专利名称：提高肾素抑制剂生物利用度的方法
提高肾素抑制剂生物利用度的方法
口服途径通常是最方便的药物施用途径，但不幸的是4艮多治疗剂由于 其生物利用度差而口服无效。
很多治疗剂的生物利用度由于所谓的"外排泵"蛋白的作用而降低， 该"外排泵"蛋白可主动地从细胞中排出外来物质而引起例如多药耐药效
应。这些药物外排蛋白主要包括MDR(多药耐药蛋白)和MRP(多药耐药相 关蛋白)类型的转运蛋白。 一些进行过最佳研究的外排蛋白包括P-糖蛋白 (Pgp或MDR1)和MRP2。
尽管存在于膜的外排蛋白众所周知是导致^f艮多癌症患者重复化疗后产 生的后天多药耐药综合症的因素，但仅仅在近期才在例如小肠、结肠、肝 等正常组织中和血脑屏障的内皮细胞中发现了例如MDR1 。这类外排蛋白 在胃肠(GI)道、特别是在小肠和结肠的存在，可导致很多天然产物药物(包 括抗癌剂长春喊和多柔比星)差的生物利用度。例如，很多化疗剂在口服时 由于差的生物利用度和无法进入GI组织而不能表现出抗巧瘤活性。此外， 存在于肝细胞的外排蛋白可另外通过经胆汁的消除而降低治疗剂的生物利 用度(参见Faber等人，Adv. Drug Del. Rev.， 55， 107-124， 2003)。
口服施用的治疗剂在到达乾点前必须克服多个屏障。要通过的第 一个 主要障碍是肠上皮细胞。尽管亲脂性化合物能容易地扩散通过顶端质膜， 但无法保证随后通过基底外侧膜并^门静脉血液。位于顶膜的外排泵蛋 白包含多种ATP-结合盒(ABC)家族的药物转运蛋白例如ABC转运蛋白诸 如MDR1、 MRP1和MRP2，所述外排泵蛋白可将化合物从细胞内运送回 肠腔中，通过阻止其吸收进血液中而限制它们的口服生物利用度。要面对 的第二个主要障碍是肝，药物在此被被动转运或通过可饱和转运过程从门 静脉血液通过肝细胞质(血窦)膜和胆(小管)膜进入胆汁。位于小管细胞膜的外排泵蛋白也包含多种ABC家族药物转运蛋白，例如ABC转运蛋白，诸 如MDR1、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和MRP2等，所述外排泵蛋白可将药 物化合物从肝细胞内转运到胆汁中，通过促进胆汁消除来限制它们的口服 生物利用度。例如，已证实MDR1转运大多数HIV蛋白酶抑制剂并降低 它们的口服生物利用度以及淋巴细胞、脑、睾丸和胎的穿透，可能对这些 药物治疗有效性产生主要的限制作用。
因此，提高生物利用度的一种方法可以是将外排蛋白抑制剂即抑制外 排蛋白功能的化合物与药物物质共同施用。换言之，当将外排蛋白抑制剂 与治疗剂(其也是该特异性外排系统的底物)共同施用时，可通过抑制从细
的口服生物利用度和/或在乾点的药理活性浓度。
但是，外排蛋白呈现低的底物特异性，并且转运多种分子。该特异性 未被精确了解，并且没有办法通过药物物质的分子结构来预测特定药物是 否为某种转运蛋白的底物。因此， 一般无法预测一种特定药物或化合物是 否受以上讨论的外排泵作用的影响。并且，如果一种特定药物具有低的口 服生物利用度， 一般无法预测该低的生物利用度是否全部或部分由以上讨 论的外排蛋白引起，也无法预测是否能通过共同施用外排蛋白抑制剂来提 高低的生物利用度(参见Chan等人，Eur. J. Pharmaceut. Sci.， 21, 25-51， 2004)。
在WO 2006/013094中公开了肾素抑制剂如阿利吉仑与称作MDR1抑 制剂PSC833的外排蛋白抑制剂的应用。
尽管这项发现具有优势，但对用于增强肾素抑制剂生物利用度的改善 的且简单的系统仍有持续的需求。
令人惊奇的是，已经发现不仅通过药理活性底物例如在WO 2006/013094中所公开的那些，而且通过包括GRAS化合物和赋形剂的非 药理活性化合物的使用，可以显著改善多种肾素抑制剂(例如在美国专利 5,559,111、 6,197,959和6,376,672中所^Hf的那些)的生物利用度并且可以 减少个体间和个体内的差异，所述非药理活性化合物是与肾素抑制剂联用
7的MDR1抑制剂。
因此，本发明涉及药物组合物，其包括
(i) 肾素抑制剂和
(ii) 选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂。
相应地，本发明还提供了提高肾素抑制剂的生物利用度、优选提高口 服生物利用度的方法，该方法包括对需要这类治疗的哺乳动物、特别是人 共同施用肾素抑制剂和选自包括GRAS化合物和赋形剂的非药理活性化合 物、特别是GRAS化合物的MDR1抑制剂的组合。以一定量施用非药理 活性化合物以使肾素抑制剂的生物利用度与不存在选自非药理活性化合物 的MDR1抑制剂时的生物利用度(例如对人口服施用时为10%)相比得到提 高。选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂和肾素抑制剂优选各自以一定 的量共同施用以使该组合具有所需的治疗作用，例如抗高血压作用。
特别地，本发明提供了提高5-氨基个羟基-co-芳基-链烷酸衍生物的生 物利用度的方法，该方法包括对于需要这类治疗的哺乳动物、特别是人共 同施用8-氨基个羟基-co-芳基-链烷酸衍生物或其可药用盐与选自非药理活 性4匕合物的MDR1抑制剂的组合。
图1显示肾素抑制剂阿利吉仑对于表达高水平的MDR1的膜小泡内 ATP酶活性的影响。
图2显示肾素抑制剂阿利吉仑通过Caco-2单层细胞在顶部(AP)至底端 (BL)方向和BL至AP方向的双向转运。
用于肾素抑制剂、特别是8-氨基-y-羟基-co-芳基-链烷酸衍生物与选自 非药理活性化合物的MDR1抑制剂组合的术语"共同施用"，是指这两种 成分可作为药物组合物或作为同一单一剂型的一部分而一起施用。共同施 用还包括分别地、但作为同一治疗方案的一部分来施用肾素抑制剂、特别 是5-氨基个羟基-co-芳基-链烷酸衍生物和选自非药理活性化合物的MDR1 抑制剂。如果分别施用，这两种成分不必一定在基本上相同的时间施用， 尽管如果需要这样也可以。因此，共同施用包括，例如将肾素抑制剂、特 别是S-氨基个羟基-co-芳基-链烷酸衍生物和选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂以单独的剂量或剂型在相同的时间施用。共同施用也还包括 在不同时间和以任意顺序分别地施用。
因此可用作药物的抑制剂，例如作为治疗高血压、充血性心力衰竭、心脏 肥大、心脏纤维化、梗塞后心肌病、糖尿病引起的并发症如肾病、血管病 和神经病、冠状动脉疾病、血管成形术后的再狭窄、眼内压升高、青光眼、 异常血管增生、醛固酮过多症、焦虑状态和认知障碍的治疗剂。本发明特 别涉及在美国专利5,559,111中公开的3-^J^r-羟基-w-芳基-链烷酸酰胺衍 生物。
本发明的肾素抑制剂、特别是5-氨基卞羟基-co-芳基-链烷酸衍生物可 以以其可药用盐的形式、无水物形式或水合物形式或溶剂化物形式使用。 所有这些形式均可用于本发明的范围之内。
优选使用本发明的具有式(I)结构的3-氨基个羟基-co-芳基-链烷酸衍生 物或其可药用盐
其中R,为Cj-4烷氧基-C"4烷氧基或C,—4烷氧基-d-4烷基；R2为C,-4烷基
或Ci4烷氧基；并且R3和R4独立地是支链Q-4烷基。
更优选使用本发明的具有式(I)结构的3-氨基个羟基-co-芳基-链烷酸衍 生物或其可药用盐，其中R,为3-曱氧基丙氧基；R2为甲氧基；并且R3和 R4为异丙基；最优选使用的本发明的5-氨基个羟基-w-芳基-链烷酸衍生物 是(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙基-7-4-甲氧基-3-(3-甲氧基-丙氧基)-苄基1-8-甲基-壬酸(2-氨基曱酰基-2-曱基-丙基)-酰胺半富马酸盐，也称为阿 利吉仑。
本文所用的术语"MDR1抑制剂"旨在包括外排蛋白抑制剂，即多药 耐药蛋白类转运蛋白抑制剂。本文所用的术语"外排蛋白抑制剂"是指抑
9制ABC转运蛋白的作用的任意化合物、药物或赋形剂化合物，例如，在 Bakos等人，Mo/尸/mr附""/" 57， 760-768 (2002)和Maarten等人，^/AS, 16， 2295-2301 (2002)中所公开的那些。另外的关于外排蛋白抑制剂的信息可以 在WO 2006/013094中找到。
本文所用的术语"非药理活性化合物"依据EMEA指南所定义为以 包含其的药用产品的形式，在将其施用于靶标例如包括人的哺乳动物的剂 量时没有药效活性的化合物，但当将其以不同浓度混合于其他产品时，其 可能具有药理作用。
因此在本发明使用时，选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂不具有 其它药理活性而只具有MDR1抑制作用。
本文所使用的术语"GRAS化合物"是卫生主管机构，特别是FDA通 常使用的术语，是公认安全的简称。它是对常规食品特别指定的监管的类 别。常规食品中所添加的成分必须是被批准的食品添加剂或是GRAS，这 两类都确保有"合理确定，，的安全性。 一般而言，GRAS化合物是无毒的 且本身无药理活性。在本文，术语"非药理活性，，是指GRAS化合物自身， 至少以它们祐 使用的剂量和浓度，不会治愈或减少疾病或医学状况的症状。
在1958年(将食品添加剂修正案加入联邦食品、药品及化妆品法案 (FFI)CA)中)前在食品中通常使用的成分自动是GRAS，对于就其而言存在 关于安全性的相关科学共识的物质是同样的。
在1997，提出了一项GRAS自我确认通知程序；虽然它尚未定案，但 对于认可的行业FDA在该条例的支持下进行操作。现在，GRAS程序基本 上是独立的程序，其具有与食品添加剂相同的安全性要求，但不需要FDA 批准。在自我确认程序中，各公司收集支持化合物安全使用的科学论证和 历史文献的详尽的材料汇编。由于"公认，，的要求，用于安全性论汪的关 键数据必须是/〉众领域的一部分。在评审程序中，各公司限定有关物质的 具体的食品类别以及这些类别的应用水平。由专家组做出的最终决定包括 用提供"合理确认"的安全性的数据评审有关所述成分用于其预期应用的 安全性的技术证据和有关所述成分安全性的常规知识。卫生主管机构定期出版GRAS化合物名录。
依据EMEA指南本文所使用的术语"赋形剂"定义为除活性成分之外 的药物形式或药用产品的成分。因此，赋形剂是用作药用产品的活性成分 载体的非活性成分。赋形剂可以用来辅助药用产品的制造过程，并通过使
其形成适合的形式或增加成分使得可具有便利和精确的剂量以使药用产品 易于施用。
适于本发明药物组合物的非药理活性的化合物可以是任何作为MDR1 抑制剂的非药理活性的化合物。优选的非药理活性化合物是作为MDR1抑 制剂GRAS化合物和赋形剂。
典型地，作为MDR1抑制剂的GRAS化合物非限制性的实例包括
姜黄素
OCH
芽菜脑
11佛手柑素<formula>formula see original document page 12</formula>
8-(癸硫基-)咖啡因 8_千基咖啡因
焦碳酸二乙酯 桑色素
〇H 芸香柚皮苷
胡冲减槲皮素
OH O'々.
OH
xH20
HO
、o
* 丄
OH
、-
OH
斯拉韦素(Slavironin)
水飞蓟宾 可可碱
香草醛
、〇CH3 OH
和香草基-N-nonlymine。
通常，作为MDRl抑制剂的赋形剂的非限制性实例包括表面活性剂、 特别是非离子型表面活性剂，如以下所列
1) 天然或氢化蓖麻油与环氧乙烷的反应产物
天然或氢化蓖麻油可以与环氧乙烷以从约1:35至约1:60的摩尔比反 应，任选地从产物中除去聚乙二醇成分。各种此类表面活性剂商购可得。 特别适合的表面活性剂包括聚乙二醇-氢化蓖麻油类，商品名为 Cremophor ; Cremophor RH 40，其急化值约为50至60,酸值约小于 1，含水量(Fischer)约少于2%， 1106()约为1.453至1.457，且HLB大约为14至16;和Cremophor⑧RH60，其急化值约为40至50,酸值约小于1， 碘值约小于1，含水量(Fischer)约为4.5至5.5%， 1106(}约为1.453至1.457， 且HLB约为15至17。
尤其优选的这类产品是Cremophor RH40。其它可用的此类产品可 以商品名Nikkol (例如Nikkol HCO-40和HCO-60)、 Mapeg (如 Mapcg C()-40h)、 Incrocas (例如Incrocas 40)、 Tagat (例如聚氧乙 烯-甘油-脂肪酸酯，例如Tagat RH 40)和Simulsol OL-50 (PEG-40蓖麻 油，其皂化值约为55至65，酸值的最大值为2，石維为25至35，含水量 最大值为8。/。，HLB约为13，可得自Seppic)得到。这些表面活性剂在Fiedler /w. "Y.loc. cit..中有进一步描述。
其它适合的这类表面活性剂包括聚乙二醇蓖麻油类如以商品名 Cremophor EL可得的物质，其分子量为(通过蒸气渗透压测定法)约为 1630，皂化值约为65至70，酸值约为2，》維约为28至32，且11025约为 1.471。
2) 聚氧乙烯-山梨糖醇酐-脂肪酸酯类
这类包括例如类型已知的且以商品名Tween (Fiedler, /oc. loc. cit. 自第1615页始)从Uniqema商购可得的单-和三-月桂酰、棕榈酰、硬脂酰 和油酰酯类，包括以下产品
Tween 20 [聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯j， Tween 21 [聚氧乙烯(4)山梨糖醇酐单月桂酸酯]， Tween 40 [聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯j， Tween 60 [聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单硬脂酸酯， Tween 聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三硬脂酸酯]， Tween 80聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯J， Tween 81 [聚氧乙烯(5)山梨糖醇酐单油酸酯和 Tween 8聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐三油酸酯j。
尤其优选的这类产品是Tween 20和Tween 80。
3) 聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和嵌段共聚物或泊洛沙姆类
14这类包括，例如类型已知的且以商品名Pluronic⑧和Emkalyx (Fiedler,/oc. d,.loc. cit., 2,第1203页)商购可得的产品。尤其优选的这类产 品是BASF的Pluronic F68 (泊洛沙姆188)，其熔点约为52°C且分子量 约为6800至8975。
4) 饱和C^至C^的聚氧乙烯单酯类
这类包括例如取代的ds脂肪酸、例如羟基取代的ds脂肪酸、例如 12-羟基^J旨酸PEG酯，例如其中PEG的分子量约为例如600-900道尔顿、 例如660道尔顿，例如可得自德国路德维希港BASF的Solutol HS 15。
依据BASF的4支术资料MEF 151E (1986)包含以重量计约70%的聚乙 氧基化12-羟基硬脂酸酯和以重量计约30%的未酯化的聚乙二醇成分。 Solutol HS 15的氢化值是90至110，皂化值是53至63，酸值的最大值是 1,最大含水量以重量计是0.5%。
5) 水溶性的生育酚聚乙二醇琥珀酸酯类(TPGS) 这类包括例如聚合量约1000的那些，例如可得自美国德克萨斯州
Eastman Fine Chemicals Kingsport。
6) 酯交换的，聚氧乙基化的辛-癸酸甘油酯类
这类包括例如以商品名Labrasol⑧从例如Gattefoss6商购可得的那些。 Labraso隨的酸值的最大值为1，急化值为90-110，且碘值的最大值为l(H. Fiedler, /oc. dloc. eit.,第2巻，第880页)。
在这些非离子表面活性剂中，以下是特别优选的维生素ETPGS、 聚氧乙烯醚(35)蓖麻油(Cremophor EL)、聚氧乙烯醚(40)氢化蓖麻油 (Cr画phor RH40)、聚山梨酯80 (Polysorbat 80)、 Solutol HS15、普流罗 尼克F68 (Pluronic F68)、 Labrasol。
在这些非药理活性化合物中，以下是特别优选的姜黄素、维生素E TPGS、胡4喊、香豆素和肉桂酸苯酯。
令人惊奇的是，这些化合物当与肾素抑制剂如阿利吉仑共同施用时可 以显著地增加该化合物的生物利用度且个体间和个体内的差异性降低。由 于生物利用度的增加，可以显著地减少药物物质的量，并因而减少每剂药
15品的费用。另外，因为这些MDR1抑制剂被界定为无毒和非药理活性的， 所以不需要为卫生主管机构的批准而进行大量的研究。相反，这些非药理 活性化合物将仅被认为是赋形剂且这可以进一步减少开发时间和费用。
如以上所公开，可将肾素抑制剂、特别是5-氨基-y-羟基-co-芳基-链烷 酸衍生物和选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂作为药物组合物共同 施用。这些成分可以以任何常规剂型一起施用，通常也可与可药用载体或 稀释剂 一起施用。
对于口服施用而言，包含肾素抑制剂、特别是8-氨基个羟基-co-芳基-链烷酸衍生物和选自非药理活性化合物的 MDR1抑制剂的药物组合物可 采用溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶嚢剂、散剂、微乳剂、单剂量药包 等形式。优选为片剂和明胶胶嚢，其包含活性成分和a)稀释剂，例如乳糖、 葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二 氧化硅、滑石粉、硬脂酸及其镁盐或钩盐和/或聚乙二醇；对于片剂还有c) 粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤 维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、海藻 酸或其钠盐，或泡腾混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。 可注射组合物优选为等渗水溶液剂或混悬剂，并且有利地是由脂肪乳液或 混悬液来制备栓剂。
所述组合物可以是灭菌的和/或含有辅助剂，如防腐剂、稳定剂、润湿 剂或乳化剂、增溶剂、味道掩蔽剂、调节渗透压的盐和/或緩冲剂。另外， 它们也可包含其他有治疗价值的物质。可按照常规的混合、制粒或包衣方 法分别制备上述组合物，并且其含有约0.1-75%、优选约1-50%的活性成 分。
更具体而言，本发明提供了包含治疗有效量的肾素抑制剂、优选8-氨 基卞羟基-to-芳基-链烷酸衍生物和选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂 的药物组合物，所述选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂优选以一定的 量存在以在施用后使肾素抑制剂的生物利用度提高至少5% 。
本发明的药物组合物优选包含式(I)所示的S-氨基-，羟基-co-芳基-链烷酸衍生物或其可药用盐和选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂，
其中R,为d-4烷氧基-d-4烷氧基或Q-4烷氧基-C,-4烷基；R2为Q-4烷基
或C^烷氧基；并且R3和R4独立地是支链C,-4烷基。
本发明的药物组合物更优选包含式(I)所示的3-氨基-y-羟基-co-芳基-链 烷酸衍生物或其可药用盐和选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂，其中 R,为3-甲氧基丙氧基；R2为甲氧基；且R3和R4为异丙基。
本发明的药物组合物最优选包含(2S，4S，5S,7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙 基_7_[4-甲氧基-3-(3-曱氧基-丙氧基)-苄基-8-曱基-壬酸(2-氨基甲酰基-2-曱 基-丙基)-酰胺半富马酸盐和选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂。
优选将肾素抑制剂特别是S-氨基-y-羟基-co-芳基-链烷酸衍生物例如阿 利吉仑、或其可药用盐的生物利用度提高至少5%。
按照本领域已知的方式通过测定AUC来评价药物生物利用度，其中 AUC是沿纵轴(Y轴)的血清或血浆药物浓度相对于沿横轴(X轴)的时间作 出的曲线下面积(AUC)。通常，AUC值表示取自受试群体的所有对象的多 个值并因此是整个测试人群的平均值。
相对于在不存在外排蛋白抑制剂的情况下施用肾素抑制剂，共同施用 肾素抑制剂和选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂也可增加Cmax，这是 本发明提供的另 一方面。Cmax作为测试对象血清或血浆中的最大药物浓度 的缩写在本领域也是众所周知的。
因为本发明具有涉及利用可分别进行共同施用的化合物的组合来治疗 的方面，本发明还涉及以药盒形式组合单独的各药物组合物。该药盒包含 两种单独的药物组合物(l)包含肾素抑制剂特别是8-氨基个羟基-o)-芳基-链烷酸衍生物和可药用载体或稀释剂的组合物；和(2)包含选自非药理活性 化合物的MDR1抑制剂和可药用载体或稀释剂的组合物。(1)和(2)的量在分别共同施用时可将肾素抑制剂、特别是8-氨基个羟基-0)-芳基-链烷酸衍
生物的生物利用度提高至少5%。药盒包含如分离的瓶或分离的箔包装这 样的装有单独的组合物的容器，其中每个隔室含有包含(1)或(2)的多个剂型 (例如片剂)。或者，不同于分开含有活性成分的剂型，药盒可包含分离的 隔室，每个隔室含有一个完整的剂量，所述完整的剂量包含各单独的剂型。 这种类型的药盒的一个实例是泡罩包装，其中每个独立的泡罩含有两片(或 更多片)的片剂， 一片(或多片)片剂含有药物组合物(l)，第二片(或多片)含 有药物组合物(2)。通常该药盒包含各单独的成分施用的说明。当各单独的 成分优选以不同剂型施用(例如，口服和非胃肠道)、以不同剂量间隔施用 或者当需要由处方医生滴定组合中的各单个成分时，药盒形式特别有利。 在这样的情况下本发明的药盒因而包含
(1) 治疗有效量的包含肾素抑制剂、特别是S-氨基个羟基-co-芳基-链 烷酸衍生物例如阿利吉仑、或其可药用盐、和可药用载体或稀释剂的组合 物，为第1剂型；
(2) 包含一定量的选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂和可药用载 体或稀释剂的组合物，上述剂量在施用后可将肾素抑制剂特别是S-氨基-，
羟基-O)-芳基-链烷酸衍生物例如阿利吉仑、或其可药用盐的生物利用度提 高至少5%，为第2剂型；和
(3) 用于装所述的第l剂型和第2剂型的容器。
最后，本发明涉及选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂用于制备提 高肾素抑制剂、优选S-氨基个羟基-(o-芳基-链烷酸衍生物例如阿利吉仑、 或其可药用盐的生物利用度、优选口服生物利用度的药物的用途。
使用本领域已知的方法例如使用表达高水平的所选ABC转运蛋白的 Sf9 (草地夜蛾)膜小泡进行的ATP酶试验可鉴别参与药物物质外排的外排 蛋白，并可确定相关的动力学参数，即，Michaelis-Menten常数和最大药 物转运系数(Km和Jmax)。在该试验中，ABC转运蛋白利用ATP水解作为 能源将底物转运出细胞。ATP水解产生可通过简单的比色反应检测的无机 磷酸盐(Pi)。转运蛋白释放的Pi量与转运蛋白的活性成正比。包含ABC转
18运蛋白的膜制备物显示了随不同转运蛋白而变化的基线ATP酶活性。被转 运的底物增加了基线ATP酶活性，而抑制剂抑制了有刺激剂存在时所测定 的基线ATP酶活性和/或ATP酶活性。激活和抑制研究都可进行。如本文 实施例1 (图l)所说明，阿利吉仑增加了在表达高水平MDR1的膜小泡中 的ATP酶活性，Km值约为3 nM，提示在阿利吉仑转运中参与的外排系统 可能是MDR1。
或者，在体外药物物质对转运蛋白的亲合力可通过Caco-2细胞试验来 确定和估算，例如Camenisch等人在Pharm. Act. Helv. 71， 309-327 (1996) 中所述或如在本文实施例中所说明的。转运蛋白的鉴别和化合物抑制参与 的外排系统的有效性也可在Caco-2细胞试验中得到确定。例如，阿利吉仑 被鉴别为低到中等的可通透化合物(内在透性< 80%)，另外为主要的外排系 统的底物(图2)。
上述描述充分公开了包括其优选实施方案的本发明。对本文具体公开 的实施方案的变化和改进在以下权利要求的范围内。无需更详细说明，相 信本领域技术人员能够使用前面的描述来最大程度地利用本发明。因此， 本文的实施例是仅仅用作说明的，并没有以任何方式对本发明的范围进行限制。
实施例1: ATP酶试验
通过在pH7.4、 37。C的转运緩冲液中、在不同的药物物质浓度[0.046、 ()丄T7、 0.41、 1.23、 3.7、 11.1、 33.3及100 pm下，通过在有和没有刺激剂 (40 nm维拉帕米用于MDR1)时孵育纯化的膜小泡来测定由人MDR1介导
的外排。
可在常用的有机溶剂例如二甲亚砜、乙醇、曱醇及乙腈中制备感兴趣 的治疗剂的5 mM储备液，将储备液或它的稀释液加入到测定混合物中以 产生上述的最终浓度，并且使用的有机溶剂为总体积的2% (v/v)。在该测 定中使用的所有溶液保持在pH 7.4。
19将保持在-80'C的膜小泡用于ATP酶试验。转运蛋白介导的外排可如 文献(Sarkadi， B， Price, E. Boucher, R. Germann， U.和Scarborough, G. J. Biol. Chem. 1992, 267: 4854-4858)所述来确定。简单地说，在有和没有测试 药物、刺激剂、60 mM Na3V04和2 mM谷胱甘肽(仅用于MRP1和MRP2 转运蛋白)的情况下将膜悬浮液移入96孔板并转移至37。C预孵育5分钟。 通过加入25 mM Mg-ATP溶液然后在37。C酵育(MDR1为20分钟、MRP1 为60分钟、MRP2为30分钟)来开始ATP酶反应。然后，通过加入SDS (5%) 至每个培养物来停止ATP酶反应。添加钼酸铵/醋酸锌比色检测试剂后， 将板在37-C再孵育25分钟。
孵育后在730 nm测定OD。利用事先测定的磷酸盐标准曲线可以计算 出释放的Pi [nmol/孔j。 OD值将以所完成试验的平均值±标准偏差(n = 2) 来表示。4吏用Microsoft EXCEL 5.0c完成所有统计分析。
为了计算对每种药物和测定药物浓度的所谓特异性(Na3V04敏感的) 转运蛋白ATP酶的活性，必须从没有Na3V04时测定的Pi值中减去有 Na3V04存在的Pi值。以释放的Pi/mg膜蛋白/分钟表示的Na3V04敏感性 转运蛋白活性可通过将该数值除以加入每个孔中的膜蛋白的量及以分钟为 单位的孵育时间来确定(图1)。
实施例2: Cac()-2细胞试验
将在PET滤器生长21 25天的Caco-2单层细胞用于该转运试验。通过在 PET滤器上生长的Caco-2单层细胞的化合物的通量与通过没有Caco-2细胞 的单独的PET滤器的化合物的通量用如下方法进行确定在进行转运试验 之前，用在37。C预孵育的接受溶液(HBSS，当相应时包含感兴趣的抑制剂) 代替接受室的培养基(0.2mL用于顶端，1.0mL用于底端)。开始试验，用 在37°C预孵育的供体溶液(在HBSS中的化合物，当相应时包含感兴趣的抑 制剂)代替供体室的培养基(0.35mL用于顶端，1.15mL用于底端)。在约l
20分钟及120分钟后从供体侧和接受侧取出150 fiL的等分试样。在顶端至底端 方向和底端至顶端方向的转运试验都在37。C无振摇的孵育箱中进行3次。
为3个)中在120分钟内《0.1 nM的卩H-甘露醇和幼.1 nM的卩H普萘洛尔由 顶端侧至底端的通透性，检查Caco-2细胞对于转运试验的适用性。
通过液体闪烁计数来分析放射活性样品。将所有其他的非放射性标记 样品在-2(TC冷冻直到用液相色谱/质谱联用法(LC-MS/MS)进行分析。
利用以下公式(Artursson等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 175:
880-885， 1991)来确定检测化合物的转运值
<formula>formula see original document page 21</formula>
其中Papp (cm/分钟)为表观通透性系数，AQ为t时间在接受室中测定的化合 物的量，At(分钟)为孵育时间，CoOig/mL)为在供体室的化合物的初始浓 度，并且A (cm"为膜的表面积。
对于标记的样品，将定量限(LOQ)作为由放射性大小得到的最低样品 浓度值，其显著地高于测量的空白值并且对于其的测量标准差低于20%。 在^研究的条件下，对于l"Cj标记的阿利吉仑的绝对方丈射活性的L()Q为2 dpm，相当于12nmol/L。
Papp值以所进行的转运试验的平均值±标准偏差(n =3)表示。任意两个 给出的数据组之间的差别的统计学意义通过t检验进行检查。显著差别的概 率水平规定为p < 0.025。使用Microsoft EXCEL 5.0c完成所有统计分析。
对于浓度为l ^M的阿利吉仑，在120分钟的时间段内可检测到约0.2x 10—Scm/分钟的由顶端至底端的转运。另一方面，底端至顶端的转运的通透 值约为10x 10—Scm/分钟，其显著地高于顶端至底端的转运。
对于浓度为l、 5、 10及50nM的阿利吉仑观察到了由顶端至底端的转 运逐渐增加，在10 ^M时接近约7 x 10-Scm/分钟的稳态通透值。另一方面， 由底端至顶端的转运随着浓度的增加没有显著的改变。
阿利吉仑的Caco-2转运的回收值(1、 5、 10及50 jiM)普遍很高(〈100%), 表明阿利吉仑不与滤器支持物或塑料的孵育装置结合。细胞旁标记物甘露醇和跨细胞标记物普萘洛尔的由顶端至底端的通量
通常分别低于阈值Papp值3 x l(T5 cm/分钟和卯x 10-5 cm/分钟。确定的顶 端至底端的过滤通透性普遍高于相应的Caco-2通透性数据，表明过滤扩散 对于Caco-2转运来说不是速率限制步骤(图2)。
权利要求
1.药物组合物，其包含(i)肾素抑制剂和(ii)选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂。
2. 依据权利要求1的药物组合物，其中非药理活性化合物是 GRAS化合物或赋形剂。
3. 依据权利要求1的药物组合物，其中非药理活性化合物是 选自姜黄素、肉桂酸苯酯、香豆素、肉桂酸j5-香树素酯、芹菜脑、 佛手柑素、咖啡因、8-(癸硫基)-咖啡因、8-苄基-咖啡因、焦碳酸二 乙酯、桑色素、柚皮芸香苷、胡椒碱、槲皮素、斯拉韦素、水飞 蓟宾、可可碱、香草醛和香草基-N-nonlymine的GRAS化合物，或 者是选自包括维生素E TPGS和CremophorEL的非离子型表面活 性剂的赋形剂。
4. 依据权利要求1至3中任意一项的药物组合物，其中非药 理活性化合物是姜黄素、维生素ETPGS、胡椒碱、香豆素和肉桂 酸苯酯。
5. 依据以上权利要求中任意一项的药物组合物，其中肾素抑 制剂是S-氨基i-羟基-(o-芳基-链烷酸酰胺衍生物或其可药用盐。
6. 依据权利要求4的药物组合物，其中3-氨基-"羟基-(o-芳 基-链烷酸酰胺衍生物是式(I)化合物或其可药用盐其中R,是C"4烷氧基-C，.4烷氧基或4烷氧基-d.4烷基；R2是 d—4烷基或d—4烷氧基；且R3和Rt独立地是支链d-4烷基。
7. 依据权利要求5或6的药物组合物，其中S-氨基-y-羟基-to-芳基-链烷酸酰胺衍生物是式(I)化合物或其可药用盐，其中R, 是3-甲氧基丙氧基；R2是曱氧基；且R3和R4是异丙基。
8. 依据权利要求7的药物組合物，其中8-氨基i-羟基-co-芳 基-链烷酸酰胺衍生物是(2S,4S，5S,7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙基-7-[4-曱 氧基-3-(3-曱氧基-丙氧基)-节基卜S-曱基-壬酸(2-氨基甲酰基-2-曱基-丙基)-酰胺半富马酸盐。
9. 提高肾素抑制剂生物利用度的方法，该方法包括对需要这类治疗 的哺乳动物共同施用肾素抑制剂和选自非药理活性化合物的MDR1抑制 剂的组合。
10. 依据权利要求9的方法，其中非药理活性化合物是选自姜 黄素、肉桂酸苯酯、香豆素、肉桂酸j3-香树素酯、芽菜脑、佛手 柑素、咖啡因、8-(癸硫基)-咖啡因、8-节基-咖啡因、焦碳酸二乙酯、 桑色素、柚皮芸香苷、胡椒碱、槲皮素、斯拉韦素、水飞蓟宾、 可可碱、香草醛和香草基-N-nonlymine的GRAS化合物，或者是选 自包括维生素E TPGS和CremophorEL的非离子型表面活性剂的 赋形剂。依据权利要求9或10的方法，其中非药理活性化合物是姜黄 素、维生素ETPGS、胡椒碱、香豆素和肉桂酸苯酯。
11. 依据权利要求9至11中任意一项的方法，其中肾素抑制 剂是S-氨基-Y-羟基-(o-芳基-链烷酸酰胺衍生物或其可药用盐。
12. 依据权利要求12的方法，其中S-氨基-"羟基-co-芳基-链 烷酸酰胺衍生物是式(I)化合物或其可药用盐其中R,是d.4烷氧基-C,.4烷氧基或Cw烷氧基-C,.4烷基；R2是 C,.4烷基或Cu烷氧基；且R3和R4独立地是支链C,-4烷基。
13. 依据权利要求13的方法，其中S-氨基-y-羟基-co-芳基-链 烷酸酰胺衍生物是式(I)化合物或其可药用盐，其中R,是3-甲氧基 丙氧基；R2是甲氧基；且R3和R4是异丙基。
14. 依据权利要求14的方法，其中3-氨基-Y-羟基-to-芳基-链 烷酸酰胺衍生物是(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙基-7-[4-曱氧基 -3-(3-甲氧基-丙氧基)-节基卜8-甲基-壬酸(2-氨基甲酰基-2-曱基-丙基)-酰胺 半富马酸盐。
15. 选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂在制备用于提高肾素抑 制剂或其可药用盐的生物利用度的药物中的用途。
16. 依据权利要求15的用途，其中非药理活性化合物是选自 姜黄素、肉桂酸苯酯、香豆素、肉桂酸P-香树素酯、芽菜脑、佛 手柑素、咖啡因、8-(癸硫基)-咖啡因、8-节基-咖啡因、焦碳酸二乙 酯、桑色素、柚皮芸香苷、胡椒碱、槲皮素、斯拉韦素、水飞蓟 宾、可可碱、香草醛和香草基-N-nonlymine的GRAS化合物，或者 是选自包括维生素E TPGS和CremophorEL的非离子型表面活性 剂的赋形剂。
17. 依据权利要求15或16的用途，其中非药理活性化合物是 姜黄素、维生素ETPGS、胡椒碱、香豆素和肉桂酸苯酯。
18. 依据权利要求15至17的用途，其中肾素抑制剂是3-氨基_"羟基_(0_芳基_链烷酸酰胺衍生物或其可药用盐。
19. 依据权利要求18的用途，其中S-氨基-Y-羟基-co-芳基-链 烷酸酰胺衍生物是式(I)化合物或其可药用盐<formula>formula see original document page 4</formula>其中R,是C"4烷氧基-d.4烷氧基或d.4烷氧基-d.4烷基；R2是 C,"烷基或C,.4烷氧基；且R3和R4独立地是支链Cw烷基。
20. 依据权利要求19的用途，其中S-氨基-y-羟基-co-芳基-链 烷酸酰胺衍生物是式(I)化合物或其可药用盐，其中R,是3-甲氧基 丙氧基；R2是甲氧基；且R3和R4是异丙基。
21. 依据权利要求20的用途，其中3-氨基-Y-羟基-co-芳基-链 烷酸酰胺衍生物是(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-4-羟基-2-异丙基-7-[4-曱氧基 -3-(3-曱氧基-丙氧基)-千基-8-甲基-壬酸(2-氨基甲酰基-2-甲基-丙基)-酰胺 半富马酸盐。
全文摘要
本发明提供了提高肾素抑制剂、优选δ-氨基-γ-羟基-ω-芳基-链烷酸衍生物的生物利用度的方法，该方法包括对于需要这类治疗的哺乳动物、特别是人共同施用肾素抑制剂或其可药用盐和选自非药理活性化合物的MDR1抑制剂的组合。
文档编号A61K31/165GK101541318SQ200780043251
公开日2009年9月23日 申请日期2007年11月23日 优先权日2006年11月24日
发明者G·P·卡梅尼施, G·格罗斯, I·奥汀格尔, T·法勒 申请人:诺瓦提斯公司