分 钟（95°C，30秒；52°C，30秒；和72°C，1分钟），重复35次；72°C，持续10分钟。
[0242] 将引物 Eqt_F(GTR TCG ACA ACG AGT CRG G)和 Eqt_R252(TGA CAT YCC ACC AGT TGC TG)添加到反应混合物中，分别达到0. 5 μΜ最终浓度。
[0243] 为进行DNA测序，执行阳性PCR反应，获得尺寸为约250 bp的DNA扩增子。
[0244] 来自美丽海葵的PCR扩增子产生以下265 bp的序列：
[0245] GTGTCGCCAACGAGTCGGGATGCACTTGGGAAAAGCCAAATACATACTTCTTCTCTGGTACTGAGGTAT AAAGTGCCTCCCTCTAAAGCTTGAGAATAAAAAAGCTCTTTTGTACGGCCCACGTAAGACAACAGGGCCTGTTGCCA CGGGAGCTGTTGGAGTGCTCACTTACAAAATGTTGTGCACCAATGAGACGAACACTCTGGCTGTTCTTTTCAGTGTA CCCTTCGACTACAACTTGTACAGCAACTGGTGGAAATGTCAA
[0246] 利用BLASTx程序比较由上述多聚核苷酸序列编码的预计氨基酸序列与基因库 中的已知蛋白质序列，得到以下结果：一致性=54/88(61% )，正选择=62/88(70% )。 与如以下各物的其它海葵细胞毒素比较：溶血毒素[冲绳海葵（Actineria villosa)]、 PsTX_20A[叶盘海葵（Phyllodiscus semoni)]、溶细胞素 I前体[玫瑰红绿海葵（Sagartia rosea)]和等指海葵毒素 IV前体[等指海葵];(寄存编号：BAD74019. 1、BAC45007. 1、 AAP04347. 1 和 AF057028_1)。
[0247] 相关肽序列[FSVPFDYNLYSNWW]出现在垃圾葵的序列中。
[0248] 来自蛇发海葵的PCR扩增子为以下254 bp的序列：
[0249] TGTGTCGACAACGAGTCgGGCaagacgtGgaCCGCAntgaaCACATACTTCCGTTCTGGcACCTCTGAT nTCrTCCTTCCCCATACAGTTCCACATGGTAAGCCACTGCTCTACAACGGTCAGAAAGATCGTGGTCCAGTTGCGAC TGGCGtgGTTGGAGTACTTGCTTATGcCATGAGCgATGGAAACACCCtGGCCGTTTTgTTCAGCrTTCCCTaTGACT ATAACCtGTACAGCAACTGGTGGAATGTCAA
[0250] 利用BLASTn程序，将基因库中的已知核苷酸序列与等指海葵毒素5[寄存编号： AEU51900l、4「寄存编号：AF057028l和2[寄存编号：AEU416611相比较，分别得到97%、 96 %和95 %相似性。
[0251] 基于第二个正向ORF的翻译所预计的氨基酸序列得到以下氨基酸序列：
[0252] CRQRVGMHLGKAKYILLLWY*GIKCLPLKLENKKALLYGPRKTTGPVATGAVGVLTYKMLCTNETNTLA VLFSVPFDYNLYSNWffKCQ
[0253] 实例3 :比较合成肽的活性
[0254] 使用固相法合成下文所列的肽，并通过派普顿公司（Peptron Inc.)(韩国大田广 域市（Taejeon, Korea))纯化达到 90%标度（scale)。
[0255] 使用20 μ 1二甲亚砜（DMSO)溶解肽，并在双蒸水中稀释，达到5mg/ml浓度。在磷 酸盐缓冲盐水（PBS)中再进行稀释。
[0256] 研宄以下合成肽针对鲍氏不动杆菌的临床分离株和绿脓杆菌ATCC 27853的活 性，其中肽浓度在500到0. 5 μ g/ml范围内。将稀释到适宜浓度的肽与细菌一起培育24到 48小时。
[0257] 对于细菌粘附生物分析，在96孔圆底聚苯乙烯板中生长生物膜。简单点说，将 180 μ 1培育过夜的培养物添加到各孔中，这些孔补充有20 μ 1在PBS中稀释的适宜肽。在 37°C下培育24小时后，用水洗涤各孔，并用250 μ 1结晶紫溶液进行染色。随后通过用水充 分洗涤来去除染料。为进行附着细胞的定量，将结晶紫溶解于250 μ 1 1%十二烷基硫酸钠 (SDS)中，并在595nm下测量吸光度。
[0258]
[0260] 结果显示于图1到12中。如从图
1、3、5和7中可看出，这些肽不能杀死细菌或抑 制细菌生长。图2、4、6、8和10到12显示，这些肽防止生物膜形成。
[0261] 实例4 :鉴别优选肽
[0262] 为了鉴别根据本发明最具活性的环状肽，使用带有肽提纯器的手动多肽合成仪 (Parallel Peptide synthesizer)来制备长度和环化策略互不相同的肽。在微型板和流式 细胞分析中针对抗粘附活性筛选每一种肽，并选择具有较高活性的肽。使用数种肽型式的 计算机模型，来优化对活性化合物的选择。
[0263] 为了更灵敏地进行筛选，使用美国普洛麦格公司（Promega，USA)的BacTiter-Glo 微生物细胞活力分析，来按比例放大生物分析。这一方法使用了基于发光的较为灵敏的光 谱测定技术。
[0264] 使用各种环化策略，由具有令人满意的生物活性的线性类似物获得优化的环状 肽。图16A显示了带有乳化剂臂的环状头的一般结构。所述线性类似物是一种带有疏水核 心（6个氨基酸）的14 mer肽，称为药效团（pharmacophore)。制备出的环状头保存此药效 团，接着添加乳化剂臂（疏水性部分），诸如聚乙稀、聚丙稀、特氟隆（Teflon)等，以使疏水 性聚合物表面具有吸收能力（图16B)。
[0265] 使用表位定位、电子扫描（escanning)和Cycloscan法显示出具有所需生物活性 的较短、成本效益较高的肽。
[0266] 使用9H-芴-9-基甲氧基羰基固相肽合成法（Fmoc SPPS)制备环状头。
[0267] 根据代表性程序，如图17中所示，在二氯甲烷（DCM)中使用N，N_二异丙基乙胺 (DIEA)，使第一个经保护氨基酸与三苯甲基氯（Cl-Trt)树脂缩合，或使用六氟磷酸0-苯并 三唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲（HBTU)作为偶联试剂，使所述氨基酸与Rink Amide树脂缩合。
[0268] 接下来使用标准Fmoc方案，用六氟磷酸2-(1Η-7-氮杂苯并三 唑-1-基）--1，1，3, 3-四甲基脲甲铵（HATU)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基 膦（PyBoP)、DIEA在N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP)中进行偶联。使用乙酰基氢氧化物（acetyl hydroxide)/N-甲基马来酰亚胺/1,2-二氯乙烧（diethene chloride) (AcOH/NMM/DCE)混 合物，利用四（三苯膦）钯脱除烯丙氧基羰基（alloc)。
[0269] 根据标准偶联反应（在形成酰胺键的情况下）或通过鼓入氧气（在形成二硫桥键 的情况下），进行环化步骤。也可进行此项技术中已知的其它类型的环化反应。
[0270] 通过在1，2_乙二硫醇存在下（对于Cl-Trt树脂），以及在95 % TFA、TIS和 H2O存在下（对于Rink Amide树脂），用1:98:1的三氟乙酸：二氯甲烷：三异丙基硅烷 (TFA:DCM:TIS)处理，将肽从树脂裂解。
[0271] 利用制备型HPLC或MPLC纯化溶液中（Ac0H/H20,1:1)的粗产物，得到纯环状肽。 利用分析型HPLC测定纯度。借助LC-MS和AA分析确定结构。
[0272] 下一阶段涉及连接疏水性臂，以赋予环状肽头吸收特性。使用标准SPPS方案连接 这种疏水性臂。
[0273] 图17显示的流程图大致描述了开发带有乳化臂的环状肽头的过程。
[0274] 实例4 :处理水或流体介质
[0275] 可任选且优选使用上述肽和/或组合物和/或生物来处理水和/或流体介质，或 含有水和/或流体介质的系统或器械，包括（但不限于）反渗透过滤器和/或过滤器械或 系统。
[0276] 如下所述，在无过滤的流槽中，使用聚酰胺取样管测试海葵提取物对生物膜形成 的影响。在共聚焦显微镜专用的流槽中，分析生物膜生长对作为反渗透（reverse osmosis， R0)活性层的类似聚酰胺表面的影响。利用模式菌株（model strain)和从放在地中海 上所选位置的反渗透（RO)膜取样管取得的实时微生物接种物，操作补充有不同浓度（每 毫升数纳克到数微克）提取物的双通道流槽（FC 270,生物表面科技公司（Biosurface Technologies);美国蒙大拿州（Montana, USA))。在这些流槽中，流动形态是层流，这与 典型RO操作的流动状况类似。对于模式菌株，确定海水合成培养基（参看（弗雷兹曼 (Fritzmann)等人，2007:弗雷兹曼（Fritzmann，C),劳文伯格（Lowenberg，J·)，温特格 斯（Wintgens，T.)和梅林（Melin，T.) (2007)，反渗透脱盐的技术现状（State-of-the-art of reverse osmosis desalination).脱盐(Desalination)216:1-76)和 IDE 报告 http://www. ide-tech. tech, com/)，并用于细胞附着生物膜生长实验。对于从位于帕勒马 希姆（Palmachim)的脱盐工厂分离的微生物群，使用实时海水作为培养基进行微生物附 着和生物膜生长实验。所用模式菌株是费希尔氏弧菌（Vibrio fisheri)和新月柄杆菌 (Caulobacter crescentus)。在双通道流槽中，一个通道补充有提取物，另一通道用作对 照，其中只在培养基中添加溶剂（例如当将提取物溶解于乙醇中时）。
[0277] 当用焚光探针对活细胞、死细胞和细胞外聚合物质（Extra cellular polymeric substance，EPS)进行染色（使用不同的荧光标记的凝集素探查EPS中的不同多糖组分）， 并利用激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy，LSCM)观察时，在 不同时间点（为期14天的实验时间），用显微镜分析流槽生物膜。使用图像处理分析软 件，诸如Imaris bitplane和C0MSTAT，进行显微分析（海多恩（Heydorn)等人，2002:艾 斯波尔（Ersboll，B·)，卡托（Kato，J·)，汉泽尔（Hentzer，M·)，帕赛科（Parsek，M.R·)，托 勒-尼尔森（Tolker-Ni elsen，T.)等人（2002)绿脓杆菌生物膜产生的统计学分析：颤动、 细胞间信号传导和静止期δ因子表达所涉及的基因突变的影响（Statistical analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm development:impact of mutations in genes involved in twitching motility, cell-to-cell signaling, and stationary-phase sigma factor expression).应用与环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)68:2008-2017)。
[0278] 此外，使用钙特异性荧光染料，诸如Fura-2,借助LSCM也监测和观察到钙，其 对生物膜粘附性和致密性具有显著影响（格尼克维兹（Grynkiewicz)等人，1985:格 尼克维兹（Grynkiewicz, G.)，鲍尼（Poenie, M.)和泰森（Tsien, R. Y.) (1985)焚光 特性极大改良的新一代 Ca2+指不剂（A new generation of Ca2+indicators with greatly improved fluorescence properties).生物化学杂志（Journal of Biological Chemistry)260:3440-3450;尼奥（Neu)等人，2002:尼奥（Neu，T.R·)，库汗林克 (Kuhlicke，U.)和劳伦斯（Lawrence，J.R.) (2002)荧光染料在针对生物膜的双光子激光 扫描显微术中的作用的评估（Assessment of Fluorochromes for Two-Photon Laser Scanning Microscopy of Biofilms)·应用与环境微生物学（Applied and Environmental Microbiology)68:901-909)。
[0279] 也通过用共价键接不同肽的QCM-D表面改性晶体分析不同类型EPC/细菌的粘附 性，以此检验防污特性。
[0280] QCM-D使用了一种超敏感的质量传感器（涂有二氧化硅的石英晶体），传感器的内 部装有呈预定几何形状且具有预定流体动力学特征的流槽，这一设计允许实时监测质量吸 收，而无需进行标记。当向固定于压电石英晶体的电极施加电压时，石英晶体发生侧向振 荡，振幅为1到2nm。当晶体表面上发生沉积（吸收）时，将使晶体的振动频率发生偏移。 除监测频率偏移来确定吸收质量外，还可通过同时监测散逸的能量（即，每一振荡周期系 统内所有能量损失的总和），来获得吸收层的厚度和结构构象。有趣的是，QCM-D除了在不 同环境条件（即，二价阳离子浓度不同）下测量不同类型EPS (即，多糖/蛋白质含量不同） 的吸收和粘附性外，还能展现沉淀纳米层的粘弹性、构象改变和厚度。
[0281] 实例5 :在脱盐条件下活性肽对反渗透生物污损的影响
[0282] 确定在脱盐条件下海葵提取物对反渗透生物污损的影响。
[0283] 操作两个实验室规模的RO (反渗透）单元以使海水脱盐，并在合成海水培养基和 实时海水中进行利用候选模式菌株以及从GES脱盐工厂分离的微生物群（如上文所述）的 生物污损实验。使用市面上的平板膜SW-30型Dow-Filmtec进行这些生物污损实验。得到 各处理条件下的特定测量结果：渗透通量、总有机碳（total organic carbon，T0C)、渗透液 中和盐水溶液中的氧浓度、摄氧率以及膜对不同离子和阳离子的排斥作用。分析不同生物 膜组分：生物污损层的化学分析包括对蛋白质、碳水化合物、脂质和DNA的表征。如上文所 述进行显微镜观察和分析。
[0284] 尽管已经参照少数几个实施例描述了本发明，但应了解，可对本发明进行许多变 更、修改和其它应用。
【主权项】
1. 一种肽，其包括选自由以下组成的群组的序列：YDYNWY(SEQ ID No. 1)，YDYNLY(SEQ ID No. 2)，FDYNFY(SEQ ID No. 3)，FDYNLY(SEQ ID No. 4)，WDYNLY(SEQ ID No. 8)，FDYNWY(SEQ ID No. 5), YDffNLY (SEQ ID No. 6), and YDffHLY (SEQ ID No. 7) 〇
【专利摘要】本发明涉及用于防止细胞粘附的肽和组合物及其使用方法。本发明提供包含经分离肽的组合物，所述肽可从诸如水生生物和藓类植物(moss)等生物提取，且例如任选包含选自由以下组成的群组的序列：YDYNWY、YDYNLY、FDYNFY、FDYNLY、FDYNWY、YDWNLY、YDWHLY和WDYNLY，或本文中描述的任何其它序列；以及其使用方法，包括用于处理微生物生物膜或防止形成微生物生物膜以及防止细胞粘附于表面。
【IPC分类】C07K7/06
【公开号】CN104892728
【申请号】CN201510209329
【发明人】阿米尔·兹洛特金, 亨·凯斯滕博伊姆
【申请人】特尔哈肖梅尔医学研究基础设施和服务有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2009年9月23日
【公告号】CA2737682A1, CN102171239A, EP2344521A2, EP2789626A2, EP2789626A3, US9029318, US20110280920, US20150315253, WO2010035107A2, WO2010035107A3, WO2010035107A9