生物测定方法、生物测定设备和生物测定衬底的制作方法

专利名称：生物测定方法、生物测定设备和生物测定衬底的制作方法
技术领域：
本发明涉及在生物信息学(生命信息科学)中特别有用的生物测定方法、生物测定设备和生物测定衬底。
背景技术：
下面将说明本发明涉及的主要的常规技术。
当前，生物测定用的集成衬底，即所谓的DNA芯片或DNA微阵列(下文中统称为“DNA芯片”)，其中选出的DNA是用微阵列技术细微排列的(microarrayed)，已用于基因突变分析、SNP(单个核苷酸的多态性)分析和基因表达频率分析等方面，并且也开始广泛地用于开发新药和临床诊断、药物遗传学、法医学和其它领域。
DNA芯片的特点在于，可能将它广泛地用于分析如像杂交之类的分子间的相互作用，这是因为能够在玻璃衬底和硅衬底上集成大量的各类DNA低聚物链、cDNA(互补DNA)等。
下面将简要地说明使用DNA芯片的分析方法的一个例子。这就是进行PCR放大，其中，通过反转录-PCR或类似的操作将从细胞或组织中提取的mRNA掺入到在玻璃或硅衬底上固态化的DNA试样中，并在衬底上进行杂交。然后用适当的检测器进行荧光测量。
可将DNA芯片分成两大类。在第一类芯片中，用半导体曝光技术在指定的衬底上进行光刻来直接合成寡核苷酸。一个典型的例子就是美国Affymetrix公司制造的产品(例如，参见美国专利No.5,445,934)。在此类芯片中，尽管集成度很高，在衬底上加入到的合成还是有限的，并且长度限制在大约几十个碱基之内。
在也称之为“斯坦福方法”的第二类芯片中，芯片通过以下方式制造使用开口的锥形针，将制备的DNA在衬底上分散并固态化。(例如，参见美国专利No.5,807,522)。在此类芯片中，尽管集成度比前一类的要低，但是可能使大约1kb的DNA片断固态化。
近来，生物传感器技术一直在取得进展，其中将选出的检测物质在精细的检测表面位置上固态化，而该检测表面位置位于称之为生物传感器芯片，如像蛋白质芯片之类的薄片上，并使含有目标物质的微量溶液流向检测物质，然后，根据表面胞质团共振原理、石英晶体振荡器原理或类似的原理，来观察和分析在两个物质之间的相互作用。这个技术对分析物质间的相互作用(如像抗体-抗原反应和激素反应)是很有用的。
然而，在常规的DNA芯片技术和生物传感器技术中，物质之间的相互作用，如像杂交反应和抗体-抗原反应，是通过使检测核苷酸链(如DNA试样和蛋白质等)在衬底上的一个小的二维检测区域中固态化(固定化)来进行的。因此，在不一定是有利于反应的条件下，主要是依靠反应物的布朗运动来进行相互作用的，在这样的反应条件下，反应物的自由度在空间上受到了限制，并且在反应时也有出现空间位阻的可能性。因此，常规的DNA芯片技术和生物传感器技术存在一些技术间题，这就是相互作用效率低和反应时间长。
进而，在已知的DNA等芯片中，样品溶液只点滴在衬底的预定点位置(检测区)上，而且不用器件来使含在样品溶液中的目标物质和固定在预定点位置上的检测物质相对对准。
相应地，本发明的主要目标是提供一种生物测定方法、一种生物测定设备和一种能在此生物测定方法和生物测定设备中有效使用的生物测定衬底，其中，通过控制进行物质间相互作用(如杂交)的反应区中的电场形成，使检测物质和目标物质彼此相对对准并调整这些物质的结构，从而提高该相互作用的效率。

发明内容
为了解决上述的技术问题，在本发明的一个方面中，提出了下面的“生物测定方法”。此外，在本发明中，“生物测定”一词，广泛地表示基于物质间相互作用(例如杂交)的生物化学分析，。
在本发明的“生物测定”方法中，通过检测元件来检测物质间的相互作用。检测元件至少包括表面经过处理、用以固定检测物质的检测表面；反应区，它为固定在检测表面上的检测物质和目标物质之间的相互作用提供了场所；以及电场形成装置，它通过在反应区中施加电位差而在反应区中形成电场，这个方法至少还包括一个在预定的时间、用电场形成装置来开/关电场形成的步骤。
在反应区中形成的电场主要执行如下功能(1)拉伸检测物质和目标物质，如核苷酸链；(2)沿着电力线来回移动与检测物质分开的目标物质；以及(3)调整由检测物质和目标物质相互作用而得到的反应产物(检测物质和目标物质的结合)的较高级的结构到这样一种结构其中可能更加准确地读出从荧光标记的目标物质或从专门连接在该反应产物上的荧光嵌入剂上发出的荧光。
这就是说，通过在适当的预定时间形成所希望的电场(通过加电压)或取消电场(取消电压)来依次实现功能(1)到(3)。
更具体地说，通过施加一个高频、高压来实施功能(1)以制备一些结构，这些结构允许检测物质和目标物质彼此间易于发生反应。这种结构如像其中核苷酸链的碱基序列没有折叠的线性结构(拉伸结构)。
然后，通过施加矩形波电压(脉冲直流电压)，更具体地说，通过交替地施加矩形波电压(即+/-电压)来实施功能(2)，以使在反应区中被释放出的目标物质能更接近固定在检测表面上检测物质。从而，因为能提高反应的效率(反应的机率)，所以可以缩短反应的时间。
在检测阶段中，也是通过在反应区上加以高频、高压来实施功能(3)，以便能够用一种如像光学装置之类的检测装置来准确地检测从反应区中的反应产物上发出的荧光和类似的光。
为了使检测物质和目标物质之间能够可靠地进行如杂交之类的相互作用，最好是制备反应区，以便主要根据物质的布朗运动而发生相互作用。因此，在本发明中，在形成电场的一系列步骤中，明确地规定了一个在反应区中不形成电场的阶段。这就是说，在矩形波电压开的阶段之后，通过规定有一个关矩形波电压的阶段，来加速物质间的相互作用。
在此，在本发明的“生物测定方法”中，并未具体限定检测物质和目标物质的类型。“目标物质”的例子包括用荧光或其它的标志作了标记的物质以及没有作标记的物质。“检测物质”也非是狭隘定义的，检测物质的例子广义地包括直接或间接通过接头(linker)固定在检测表面上的低分子物质、高分子物质和生物物质，这些物质专门与用荧光或其它标志作了标记的目标物质相互作用。
“检测表面”表示有利地进行过表面处理的表面位置，以便能固定核苷酸链或类似反应物的终端。例如，在用链亲和素来进行表面处理时，得到了一个适合于固定生物素酰核苷酸链的检测表面。
本发明的方法适用于高分子物质之间、高分子物质和低分子物质之间、以及低分子物质之间的所有相互作用，高分子物质之间的相互作用诸如蛋白质-蛋白质、核苷酸链-核苷酸链(包括DNA-DNA和DNA-RNA)、蛋白质-核苷酸链(包括双链的核苷酸链)，和其它的相互作用。
例如，当检测物质和目标物质是核苷酸链并且相互作用是杂交反应的时候，即使是在很小的反应区域(点区)中，也一定能提高杂交的效率。因此，可能提供一种新颖的DNA芯片或者是一种微阵列技术，它具有短的反应时间以及读数的高准确度。
在物质之间的相互作用是杂交时，生物测定方法最好包括如下步骤(a)生成电场，以便拉伸终端固定在检测表面上的检测核苷酸链，(b)在步骤(a)之后，将目标核苷酸链掺入到反应区中，(c)在步骤(b)之后，在反应区中施加电位差，以便在反应区中相对移动检测核苷酸链和目标核苷酸链，(d)在步骤(c)后，在取消电压的状态下进行杂交。下面将专门说明步骤(a)到步骤(d)。
在本发明中，“核苷酸链”一词表示的是核苷的磷酸的聚合物，其中，嘌呤或嘧啶基配糖链接到一个糖上。核苷酸链的例子广义地包括含有DNA试样的低核苷酸、聚核苷酸、由嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸聚合而成的DNA(全长或者是它的片断)、由反转录而得到的cDNA(cDNA试样)和RNA。
由于要固定在检测表面上的检测核苷酸链(单链的)并非总是线性的构造，所以在步骤(a)中将检测核苷酸链沿着电力线的方向进行线性拉伸。从而使检测核苷酸链的碱基序列暴露于反应区中，并能得到一种状态，在此状态下，易于发生与互补碱基序列的氢键合。
更具体地说，通过施加一个电场来拉伸含有多个极化矢量的核苷酸链而使碱基不再彼此重叠，这些极化矢量是由含有磷酸盐离子的核苷酸链的负电荷和电离的氢原子的正电荷组成的。结果是，空间位阻消失了，并能与邻近的目标核苷酸顺利地进行杂交反应。
下面将要详细说明拉伸和移动核苷酸链的原理。设想离子云是由构成核苷酸链的主链的磷酸盐离子(负电荷)和由附近的水电离而生成的氢原子(正电荷)生成的。通过施加一个高频、高压将由正、负电荷产生的极化矢量(偶极子)全部定向在一个方向上，从而拉伸核苷酸链。另外，在施加一个不均匀的、电力线集中在一个区域上的电场时，核苷酸链就朝着电力线集中的区域移动(参见由Seiichi Suzuki、Takeshi Yamanashi、Shin-ichi Tazawa、Osamu Kurosawa和Masao Washizu所著的“在静止的交流电场中利用荧光异向进行DNA静电定向的定量分析”，IEEE会刊工业应用分册，第34卷，第1期，75-83页，(1998))。
在步骤(a)之后进行步骤(b)，在此步骤中，在仍然加有电压或取消了电压的情况下，将含有目标核苷酸链的样品溶液掺入到反应区的液相中。
在步骤(b)之后进行步骤(c)，在此步骤中，在反应区中形成电场，以便在反应区中相对移动检测核苷酸链和目标核苷酸链，从而建立一个易于进行杂交的反应环境。这就是说，根据步骤(c)，通过在反应区中形成电场，能够明显地提高核苷酸链之间的、主要是依靠布朗运动的反应机遇，从而能够提高反应的效率和改进检测的准确性。
然后，在步骤(c)之后的步骤(d)中，取消电压，依靠布朗运动进行杂交。之所以在步骤(d)中取消电压，是因为杂交主要是一个让互补碱基对之间发生氢键合的反应。
在本发明的另一个方面之中，提出了一种具有如下结构的“生物测定设备”，以作为有利于实行本生物测定方法的工具。
这就是说，本发明的生物测定设备包括检测元件，该检测元件至少含有表面经过处理、用以固定检测物质的检测表面；还包括反应区，该反应区为固定在检测表面上的检测物质和目标物质之间的相互作用提供了场所；还有电场形成装置，该装置通过在反应区中施加电位差而形成电场，并能在预定的时间开/关电场形成。
该“检测元件”包括检测表面、反应区、电场形成装置三个主要的组成部件，但是对其它的组成部件和结构并没有特别加以限定。例如，可以在衬底上生成由周边界定的精细的胞室结构、通道结构或类似的结构，并可在这些结构上制作主要的组成部件以生成检测元件。可以根据目的和应用来确定衬底上的检测元件的数量，并且可以适当地选择任何平面衬底，如矩形的或圆盘形的衬底。
在本发明的另一个方面中，提出了具有如下结构的“生物测定衬底”，作为有利于实施本生物测定方法的工具。
本发明的“生物测定衬底″包括制作在圆盘形衬底上“检测元件”，从该衬底上能够光学读出记录的信息。该检测元件至少包括下列部分(1)经过表面处理的、用以固定检测核苷酸链终端的检测表面(2)用以形成电场的正负电极，以便拉伸固定在检测表面上的检测核苷酸链；(3)为检测核苷酸链和目标核苷酸链之间的杂交反应提供场所的反应区。
在具有“检测元件”的生物测定衬底中，对固定在检测表面上的检测核苷酸链施加一个电场，以便线性拉伸该核苷酸链，然后将含有目标核苷酸链的样品溶液准确地点滴在检测元件的反应区上，从而在检测核苷酸链和目标核苷酸链之间进行杂交反应。这样就能够在一个有利的短时期内有效地进行杂交反应。
下列的工序能导致这样的一个优点。如上所述，通过施加一个电场来拉伸核苷酸链，该核苷酸链包含许多极化矢量，它们是由含有磷酸盐离子的核苷酸链的负电荷和电离的氢原子的正电荷组成的，从而使碱基不再相互重叠。其结果是，空间位阻消失了，从而能够顺利进行在检测核苷酸和邻近的目标核苷酸之间的杂交反应。
下面将再次说明核苷酸链的拉伸和运动原理。设想由构成核苷酸链主链的磷酸盐离子(负电荷)和由附近的水的电离而形成的氢原子(正电荷)生成离子云。并通过加一个高频、高压使由负电荷和正电荷产生的极化矢量(偶极子)全部定向在一个方向上。其结果是，拉伸了核苷酸链。此外，在施加一个电力线集中在一个区域中的不均匀电场时，核苷酸链就向着电场内电力线集中的区域移动。
在此，在施加一个电场以使电力线集中在检测表面上时，由电场拉伸的核苷酸链(如上所述)就向着检测表面移动，并用其端部碰撞检测表面。从而能使检测核苷酸链可靠地固定在检测表面上。
“反应区”是一个界定的区域或空间，它为液相中的杂交反应提供了场所，由于在正负电极之间产生了电位差，因此，它也是在液相中形成电场的区域。
进而，在此反应区域中，除了在单链核苷酸之间的相互作用(即杂交)而外，也可由检测核苷酸链生成所希望的双链核苷酸，并进而可以进行双链核苷酸和肽(或蛋白质)之间的相互作用，或者是进行氧响应或其它分子间的相互作用。例如，在使用双链核苷酸时，可以分析在作为如激素受体之类的受体分子(它是转录因子)和效应单元DNA部分等等之间的连锁。
在本发明的生物测定衬底中，检测元件可以是具有胞室结构的胞式检测元件，其中检测表面置于该元件的一个表面上，而多个胞式元件可以排列在圆盘形的衬底上。“胞式检测元件”被定义为具有从周边衬底区界定出来的胞室状反应区的地点。
“胞式检测元件”可以排列在衬底上的适当位置上。如果从顶上来观察，径向排列的胞式检测元件能够有效地利用衬底上的空间，从而能够提高信息的集成密度。这就是说，可能制作其上积累了大量记录信息的(圆盘形的)DNA芯片。
由于胞式检测元件是彼此定界开来的，从而防止了污染，所以每一个或每一组胞式检测元件都可以固定不同的检测核苷酸链，从而可以通过为各个检测核苷酸链设置不同的独立条件来进行杂交反应。
例如，可以将用于鉴定疾病表现的标志基因分组并固定在衬底上。从而可能同时鉴定多种疾病的表现状态。
也可能根据Tm或GC内容的差别将要固定的检测核苷酸链分组。因而，能够根据核苷酸链的特征来灵活地选择缓冲组分和获得有效的杂交反应所需的反应条件，诸如浓度、清洗条件、要点滴的样品溶液的浓度，等等。因此，有可能极大地降低在分析中显示假正或假负结果的风险。
在本发明的生物测定衬底中，可以使用这样的一种结构在此结构中，检测元件的反应区形成或排列在圆盘形衬底上径向延伸的槽中，并且，检测表面位于槽的内表面上。
在衬底中形成的“槽”是一种长的微通道结构。具有槽的生物检测衬底所属的领域之一是圆盘形的微通道阵列。在下文中，如像在“胞式检测元件”中那样，将反应区设置在槽中的检测元件称之为“槽式检测元件”。
在使用“槽式检测元件”时，可以用毛细管作用来输送液体，或者是使用一种利用离心力的液体输送工艺，该离心力是按预定方式旋转圆盘衬底而产生的。例如，可顺利而可靠地将样品溶液和清洗液等等从衬底的中心区输送到槽(即反应区)中，该清洗液是供取消反应后没有有效连锁的过剩的目标物质用的。
在槽式检测元件中，对于每一个槽或每一组槽而言，也可能固定不同的检测核苷酸链。
在上述的生物测定衬底中，如果装有用于提供检测表面位置的定位信息和旋转同步信息的装置，就可以通过准确的跟踪将含有检测核苷酸的样品溶液和含有目标核苷酸的样品溶液滴入到预定的反应区中。
这个装置可以是衬底上的摆动槽或者是地址坑。在此，“摆动”是指稍微地弯曲该槽(预刻槽)，在此槽中，相对于轨道的中心线从一侧到另一侧由用户记录了数据，以便将信息初步记录在盘的物理地址上。通常带有稍许频率偏移的FM调制是在一个比跟踪伺服频段更高的频率上进行的，并用正弦波来调制作为槽的径向偏移的信号振幅，以便在衬底上形成预刻槽。
在上述的生物测定衬底中，可将如下的一种材料填到反应区中在室温和反应的最佳温度之间，这种材料(称之为“相变材料”)能在凝胶和溶胶之间发生可逆相变。例如，琼脂胶糖就可用来作为这种相变材料。
在这种情况下，可能进行这样的一种程序在此程序中，相变材料在高温下溶胶化，在此状态下施加一个电压以便排列如DNA之类的核苷酸链；降低温度，使相变材料凝胶化；此外，在杂交时，在反应的最佳温度条件下，使相变材料溶胶化。如果在杂交时相变材料保持在凝胶化状态，在如像DNA之类的核苷酸链被拉伸时就能够进行杂交，而这是更为可取的。此外，在相变材料处于凝胶化状态时，也有着不能成功进行杂交的可能性。因此，如像在电泳中那样，在滴落点上可以初步生成一个长度方向上的凹坑，从而可让样品溶液滴入此凹坑中。
在本发明中，可用荧光染料或嵌入剂来标记目标核苷酸。该“嵌入剂”用如下方式掺入到杂交的双链核苷酸链中将该嵌入剂插入到在检测核苷酸链和目标核苷酸链的碱基之间的氢键中。由此可使荧光波长向长波长的方向移动，并且由于荧光强度和掺入到双链核苷酸中的嵌入剂的剂量是彼此相关的，因此，根据此相关性就能够进行定量的检测。如上所述，本发明在技术上的优点是提供了一种有关DNA芯片与生物传感器芯片的新颖技术。
发明在技术上的优点还在于提供了一种新颖的生物测定衬底，该生物测定衬底可用于基因变异分析、SNP(单核苷酸的多态性)分析、基因表现频率分析等方面，并可用在与新药开发、临床诊断、药物遗传学、法医学等相关的产业中。


图1是一个流程图，该图示出了本发明的推荐的生物测定方法的步骤，以及本发明的推荐的生物测定设备的实施例。
图2是一个波形图，该图示出了在生物测定方法和设备中施加/取消电压的步骤的一个例子。
图3是一个透视图，该图示出了在本发明推荐的一个实施例中从顶上观察的生物测定衬底的外观。
图4是一个放大了的透视图，该图示出了制备在一个衬底上的胞式检测元件。
图5是一个放大了的示意图，该图示出了检测表面和在该表面附近的胞式检测元件的反应区。
图6(A)和6(B)示出了在本发明的另一个推荐的实施例中的生物测量衬底；图6(A)是衬底的一个顶面视图；图6(B)是图6(A)中截面X的放大的平面视图。
具体实施例方式
下面将根据附图来说明本发明几个推荐的实施例。
图1(A)到1(F)是流程图，这些图示出了本发明的生物测定方法的推荐步骤以及本发明的生物测定设备的推荐实施例。图2是一个波形图，该图示出了在该生物测定方法和设备中施加/取消电压的步骤的一个例子。
下面将说明一个例子，在此例中，检测物质和目标物质都是单链核苷酸链，相互作用是本发明中的杂交。然而，需要知道的是，检测物质和目标物质并不只限于核苷酸链，相互作用也不只限于本发明中的杂交反应。
首先，本发明中的生物测定方法或生物测定设备使用检测元件1，该元件至少包括经过表面处理的、用以固定由图1中符号D代表的检测物质的检测表面S，还包括反应区R，它为固定在检测表面S上的检测物质D和目标物质T之间的相互作用提供了场所，还包括正电极E1和负电极E2，它们起着电场形成装置E的作用，电场形成装置E通过在反应区R中施加电位差从而在反应区R中产生电位差。标记号2代表装有检测元件1的衬底的一个部分，符号V代表向正电极E1和负电极E2提供电力的电源。
图1(A)简明地示出了一个状态，在此状态下，单链检测核苷酸链(如DNA试样)D1的端部固定在检测表面S上。在此状态下，检测核苷酸链D1的更为高级的结构不总是线性的，而常常是如图1(A)所示的折叠形态，就好像这个链是缠绕起来的。由于所有的碱基序列并非总是暴露在反应区R中，所以认为，要与随后掺入到反应区R中的目标核苷酸链T有效地进行杂交是困难的。
因此，在本发明中，在反应区R内，在正电极E1和负电极E2之间，对液相(盐溶液或类似物)施加一个高频、高压，以在反应区R中产生电位差，并由此形成电场。该电场具有能够沿电场方向线性地拉伸(拉直)检测核苷酸链D1的功能。因此，就把检测核苷酸链D1拉直了(由符号D2表示)，并且检测核苷酸链D1的碱基序列就暴露在液相之中(参见图1(B))。
然后，在取消或仍然加以高频、高压的情况下，将含有目标物质T(目标核苷酸链T1)的样品溶液从具有预定结构的喷嘴3中准确地掺入到反应区R中。尽管，如图1(C)所示，在加入时目标核苷酸链T1并非总是线性的，但在加上高频、高压的液相中，如图1(D)所示，目标核苷酸链T1就被线性拉直了(由符号T2表示)。这样就建立了一个状态，在此状态下，拉伸了的目标核苷酸链T2和同样拉伸了的检测核苷酸链D2就易于形成互补的链。
然后，通过重复施加/取消矩形波电压数次，就能逐步将核苷酸链D2和T2彼此靠拢在一起，并来回移动目标核苷酸链或调整反应时间。
通过取消矩形波电压，以便让线性目标核苷酸链T2和线性检测核苷酸链D2之间的互补链形成反应(即杂交)主要依靠布朗运动来进行。进而，图1(E)简明地示出了双链反应产物(D2+T2)，它是通过检测核苷酸链D2和目标核苷酸链T2的互补的碱基序列部分之间的氢键合而形成的。
在本发明中，除了检测具有与检测核苷酸链D1(D2)的碱基序列互补的碱基序列的目标核苷酸T1(T2)而外，还可做进一步的开发，例如，开发一种方法，其中利用上述步骤来制备所希望的双链核苷酸链(DNA)，并检测在特定的蛋白质(如转录因子)和双链核苷酸链(DNA)中的特定的响应序列部分之间的相互作用，并进而用此方法进行内分泌破坏物的查找和鉴定等。
图1(F)示出了用光学装置4来检测和读取标记的(如荧光标记的)目标核苷酸链T2的步骤。在本发明中，并未狭隘地限定标记方法。例如，可使用荧光嵌入剂。将荧光嵌入剂掺入到杂交的双链核苷酸链中，以便将其插入到检测核苷酸链D和目标核苷酸链T的碱基之间的氢键中。从而使荧光波长向长波长的方向移动，并且能够根据荧光强度和掺入到双链DNA中的荧光嵌入剂的剂量之间的相互关系来进行定量检测。用作为荧光嵌入剂的荧光染料可以选择POPO-1，TOTO-3或类似的物质。
在检测阶段中，通过施加高频、高压，就可将在反应区R中生成的反应产物(双链核苷酸链)的较高级的结构调整为非折叠式的结构，并由此能用光学装置4来进行准确的检测。
下面将参照图2来说明施加/取消电压的步骤的例子。这个例子相应于前面图1(C)以后示出的步骤。
<步骤a>
通过将核苷酸链放在一个由施加高频、高压而形成的电场中来进行核苷酸链的感应极化，并由此而拉伸该核苷酸链。因此，在步骤a中，通过施加高频、高压来拉伸目标核苷酸链T1，并同样地拉伸检测核苷酸链D1(参见示于图1(C)和1(D)中的状态)。
此外，高频、高压的最佳条件被认为是1×106V/m和1Mz左右(参见由MashiZu Washizu和Osamu Kurosawa著的“在微构造结构中的DNA的静电控制”，IEEE会刊工业应用部分，第26卷，第26期，1165-1172页，1990)。
<步骤b>
在确信核苷酸链D2和T2在相对移动并彼此靠近的时候取消电压，并主要依靠布朗运动来进行杂交(参见图1(E)所示的状态)。
<步骤c>
通过在正方向上施加矩形波电压，以便利用库伦力来移动仍然没有靠近检测核苷酸链D2的目标核苷酸链T2，从而使目标核苷酸链T2位于能与检测核苷酸链D2进行杂交的适当的位置上。(参见从图1(D)到图1(E)所示的状态过程)。
<步骤d>
再次取消电压，并主要依靠布朗运动来进行杂交(参见图1(E)所示的状态)。
<步骤e>
然后，通过在负方向上施加矩形波电压来移动仍然没有靠近检测核苷酸链D2的目标核苷酸链T2(参见从图1(D)到图1(E)所示的状态过程)。
<步骤f>
再次取消电压，并主要依靠布朗运动来进行杂交(参见图1(E)所示的状态)。
<步骤g>
通过在正方向上再次施加矩形波电压，来移动仍然没有靠近检测核苷酸链D2的目标核苷酸链T2(参见从图1(D)到图1(E)所示的状态过程)。
<步骤h>
再次取消电压，并主要依靠布朗运动来进行杂交(参见图1(E)所示的状态)。
<步骤i>
然后，通过在负方向上再次施加矩形波电压来移动仍然没有靠近检测核苷酸链D2的目标核苷酸链T2(参见从图1(D)到图1(E)所示的状态过程)。
<步骤j>
再次取消电压，并主要依靠布朗运动来进行杂交(参见图1(E)所示的状态)。
<步骤k>
在高频、高压下拉伸由杂交生成的反应产物-双链核苷酸链(D2+T2)，并进行荧光读出(参见图1(F))。
对于施加/取消矩形波电压等等的步骤，可以根据要处理的反应产物的类型来选择和决定适合的步骤或时间。步骤或时间不局限于上述的步骤或时间。可以根据目的来适当地确定要用的频率和电压。
现在将要说明在本发明中可以使用的生物测定衬底和与该衬底相关的生物测定设备。
图3是一个透视图，该图示出了其上具有预定结构的多个检测元件的生物测定衬底的外观。图4是一个放大了的透视图，该图示出了在推荐的实施例中制备在衬底上的一个“检测元件”。应当了解的是，适用于本发明的衬底并非仅限于图中所示的衬底。
示于图3中的生物测定衬底2包括一个圆盘形的衬底基板(盘)，它是作为光信息记录介质用的，诸如CD、DVD或MD。这就是说，在衬底2中，能够光学读出记录信息。
将由石英玻璃、硅、聚碳酸酯、聚苯乙烯或其它的合成树脂材料构成的基板制成一个盘，这些合成树脂材料应当是能够被制成盘的，最好是能够注射模塑的合成树脂。与常规使用的玻璃芯片相比，使用廉价的合成树脂衬底能够达到低的运行成本。可在基板上生成一个用于固定主轴的孔(图中未示出)，而主轴是转动衬底用的。
在衬底2的表面上性成蒸发的铝层，其厚度约为40nm，这个铝层起着反射膜的作用。在此反射膜中，在折射率为1.5或更大的基板上的表面反射率为4％或更大。在此反射层上淀积了一个由透明玻璃、透明树脂或类似的材料组成的透光层。
此外，当用高反射率的材料构成基板的时候，并非总有必要形成反射膜，这是因为基板本身表面就起着反射表面的作用。如果形成的是如金属膜之类的高反射率的膜，就能以高灵敏度来检测荧光标记的目标物质的荧光强度。上述的衬底2的材料和层结构也适用于下面将要说明的衬底20(参见图6)。
在从上面观察时，能看到许多检测元件1被排列在透光层上，并从衬底2中心的周边区域径向地向外延伸。图4是一个放大的透视图，该图示出了胞式检测元件1中的一个元件。对于检测元件1而言，将把下述的一种情况作为典型例子来加以说明。在此情况下，检测物质和目标物质都是单链的核苷酸链。然而，应当了解的是，用检测元件1来检测的反应物质并非仅限于此。
反应元件1包括检测表面S，该表面经过表面处理用于固定由符号D代表的检测核苷酸链终端，还包括正电极E1和负电极E2，它们是用来形成电场，以便拉伸初步固定在检测表面S上的检测核苷酸链D，还包括反应区R，这个区域为检测核苷酸链D和目标核苷酸链T之间的杂交提供场所。在此例中，生成了胞室状的反应区R，它的口是朝着顶部打开的，并且从上面观察时它是一个正方形，例如，具有1μm的深度、100μm的长度和50μm的宽度。然而，胞室的形状和尺寸并非仅限于图中所示的那些。
将检测表面S放在负电极E2一侧的内表面上，面对反应区R。检测表面S是经过适当表面处理的，因此，能够用如像偶合之类的化学键合将检测核苷酸链D固定在其上。
这就是说，只要检测表面S是经过表面处理的，以便能够固定如像DNA试样之类的检测核苷酸链D的初步处理过的终端，就不特别地对其加以限制。例如，用链亲和素表面处理过的检测表面S就适合于固定生物素酰核苷酸链的终端。
下面将说明一个把检测核苷酸链固定在检测表面S上的推荐方法。通过在反应区R上施加一个非匀均的电场，由电场作用而得到的检测核苷酸链(它是在反应区R中被释放出来的)向着电力线集中的检测表面S移动，并且，检测核苷酸链的终端部分撞击在检测表面S上。因此，能将检测核苷酸链可靠地固定在检测表面S上。为了有利地实行这个方法，将负电极E2做成像图4所示的梳状。图4中的符号V代表提供给正电极E1和负电极E2的电力的电源。
在图4中，标记号4代表点滴样品溶液5用的喷嘴尖。喷嘴4是这样构造的，根据由衬底2提供的定位信息和旋转同步信息来进行准确的跟踪，以将含有检测核苷酸链D的样品溶液5和含有目标核苷酸链T的样品溶液5’滴入到反应区R所在的位置上。
作为点滴的手段，最好采用喷墨打印的方法。其原因在于，能够将细微的液滴准确地点滴在预定的反应区R的位置上(这也适合于下述的衬底20)。
喷墨打印法是这样的一个方法，在此方法中，采用了用在喷墨打印机中的喷嘴，其中，利用电来使检测物质从打印机头上喷射出来然后固定，就像在喷墨打印机中那样。这个方法的例子包括压电喷墨法、泡沫喷射(注册商标)法和超声喷射法。
在压电喷墨方法中，通过将一个脉冲加到压电元件上产生移位压力而使液滴喷出。泡沫喷射(注册商标)法是一个利用热力的方法，在此方法中，通过激活喷嘴中的加热器而产生的气泡压力来使液滴喷出。作为加热器的硅衬底嵌装在喷嘴中，通过在大约300℃/s下的控制，形成均匀的泡沫并喷出液滴。然而，由于液体是暴露在高温下，在将这种方法用于生物衬底的样品上时，必须多加小心。在超声喷射方法中，在液体的自由表面上加以超声束以便局部地施加高压，从而将液滴从这个部位上喷出。在此情况下不需要喷嘴，并且能以高速形成直径约为1μm的液滴。
在本发明中，作为“喷墨打印法”，最好使用“压电喷墨法”。由于可以通过改变所加脉冲的形状来控制液滴(微液滴)的大小，因而能够有利地提高分析的准确度。当液滴表面的曲率半径较小的时候，能够缩小液滴的尺寸。当液滴表面的曲率半径较大的时候，能够增加液滴的尺寸。通过快速改变负方向上的脉冲，能将液滴的表面向里拉，从而能够降低曲率半径。
由于滴落在反应区R上的许多检测核苷酸链D是固定在检测表面上的，而其碱基是卷绕起来的(参见图1(A))，因此，在与其后点滴的目标核苷酸链杂交时，会出现空间位阻之类的问题，并且会降低反应效率。
所以，根据本发明的生物测定方法，向正电极E1和负电极E2供电以便在反应区R中形成电位差，并由此在存储于反应区R中的液体(盐溶液)内生成电场，从而沿着电场的方向将检测核苷酸链D和目标核苷酸链T线性拉伸(拉直)。
由于排除了空间位阻等原因，互补碱基序列易于彼此靠近，这样，在线性拉伸了的检测核苷酸链D和用荧光染料或类似物质标记了的目标核苷酸链T的碱基之间就能有效地进行氢键合(互补键合)。
这就是说，能有效地进行检测核苷酸链D和目标核苷酸链T之间的杂交反应。因此，缩短了杂交反应的时间，并且减少了在读出时显示伪阳和伪阴结果的可能性，而这是更为可取的。
图4是一个放大的示意图，该图示出了检测表面S和它与检测元件1的反应区R的邻近关系。图5大致示出了这样的一个状态，在此状态下，终端固定在检测表面S上的检测核苷酸链D与目标核苷酸链T相互杂交形成了双链，在此，该目标核苷酸链T具有与检测核苷酸链D的碱基序列互补的碱基序列。
可用相变材料来填充反应区R(或者是下面将要说明的反应区R’)，这种相变材料如像可在凝胶和溶胶(图中未示出)之间进行可逆相变的琼脂糖凝胶。在此实施例中，可能进行这样的一个程序，在此程序中，相变材料在高温下被溶胶化了；在此状态下施加一个电压以排列像DNA之类的核苷酸链；通过降低温度使相变材料凝胶化；并在杂交时，在最佳的反应温度条件下，使相变材料溶胶化。如果在杂交时允许相变物质保持凝胶化状态，就能在拉伸像DNA这样的核苷酸链时进行杂交，而这是更为可取的。
此外，在对相变材料进行凝胶化时，如果将含有目标核苷酸链T的样品溶液5’滴入到检测元件1中，就有不能成功地进行杂交的可能性。因此，如像在电泳中那样，在滴入点上可以初步形成一个长度方向上的凹坑，以便将样品溶液滴入到此凹坑中。
可用荧光染料或者是嵌入剂来对目标核苷酸链T进行标记。以将嵌入剂插入到检测核苷酸链D和目标核苷酸链T的碱基之间的氢键中的方式，将嵌入剂掺入到杂交的双链核苷酸中。从而使荧光波长向着长波长的方向移动，并能根据荧光强度和掺入到双链DNA中嵌入剂的剂量的相互关系来进行定量检测。作为荧光染料的嵌入剂，可以选择POPO-1、TOTO-3或类似的物质。
例如，可能确认这样的一个事实，与检测核苷酸链D互补的目标核苷酸链存在于从指定细胞或类似物中提取出来的样品溶液5’中，该检测核苷酸链D含有已知在出现特定的疾病时才表现出来的标志基因。因此，能够预测出现在该细胞中的疾病。
为了读取衬底信息，用激光束(如蓝色激光束)对衬底2进行辐照以便激活每个反应区R，用检测器(图中未示出)来检测荧光强度，并确定检测核苷酸链D和标记的目标核苷酸链T之间的键合反应的状态。最后，对各个反应区R的荧光强度进行模拟/数字转换，并将键合反应率的分布显示在计算机C的屏幕上供目视观察之用(它也适用于下述的衬底20)。
现在将要参照图6(A)和图6(B)来说明本发明第二个实施例中的衬底。图6(A)是第二实施例中衬底20的一个顶面图，图6(B)是图6(A)中截面X的一个放大的平面图。
在示于图6(A)和图6(B)中的衬底20上装有槽式检测元件10。检测元件10是以多个槽的形式制成的，其中的反应区R’在圆盘形衬底上径向地向外延伸。在每个槽中，检测表面S’彼此间按照预定的距离、在槽的长度方向上放置在一侧的内表面Y上，每个检测表面S’都具有与检测元件1的检测表面S相同的结构。在形成检测表面S’的每个位置上，装有正电极E3和负电极E4，以便将反应区R’夹在当中(参见图5(B))。此外，可以把槽式检测元件10描述为这样的一种结构在此结构中将胞式检测元件1排列在槽内。
可将正电极E3制作成一个共用电极，同样地，也可把负电极E4制作成一个共用电极。这就是说，可将作为共用电极的正电极E3和负电极E4平行放置，以便隔着反应区R’彼此相对。在这样的一个结构中，能够通过将一个探针从上面压到正电极E3和负电极E4上来提供电流。
可以在排列于每个槽中的坑(图中未示出)内形成反应区R’。通过将微液滴滴入到坑内的反应区中，可能基本上达到相同的斑点尺寸，并能以较高的可重复性来检测荧光强度。
在使用槽式检测元件10的时候，可以利用毛细管作用来输送液体，也可以使用一种利用离心力来输送液体的工艺，该离心力是按预定方式转动盘状衬底时而产生的。
具体地说，在衬底20的中心处配备有一个液池21，并将样品溶液5(5’)(参见图4)和清洗液等等注入到该液池21中，该清洗液是用来除去反应后没有有效链接的过多的目标物质的。通过旋转衬底20，能够顺利而可靠地将液体从衬底的中心区输送入到槽中(即反应区R’)。
在衬底2的每个检测元件1中以及制备在衬底20上的每个槽式检测元件10中，对于每个检测元件或每一组检测元件而言，都有可能固定不同的检测物质D。
下面将简要地说明衬底2(20)的定位信息和旋转同步信息。在衬底2(20)的旋转方向上利用光盘母盘工艺能够初步形成许多地址坑。假设衬底2(20)是一个光盘，其中滴入液体并进行检测的到反应区R(R’)相应于用户数据区。在另一个区域中，利用采样伺服方法或类似的方法来排列同步坑，并且将该另一个区域也用做跟踪伺服。进而，通过紧跟在同步坑之后插入地址部分(盘上的地理地址)来提供定位信息。
地址部分是多种数据的组合，它以作为前导模式的扇区标记开头，其后是控制转盘转动相位的VFO(可变频率振荡器)，显示地址数据起始位置的地址标记，以及包括轨道号和扇区号在内的ID(标识符)。
为了用衬底2(20)进行生物测定，更为可取的是，使用了至少包括下列装置和机制在内的设备。这就是说，该设备(图中未示出)至少包括衬底转动装置，它在转动中托住衬底2(20)；点滴装置，该装置在衬底旋转装置转动衬底2(20)的时候将含有检测核苷酸链的溶液5和含有目标核苷酸链的溶液5’按照预定的次序与时间滴入到反应区R(R’)中；聚焦伺服机制，它使点滴装置(的喷嘴)和衬底2(20)之间保持一定的距离；以及跟踪伺服机制，它根据由衬底2(20)提供的定位信息和旋转同步信息使溶液5和5’能够准确地滴入到衬底2(20)的反应区R(R’)中。
如果不用地址坑，可以用制作在轨道上的摆动槽来进行寻址，在此，通过调整该摆动来获得盘上的定位信息，以便进而根据该方位来得到时钟信息。与此同时，通过使用摆动频率，使得跟踪伺服机制能够正常工作。此外，通过形成地址坑和摆动槽两者，能够更为准确地进行寻址和跟踪伺服控制。
通过使用衬底2或20以及包括衬底在内的生物测定设备，能够较好地实现本发明的生物测定方法。
具体而言，能够使上述的生物测定衬底得到下列的优点。
这就是说，在常规的DNA芯片技术中，由于DNA芯片本身的集成度和集成密度较低，在一次测定中能够获得的分析数据量是不足够的。因此，用户难于自由地设定检测物质的类型和数量，并进而自由地分配(组合)这些检测物质。
在常规的DNA芯片中，由于初步固定在衬底表面上用于检测的核苷酸链并非必定是处于线性状态之中，由于空间位阻等原因，与目标核苷酸链的杂交反应的准确度就会发生改变，并且需要长的反应时期。
进而，在常规的DNA芯片中，将具有不同的Tm(熔化温度)或GC内容的DNA试样作为检测物质排列在衬底的二维表面上，由于它们暴露于相同的杂交条件和清洗条件之下，因此，显示伪阳或伪阴结果的风险是很高的。
与此相反，根据本发明的生物测量衬底，能获得下列的极大优点。
(1)在本发明的生物衬底中，由于能生成大量和大批的检测元件，因而能够积聚大量的记录信息。
(2)对固定于检测元件的检测表面上的检测核苷酸链加一个电场，以便线性拉伸该核苷酸链，并随后将含有目标核苷酸链的样品溶液准确地滴入到检测元件的反应区中。由此在检测核苷酸链和目标核苷酸链之间进行杂交。从而能在一个短时期之内有效地进行杂交。
(3)由于能够通过挑选最佳反应条件来对每个检测元件或每一组检测元件进行检测，因而能够显著地减少伪阳或伪阴结果的发生率。所以，在生物测定衬底中，就可能广泛地、有效地、高准确地进行分析，并记录信息的成本不高。
(4)作为DNA芯片和生物传感器芯片，本发明的生物测定衬底是特别有用的。它还可能提供一个具有新颖结构的圆盘状微通道阵列。本发明的衬底作为DNA芯片，能用来进行基因突变分析、SNP(单核苷酸多态性)分析和基因表达频率分析等，并且也能广泛地用于开发新药、临床诊断、药物遗传学、法医学和其它的领域。
工业实用性本发明具有下列独特的有益效果。
(1)在本发明的生物测定方法和生物测定设备中，通过控制检测元件上反应区中的电场形成的时间，能够提高反应区中检测物质和目标物质之间相互作用的效率，并可能控制反应时间。
(2)本发明对于利用DNA芯片和生物传感器芯片的生物测定方法是特别有用的，并且能够用于基因突变分析、SNP(单核苷酸的多态性)分析和基因表达频率分析等，并且也能广泛地用于开发新药、临床诊断、药物遗传学、法医和其它的领域。进而，本发明还能用于测试抗体-抗原反应以及测定内分泌破坏物等。
权利要求
1.一种生物测定方法，此方法包括利用检测元件来检测物质间的相互作用，该检测元件至少包括经过表面处理的、用以固定检测物质的检测表面；反应区，该区为固定在检测表面上的检测物质和目标物质之间的相互作用提供场所；以及电场形成装置，该装置通过在反应区中施加电位差而在反应区中形成电场；其中，该方法至少包括在预定的时间利用电场形成装置来开/关电场形成的步骤。
2.根据权利要求1的生物测定方法，其中，所述检测物质和目标物质是核苷酸链，所述相互作用是杂交。
3.根据权利要求2的生物测定方法，此方法进而包括如下步骤形成电场，以便拉伸终端固定在检测表面上的检测核苷酸链；随后将目标核苷酸链掺入到反应区中；随后形成电场，以便在反应区中相对移动检测核苷酸链和目标核苷酸链；随后在取消电场的情况下进行杂交。
4.一种包括检测元件的生物测定设备，该检测元件至少包括经过表面处理的、用以固定检测物质的检测表面；反应区，该反应区为固定在检测表面上的检测物质和目标物质之间的相互作用提供场所；以及电场形成装置，该装置通过施加电位差而在反应区中形成电场，并能在预定的时间开/关电场形成。
5.一种生物测定衬底，该衬底包括制作在圆盘形衬底上的检测元件，能从此圆盘形衬底上光学读取记录的信息，该检测元件至少包括(1)经过表面处理的、用以固定检测核苷酸链终端的检测表面；(2)用于形成电场以便拉伸固定在检测表面上的检测核苷酸链的正电极和负电极；以及(3)为检测核苷酸链和目标核苷酸链之间的杂交提供场所的反应区。
6.根据权利要求5的生物测定衬底，其中，该检测元件是胞式检测元件，其中检测表面置于另一个表面上，并将多个胞式检测元件排列在圆盘形的衬底上。
7.根据权利要求3的生物测定衬底，其中，从上面观察时，胞式检测元件是径向排列在圆盘形的衬底上的。
8.根据权利要求7的生物测定衬底，其中，在各个胞式检测元件或各组胞式检测元件上固定不同的检测核苷酸链。
9.根据权利要求5的生物测定衬底，其中，将检测元件的反应区制作在圆盘形衬底上径向延伸的各个槽中，并将检测表面置于槽的内表面上。
10.根据权利要求9的生物测定衬底，其中，为各个槽或各组槽固定不同的检测核苷酸链。
11.根据权利要求5的生物测定衬底，该衬底进而包括用于提供检测表面位置的定位信息和旋转同步信息的装置。
12.根据权利要求11的生物测定衬底，其中，该装置包括制作在衬底上的一个摆动槽或地址坑。
13.根据权利要求5的生物测定衬底，其中，用一种能够在室温和最佳反应温度之间，在凝胶和溶胶之间进行可逆相变的材料来填充反应区。
14.根据权利要求5的生物测定衬底，其中，用嵌入剂来检测杂交。
全文摘要
本发明公开了一种生物测定方法，在此方法中，通过控制其中发生相互作用的反应区中的电场形成来提高如像杂交之类反应物之间相互作用的效率。本发明还公开了一种能有效地实施该方法的生物测定装置。在此方法中，利用检测元件1(10)来检测物质间的相互作用，该检测元件至少包括经过表面处理的、用以固定检测物质D的检测表面S(S’)；反应区R(R’)，它为固定在检测表面S(S’)上的检测物质D和目标物质T之间的相互作用提供场所；以及电场形成装置E，它通过在反应区R(R’)上施加电位差而在反应区R(R’)中形成电场；该方法还至少包括这样的一个步骤，即在预定的时间利用电场形成装置E来开/关电场形成。
文档编号G01N33/543GK1556923SQ0380090
公开日2004年12月22日 申请日期2003年5月21日 优先权日2002年5月21日
发明者真锋隆义, 山本拓郎, 郎 申请人:索尼株式会社