专利名称：：一种四－(α－氨基酸或二肽)双铜配合物及其合成方法和SOD样活性的制作方法
技术领域：
：该发明是一种四-(α-氨基酸或二肽)双铜配合物及其合成方法和SOD(超氧化物歧化酶)样活性，属于化学中金属有机配合物和药学中SOD模拟物
技术领域：
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背景技术：
：SOD是生物体内存在的一种金属酶，其能够清除过量的活性氧，从而维持机体的健康。但当人衰老或处于疾病状态时，活性氧的量往往增加，因此给与机体外源性的SOD是治疗由于活性氧产生过多造成的疾病的一种手段。但由于天然SOD在体内的半衰期较短，因此应运而生了SOD模拟物。SOD模拟物通过模拟SOD的活性中心而得名，现有简单的单核氨基酸(短肽)铜络合物[1]，含表面活性剂的氨基酸铜络合物[2]，咪唑桥联双铜络合物[3]以及羟基桥联铜络合物[4]等。我们用新的合成方法得到了一种新的四-(α-氨基酸或二肽)双铜配合物，其具有与天然SOD相类似的二聚体结构，而且配体均为α氨基酸或多肽，较原来文献报道的双核铜络合物[3，4]，在结构上更接近于天然SOD。经文献检索，未发现类似的报导。经脉冲辐解法研究发现，这种新型双铜络合物具有与天然SOD相当的清除超氧阴离子自由基的能力。药效学研究结果发现，糖尿病模型小鼠经口服给药，能明显降低血糖，改善调节血脂紊乱，对糖尿病小鼠的心肾组织具有明显的保护作用，因此此种新型配合物是一种具有潜力的代替天然SOD的模拟物。
发明内容1.该发明的创新点之一是提出一种新型结构的双铜配合物，该配合物的组成式为[R-CH(NH2)-COO-；R-CH(NH2)-CONH-CH(COO-)-R′]4Cu2·XH2O式中X＝0，配合物无结晶水；R为C0～C14的直链烷烃，也可以为C2～C14的碳酰基以及含有羟基、硫、苯环和氮杂环的烃基。R与R’基团可同可不同。该种无结晶水配合物的晶体结构特征是Cu(II)离子位于分子的对称中心位置，配体R-CH(NH2)-COO-或R-CH(NH2)-CONH-CH(COO-)-R′分别以二齿形式与Cu(II)离子配位；两个Cu(II)离子主要通过羧基-O＝C-O-桥联，再辅以邻近配体间存在的氢键，连接成二聚体；形成的二聚体的两个“单体”互为对映异构体，呈中心对称。经文献检索，未发现有该种配合物的报导。曾有过双铜咪唑桥联络合物的报导[3]，苏氨酸铜配合物C8H16CuN2O6·H2O[5]和(C8H16CuN2O6)n·nH2O的报导[6]，以上均不是氨基酸或二肽的双铜配合物，且都含有结晶水。如果按我们的合成方法，用苏氨酸做原料，所合成的配合物组成为(C8H16CuN2O6)2，详见实施示例1。2.该发明的创新点之二在于提出一种无结晶水四-(α-氨基酸或二肽)双铜配合物合成方法。该方法是以乙酸铜或碱式碳酸铜以及α-氨基酸或二肽为原料，在无水乙醇或乙醚或丙酮等有机溶剂中，35～80℃下回流1～14小时，进行液-固相转移反应。反应产物以无水乙醇等有机溶剂洗涤，而不用水。反应温度和时间因所用原料和所选溶剂的不同而不同。Cu(II)离子原料优选乙酸铜；无水溶剂优选乙醇，这是因为乙醇无毒，沸点适当，而且乙酸铜在其中具有较大的溶解度。反应物乙酸铜或碱式碳酸铜α-氨基酸或二肽≈1.1∶2.0(摩尔比)。两种原料用量的选择原则在于1)原料来源及成本，2)容易除去过量的反应物，因此选择乙酸铜稍过量。采用该合成方法得到的产物为不含结晶水具有前述结构特征的四-(α-氨基酸或二肽)双铜配合物。需要说明的是，反应体系虽为无水的固—液相转移反应，但若有少量水(1～5％)存在，不影响产物的质量。上述合成方法散见于过渡金属有机化合物的合成中，但所用的配位化合物不同，中心离子不同，以及所选择的溶剂不同，因此得到了一种新型的配合物。3.该发明的创新点之三在于该种双铜配合物具有较高的SOD样活性。其特征在于此种配合物与超氧化物歧化酶(SOD)一样，具有Cu(II)离子活性中心，且都为二聚体，并且都能够清除超氧阴离子自由基(O2.-)。经脉冲辐解法研究表明其具有和天然SOD相当的SOD样活性，某些还超过了天然SOD。曾有关合成的咪唑桥联的双核铜(II)配合物[3]和含表面活性剂的氨基酸铜络合物[2]活性研究的报导，它们的SOD样活性都较低。该双铜配合物作为SOD的模拟物，在结构上更接近于天然SOD，而且克服了天然SOD药用酶在临床应用上的诸多限制，如较天然SOD有更长的体内半衰期，相对分子量较小，常温下长期放置不失活，比较适宜口服，不易受污染，价格更便宜。因此其在抗氧化，抗衰老，预防疾病方面具有更大的潜力。另外也可以在食品中用作保鲜剂，在化妆品中用作抗氧化剂，在农业上用于增强作物抗旱，抗早衰和抗化学药害的能力。4.该发明的创新点之四在于该种双铜配合物能够降低糖尿病血糖、血脂以及对心肾血管具有保护作用。采用低、中、高(0.002％，0.02％，0.1％)三种剂量的四-(α-氨基酸或二肽)双铜配合物分组喂养糖尿病小鼠，测定其空腹血糖、糖化血红蛋白、血脂及糖尿病小鼠的心、肾病理改变。结果发现，中剂量组能够明显降低血糖，降低胆固醇(TC)，降低低密度脂蛋白(LDL)水平以及使得高密度脂蛋白(HDL)水平明显升高。中剂量灌胃给药组糖尿病小鼠心肌纤维排列整齐，细胞核和细胞浆分布均匀；肾小球结构正常，细胞大小分布均匀，染色正常。因此可以看出此种双铜络合物具有显著的降血糖、调节血脂紊乱的作用，并对糖尿病小鼠的心肾组织起到明显的保护作用，其中以中剂量组(0.02％)效果最佳。这种SOD模拟物在临床上对糖尿病病人抗氧化、降血糖治疗、防治大血管、微血管病变具有较大的应用前景。具体实施例方式实施例1无结晶水四-(α-氨基酸或二肽)双铜配合物的合成1.无结晶水苏氨酸双铜配合物的合成称取5.5mmol乙酸铜，溶于50ml无水乙醇，搅拌下缓慢加入10mmolL-苏氨酸，79℃下回流反应12小时。抽滤，用无水乙醇洗涤产品至无绿色洗涤液为止，产品真空干燥得到兰色固体。2.无结晶水四-(双甘肽)双铜配合物的合成称取5.5mmol乙酸铜，溶于50ml95％乙醇，溶液呈绿色透明。在溶液中加入10mmol双甘肽，79℃下回流反应1～2小时。抽滤，用无水乙醇洗涤产品至无绿色洗涤液为止，产品真空干燥得到兰色固体。3.无结晶水四-(N一正十二碳酰双甘肽)双铜配合物的合成首先按文献[7]合成正十二碳酰双甘肽。称取5.5mmol乙酸铜，溶于50ml无水乙醇。在溶液中加入10mmol正十二碳酰双甘肽，78℃下回流反应1～2小时。抽滤，用无水乙醇洗涤产品至无绿色洗涤液为止，产品真空干燥得到兰绿色固体。实施例2无结晶水苏氨酸双铜配合物的结构表征一、元素分析结果用美国P-E公司2400型元素分析仪对合成产物进行了元素分析，结果如下表1Cu2(Thr)4配合物元素分析结果二、X-衍射分析结果实验在BrukerSmartCCD衍射仪上室温下进行，晶体为0.51mm×0.49mm×0.38mm的无色透明块状，使用单色化的MoKαX射线(λ＝0.071073nm)收集衍射强度数据。在2.05°≤θ≤28.33°的范围内共收集到7627个衍射点，其中1430个独立衍射点(Rint＝0.03870)。晶体解析用SHELXS97程序进行。双核苏氨酸铜的非氢原子坐标及各向同性热参数列于表2，主要成键原子之间的键长和键角列于表3，分子结构及原子标记如附图1所示。表2.非氢原子坐标(×104)及各向同性热参数(nm2×105)*UeqisdefinedasonethirdofthetraceoftheorthogonalizedUijtensor.表3.主要成键原子之间的键长(nm)和键角(°)晶体结构测定表明，Cu(II)离子位于分子的对称中心位置和一个被拉长了的八面体配位环境中。两个由对称中心联系的L-苏氨酸根分别以二齿形式与Cu(II)离子配位，O(11)、N(11)、O(21)和N(21)组成的平行四边形为赤道平面。Cu与该平面的距离为0.000nm。O(11)-Cu-O(21)、N(11)-Cu-N(21)和O(11)-Cu-N(11)的键角分别为180.00°、180.00°和83.00°。由二齿席夫碱配体[O(11)、C(11)、C(12)、N(11)]和Cu原子所形成的五元螯合环共面性很好，各原子偏离它们的最小二乘平面的平均值仅为0.01403nm。Cu-N键长与Cu-O键长分别为0.1972(2)nm和0.1942(2)nm，与已经研究过的单核配合物的一水合物[5][Cu(Thr)2·H2O]的平均Cu-N键长与Cu-O键长基本相等。C(2)-N(1)键长(0.14702(3)nm)比通常的C-N单键键长要短，这也与Ueki等描述的席夫碱类型I的值相一致[8]。轴向配位原子是羧酸基的氧原子O(22A)，Cu-O键长为0.2797nm，O(22A)-Cu-O(21)、O(22A)-Cu-N(21)的键角分别为100.90°和94.60°。Cu(II)离子位于分子的对称中心位置[9]，在无水双核苏氨酸铜的晶体中，还存在羟基的氧原子O(23A)与羧酸基的氧原子O(12)的氢键(键长为0.2814nm)。图1表示了双核苏氨酸的结构Cu(II)离子位于分子的对称中心位置，2个邻近的苏氨酸铜分子通过这个氢键以及Cu-O＝C＝O-Cu连接形成二聚体，形成二聚体的2个分子互为对映异构体，呈中心对称性。三、热分析结果采用瑞士MettlerTA3000热分析系统测定了经红外干燥后的单核及双核苏氨酸铜的热解过程。升温速率为20K/min，氮气(高纯)流速为10ml/min，实验温度扫描区间为30～400℃。图2、3为实验所得单核及双核苏氨酸铜的TG、DTG图谱。用此瑞士MettlerTA3000热分析系统自动积分仪处理DTG谱得到了热解动力学参数，其结果见表4。表4热解动力学参数<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="712">stepanalysiskineticanalysiscomplexsteppeaktemp.(℃)Δm(％)nEa(KJ/mol)lnACu(Thr)2Cu2(Thr)4step1step1step2224.0216.0237.0-72.35-31.79-43.823.01.51.0623.73702.18201.3548.5270.3044.10</table></tables>1.单核苏氨酸铜的热解过程分析单核苏氨酸铜[Cu(Thr)2]的热解动力学过程为一步完成。Cu(Thr)2，CuO的相对分子量分别为299.78g/mol和79.55g/mol。Cu(Thr)2热解失去1个分子的CO2，1个分子的CO，2个分子的H2O，2个分子的CH2＝CH2以及1个分子的C2H2、1个分子的N2。理论失重率为73.46％，与实验值72.35％相近。配合气相、固相产物定性分析结果，可推测Cu(Thr)2热解过程反应方程式为2.双核苏氨酸铜的热解过程分析双核苏氨酸铜[Cu2(Thr)4]的热解过程分为二步完成。Cu2(Thr)4、Cu2O的相对分子量为599.55g/mol和143.09g/mol。第一步热解过程失4个H2O、4个C2H4，其相对分子量分别为18.02g/mol、28.05g/mol，理论失重率为30.74％，与实验值31.79％基本相符。第二步热解过程为失去3个CO2、1个CO、及2个C2H2，2个N2。理论失重率为45.4％，与实验值为43.82％相近。推测反应如下结论本文所合成的双核苏氨酸铜经元素分析，不能十分确定其具有双核结构，但经过其热重分析，发现其与单核苏氨酸铜的热解过程不同，失重百分率不同，经分析发现它们的热解产物也不相同，单核苏氨酸铜热解产物为CuO、而双核苏氨酸铜则为Cu2O。同时经过培养双核铜苏氨酸络合物的单晶，进行X-衍射分析，结果表明此化合物具有Cu-O＝C＝O-Cu双核结构。2个邻近的苏氨酸铜分子通过Cu-O-C-O-Cu连接形成二聚体，形成二聚体的2个分子互为对映异构体，呈中心对称。实施例3无结晶水甘氨酸双铜配合物的SOD样活性采用脉冲辐解法[1]测定该配合物的SOD样活性，结果表明，在25℃、pH7.8的条件下，天然SOD催化O2.-歧化反应的速率常数为1.85×109mol-1·L-1·s-1。所测甘氨酸双铜配合物催化O2.-歧化反应的速率常数为3.45×109mol-1·L-1·s-1。结果表明甘氨酸双铜配合物具有SOD样活性，而且比天然SOD活性更高。实施例4无结晶水苏氨酸双铜配合物对实验性糖尿病小鼠血糖、血脂的影响以及对心肾血管的保护作用诸多的研究证明，自由基参与人的病理生理过程，而超氧化物岐化酶(SOD)是体内主要的自由基清除剂，对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用。由于糖尿病人体内SOD水平明显降低，因此糖尿病与SOD的关系越来越被人们所重视。实验证实给SOD减少的糖尿病患者补充天然SOD后，提高机体的SOD水平，清除过多的自由基、改善高血糖状态及纠正脂代谢紊乱。由于天然SOD半衰期短、提取困难和价格的高昂等因素，给医学科研等方面的广泛应用受到了更多的限制。苏氨酸双铜配合物是一种半衰期长、价格便宜、易提取且捕捉自由基能力很强的抗氧化剂，对实验性糖尿病小鼠的血糖、血脂具有调节作用以及对心肾血管的保护作用，能够干预糖尿病的发生和发展。一、材料与方法1.动物模型的建立与分组ICR雌性小鼠60只，体重26~30克。糖尿病模型的建立动物均隔夜禁食12h，腹腔注射四氧嘧啶(Alloxan，Sigma公司提供)120mg/kg。一周后取小鼠尾血测微量血糖，血糖＞10mmol/L定为糖尿病模型小鼠。糖尿病小鼠按血糖值均匀分组，每组12只，按组分笼喂养。分别灌胃给蒸馏水，苏氨酸双铜配合物低剂量(0.002％)，中剂量(0.02％)，高剂量(0.1％)，每日灌胃0.5ml/20g，共计给药45天。2.在灌胃0，30及45天取尾血测量血糖，45天取眼血测定糖化血红蛋白、血脂，并处死动物，解剖取心脏、肾脏，20％福尔马林固定后制作病理切片。3.统计学处理数据以X±S表示。采用配对t检验进行统计学处理，P＜0.05，差异有显著意义。二、实验结果1.不同剂量苏氨酸双铜配合物对血糖、糖化血红蛋白的影响表5不同剂量苏氨酸双铜配合物对血糖、糖化血红蛋白的影响*P＜0.05，**P＜0.01，从表1中数据可以看出给约30大，各组血糖与0天没有显著性变化，给药45天后，SOD模拟物低、中剂量组血糖下降明显，与糖尿病对照组比较具有显著性差异(p＜0.01)；高剂量组血糖下降，但不明显。45天测得的糖化血红蛋白，可以看出与蒸馏水对照组相比比苏氨酸双铜配合物低、中、高剂量组糖化血红蛋白均明显降低，并有显著性差异。2.不同剂量苏氨酸双铜配合物对血脂的影响表6不同剂量苏氨酸双铜配合物对血脂的影响(X±S)注*P＜0.05动脉粥样硬化指数(AI)＝(TC-HDL)/HDL(1)TC与蒸馏水组相比，苏氨酸双铜配合物中剂量组TC水平明显降低，有显著性差异(P＜0.05)。(2)TG与蒸馏水组相比，低、中剂量组TG水平均有降低，具有统计学意义(P＜0.05)。(3)HDL与蒸馏水组相比，低剂量组HDL水平明显升高，有显著性差异(P＜0.05)。(4)LDL与蒸馏水组相比，中剂量组LDL明显降低，有显著性差异(P＜0.05)。5)动脉粥样硬化指数(AI)低、中、高剂量组AI均有所降低，以中剂量组效果最好(P＜0.05)。3.不同剂量苏氨酸双铜配合物对糖尿病小鼠心脏的病理改变(见附图4-7)经对小鼠心脏切片HE染色后，观察结果如下图4为蒸馏水对照组，图中显示心肌纤维结构排列紊乱，变性，肌纤维断裂，溶解；图5为低剂量给药组，图中显示心肌纤维排列正常，细胞水肿、变性，上方为间质充血。图6为中剂量给药组，图中显示了心肌纤维排列结构正常，细胞核和细胞浆分布均匀；图7为高剂量给药组，图中可见心肌纤维结构存在，可见局灶性心肌纤维肿胀和变性，细胞核变少，细胞浆染色变淡。由此可见苏氨酸双铜配合物中剂量组对心肌细胞的保护作用高于低、高剂量组。4.不同剂量苏氨酸双铜配合物对糖尿病小鼠肾脏的病理改变(见附图8-11)经对小鼠肾脏切片HE染色后，观察结果如下图8为蒸馏水对照组，图中显示肾小球细胞肿胀、细胞萎缩、变性，肾小囊间隙变宽。图9为低剂量给药组，图中显示肾小球细胞核相对较多、核小、细胞萎缩间质较致密，轻度纤维化。图10为中剂量给药组，图中显示了正常结构肾小球，细胞核分布均匀，染色正常。图11为高剂量给药组，图中可见肾小球大小正常，细胞数相对较多，核颜色较深，细胞萎缩，间质有纤维化。综上所述合适浓度的苏氨酸双铜配合物完全可以与天然SOD媲美，它不仅能够有效地降低血糖，而且还能调节血脂代谢紊乱，升高HDL，降低LDL，通过调控糖尿病小鼠的糖、脂代谢，减轻动脉粥样硬化的危险因素，抑制糖尿病的心、肾的病理学改变，从而控制糖尿病的发生和发展。因此苏氨酸双铜配合物的广泛应用，为防治糖尿病及其并发症提供了一种新的治疗手段。参考文献1.谢英，邓希贤，金虬，李大珍，李凤梅“脉冲辐解法研究Cu(Ser)2和Cu(Gly-Gly)2催化O2.-歧化反应的动力学”北京师范大学学报(自然科学版)1997，33(2)226-2302.LiFengmei，XieYing，DengXixian，ZhouXuan，ChenDianhua“KineticsstudyondismutationofsuperoxideanioncatalyzedbyCu(Gly-Gly)byusingpulseradiolysis”，RadiationPhysicsandChemistry，63(2002)675-679.3.LUOQin-Hui(罗勤慧).Chem.J.ChineseUniversities(高等学校化学学报)[J]，1997，18(7)1012.10184.G.BrookesandL.D.Pettit，“Thermodynamicsofcomplexformationbetweenhydrogen，copper(II)andnickel(II)ionsanddipeptidescontainingnon-co-ordinatingsustituentgroups”，J.C.S.Dalton，1975，2106-2112.5.V.Amirthlingam，K.V.Muralidharam，Pramana，1975，4，83.6.A.C.Rizzi，O.E.Piro，E.E.Castellano，O.R.Nascimento，C.D.Brondino，Inorg.Chim.Acta.，2000，305，19-27.谢英，周轩，王军波，邓希贤“铜-(N-正十二碳酰双甘肽)络合物模拟SOD的研究”高等学校化学学报，2001，22(1)67-69。8.T.Ueki，T.Ashida，V.Sasada，etal.，ActaCrystallogr.，B，1969，25，3289.T.G.Fawcett，M.Ushay，J.P.Rose，etal.，Inorg.Chem.，1979，18，327.权利要求1.一种四-(α-氨基酸或二肽)双铜配合物，其组成式为[R-CH(NH2)-COO-；R-CH(NH2)-CONH-CH(COO-)-R′]4Cu2·XH2O式中X＝0，配合物无结晶水；R和R’可分别选自C0～C14的直链烷烃、C2～C14的碳酰基或者含有羟基、硫、苯环和氮杂环的烃基。R与R’可相同或不同。2.如权利要求1所述的配合物，其晶体结构为Cu(II)离子位于分子的对称中心位置，配体R-CH(NH2)-COO-或R-CH(NH2)-CONH-CH(COO-)-R′分别以二齿形式与Cu(II)离子配位；两个Cu(II)离子通过羧基-O＝C-O-桥联，再辅以邻近配体间存在的氢键，连接成二聚体；形成的二聚体的两个“单体”互为对映异构体，呈中心对称。3.如权利要求1或2所述的无结晶水四-(α-氨基酸或二肽)双铜配合物在制备具有SOD样活性的药物中的用途，其特征在于该配合物具有清除超氧阴离子自由基的活性。4.如权利要求3所述的用途，其特征在于该配合物可抗氧化，抗衰老。5.如权利要求3所述的用途，其特征在于该配合物能够改善糖尿病症状。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于该配合物能降低糖尿病血糖水平，调节血脂紊乱，对糖尿病病人的心肾组织具有保护作用。7.一种制备如权利要求1或2所述的配合物的方法，其步骤如下将乙酸铜或碱式碳酸铜、α-氨基酸或二肽在无水乙醇或乙醚或丙酮溶解，35～80℃下回流1～14小时，进行液-固相转移反应。8.如权利要求7所述的方法，其中的乙酸铜或碱式碳酸铜与α-氨基酸或二肽的摩尔比为1.1∶2.0。全文摘要该发明是发现了一种四－(α－氨基酸或二肽)双铜配合物及其合成方法和SOD(超氧化物歧化酶)样活性，属于化学中金属有机配合物和药学中SOD模拟物
技术领域：
。该配合物是以乙酸铜和α－氨基酸或二肽为原料，在无水乙醇等有机溶剂中回流进行液－固相转移反应而得。用此合成方法所得到得无结晶水配合物是α－氨基酸或二肽以二齿形式与Cu(II)离子配位；两个Cu(II)离子主要通过羧基－O＝C－O－桥联，再辅以邻近配体间存在的氢键，连接成二聚体，组成二聚体的两个“单体”互为对映异构体，呈中心对称，结构见附图1。这种配合物与天然SOD具有类似的结构，同时也具有较高的清除超氧阴离子自由基(O文档编号A61P3/00GK1760172SQ200410086340公开日2006年4月19日申请日期2004年10月26日优先权日2004年10月26日发明者邓希贤,谢英,王军波,邓丽丽,李菲菲申请人:邓希贤,谢英,王军波,邓丽丽,李菲菲