果如下：
[0018] 本发明先通过氨基酸与Fischer卡宾偶联生成氨基酸修饰的Fischer卡宾，然后 在催化剂作用下将氨基酸修饰的Fischer卡宾与氨基酸甲酯盐酸盐偶联生成稳定的酰胺 键，即二肽小分子修饰的N稳定的Fischer卡宾化合物，其容易分离且纯度较高。
[0019] 本发明通过二肽小分子对Fischer卡宾进行修饰，不仅增加了 Fischer卡宾的水 溶性、生物相容性，降低了分子的毒性，并且极大地增加了分子的热稳定性。
[0020] 本发明二肽小分子修饰的N稳定的Fischer卡宾化合物在紫外光照射下能够迅速 释放一氧化碳分子，对光具有较好的响应性，且该化合物分子量较小，携带的CO较多，每个 分子可携带五个CO, CO释放效率很高，可作为光控一氧化碳释放分子，实现一氧化碳的可 控释放，用于病变组织的抗菌抗炎和缺血性组织再灌注损伤的治疗，为一氧化碳释放分子 的靶向释放开辟了一条新的道路。
【附图说明】
[0021] 图1是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的晶体 图。
[0022] 图2是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物沿a方 向的一维层状图。
[0023] 图3是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的多面 体堆积微孔图。
[0024] 图4是实施例4制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的晶体 图。
[0025] 图5是实施例4制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物沿a方 向的一维层状图。
[0026] 图6是实施例4制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的多面 体堆积的微孔图。
[0027] 图7是五羰基铬的Fischer卡宾的热重分析图。
[0028] 图8是实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物的 热重分析图。
[0029] 图9是肌红蛋白法测试一氧化碳释放分子的CO释放。
[0030] 图10是10umol/L实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡 宾化合物在PBS中的CO释放动力学图。
[0031] 图11是20umol/L实施例1~7制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡 宾化合物在PBS中的CO释放动力学图。
[0032] 图12是实施例1制备的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物在器 官保存液中的释放动力学图。
[0033] 图13是小鼠左肾缺血不同时间再灌注后的存活情况。
[0034] 图14是小鼠尾静脉分别注射实施例1化合物及生理盐水1小时后行肾致死性缺 血/再灌注的存活情况。
[0035] 图15是小鼠尾静脉分别注射失活的实施例1化合物及生理盐水1小时后行肾致 死性缺血/再灌注的存活情况。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于 这些实施例。
[0037] 实施例1
[0038] 以制备结构式如下的二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物为例，其 制备方法为：
[0039]
[0040] 1、在兀7」、兀羊I1求1十r，符DDDZg Ummo丄；H班整m tfJ nscner卡宾和 0. 1501g(2mmol)甘氨酸加入到反应瓶中，加入15mL无水甲醇和0. 3mL(2mmol)三乙胺，室温 条件下反应5小时，室温减压旋转蒸发除去溶剂，得到甘氨酸修饰的Fischer卡宾。
[0041 ] 2、在无水无氧条件下，向步骤1得到的甘氨酸修饰的Fischer卡宾中加入 0· 02510g(2mmol)甘氨酸甲酯盐酸盐、0· 0611g(0. 5mmol)4-二甲氨基吡啶（DMAP)、 0. 4124g(2mmol)二环己基碳二亚胺（DCC)、20mL无水二氯甲烷，在冰浴条件下反应24小 时，反应结束后，以二氯甲烷作为洗脱剂采用柱色谱分离产物，干燥产物，得到黄色固体 二肽小分子修饰的杂N稳定的Fischer卡宾化合物，其收率为77. 6%，结构表征数据为： IR(CH2C12, cm-1) ：V(C0) = 2056cm_1U927cm_1, V(COCH3) = 1748cm-1, V(CONH) = 1697cm_\ 1518CHT1; 1H-NmrGOOMHz, CDCl3) (Z/E = 5/2) δ :9. 51(s，J = 96. 5Hz，lH，NH)，6.37(s， J = 134.2Hz，lH，NH)，4.40(dd，J = 191.8、3.8Hz，4H)，3.81(s，3H，CH3)，2.75(d，J = 52.3Hz，3H，CH3) ;13C-匪R(101MHz，CDCl3) δ :217.70(C0)，217.5(C0)，169.74(CTCH3)， 169. 65 (COCH3)，166. 80 (CONH)，165. 71 (CONH)，53. 30 (OCH3)，52. 83 (CH)，52. 78 (CH)， 48. 37 ( = CCH3)，45. 36 ( = CCH3)，41. 42 (CH2)，37. 23 (CH2) ;ESI-Ms :理论值[M] = 364.