一种CoCl₂处理提高青蒿中青蒿素含量的方法

专利名称：一种CoCl₂处理提高青蒿中青蒿素含量的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体说，是CoCl2处理提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技术：
青蒿素作为一种有效的抗疟疾药物已经得到全世界的认同。目前，青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取。Artemisia annua L.(青蒿)又名黄花蒿,是一年生草本药用植物。由于青蒿中青蒿素的含量比较低(占干重的0.01%-1%)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。虽然现在已经能够人工合成青蒿素，但是由于难度大，产量低，成本高，不具备商业化生产的可行性。利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素是一种很有吸引力的方法。然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1%，在芽中，最高含量也只有干重的0.16%，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素，因此利用组织培养及细胞工程技术来生产青蒿素的可行性不高。另外利用基因工程技术获得青蒿素含量较高的青蒿新品种是一种较可行的方法，但是目前利用基因工程来提高青蒿素含量还处于尝试阶段，整个技术并不成熟。经对现有技术的文献检索发现,Dahua Chen等在《Plant Science》(《植物科学》，2000 年 155 期 179-185 页)发表了题为“Expression of chimeric farnesyl diphosphatesynthase gene in Artemisia annua L.transgenic plants via Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation”(“通过农杆菌介导转化在青蒿植株中表达法尼基焦磷酸合酶基因”)的论文，报道通过在青蒿植株中过量表达FPS (法尼基焦磷酸合酶)在原有基础上提高青蒿素含量2-3倍，但仍只有干重的1%左右。

发明内容
本发明的目的在于克服常规技术中的不足，提供一种CoCl2处理提高青蒿中青蒿素含量的方法，使其有效地提高了青蒿中青蒿素的含量，且无需很高的前期投入、操作简单、便于规模化生产。 本发明是通过如下技术方案实现的:一种CoCl2处理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:首先将青蒿的种子种植于发苗培养基中发苗，然后将青蒿苗移栽于泥炭珍珠岩培养基质中用普通营养液每周浇灌青蒿苗一次，在开花前期用CoCl2溶液处理，然后进行按期采收；所述的发苗培养基，是通过在MS培养液中另外添加蔗糖和琼脂而得，蔗糖和琼脂在发苗培养基中的浓度分别为30g/L 10g/L ;其中MS培养液为Murashige和Skoog于1962年公布；所述的泥炭珍珠岩培养基质中泥炭和珍珠岩的质量比为1:1。所述青蒿移栽的具体方法是当青蒿苗长至5cm时，将其移栽于泥炭珍珠岩培养基质中。
用CoCl2溶液处理的具体方法是待植物生长至开花前期，用CoCl2溶液喷洒整株植株。所述CoCl2溶液的浓度为ImM-lOOmM。所述的普通营养液，其配方是38mg/L KN03、33mg/L NH4NO3^8.8mg/L CaCl2.2H20、
7.4mg/L MgSO4.7Η20、3.4mg/L KH2PO4 和 4g/LNaCl，余量为水。所述采收时间分别在CoCl2处理后的4小时，8小时，16小时，24小时，48小时，72小时或96小时，优选72小时。本发明的原理在于，用CoCl2溶液处理青蒿植株能够在短时间(4-96小时)内提高一些青蒿素合成关键酶基因的表达，打破青蒿素合成途径中的一些限速步骤，从而在短时间内积累大量的青蒿素。所 述的一些青蒿素合成关键酶基因，是指3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase, HMGR)基因 hmgr、法尼基焦磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase, FPS)基因fps、紫穗槐二烯合成酶(amorpha-4, 11-diene synthase,ADS)基因ads和紫穗槐二烯氧化酶(amorpha-4，11-dieneC-12oxidase, CYP71AV1)基因 cyp71avl。本发明建立了通过CoCl2处理提高青蒿素含量的方法，能有效地提高青蒿中青蒿素的含量，处理过的青蒿中青蒿素的含量比对照提高了 100%以上。本发明的方法不需要利用基因工程方法提高青蒿素含量所要求的相对较高的前期投入，操作简单，便于规模化生产，对降低青蒿素的生产成本具有非常重要的意义。


图1为用CoCl2溶液处理青蒿植株后不同时期采收的青蒿中青蒿素含量变化示意图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例将青蒿种子(来源于重庆酉阳青蒿素含量较高的青蒿品种)种植于发苗培养基上发苗，发苗培养基的配方为MS培养液，其中添加30g/L的蔗糖和10g/L的琼脂而得。待青蒿苗长至5cm左右移栽于泥炭珍珠岩培养基质(泥炭和珍珠岩的比例为1:1)中，用普通营养液每周浇灌一次。其中普通培养液的配方为38mg/L KN03、33mg/L NH4NO3^8.8mg/LCaCl2.2H20、7.4mg/L MgSO4.7Η20、3.4mg/L KH2PO4 和 4g/L NaCl，余量为水。待植株生长到40cm左右(植株开花前期)，用CoCl2溶液处理青蒿植株，同时用水处理的青蒿植株作为对照。分别采收处理4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时后的整株青蒿的叶片以及水处理的整株青蒿的叶片，用高效液相色谱测定青蒿素含量。结果如图1所示，水处理的青蒿中青蒿素的含量6.172mg/g DW，在CoCl2溶液处理后，青蒿素的含量有了显著的提高。在CoCl2溶液处理4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时后青蒿素的含量分别为6.491mg/g Dff,7.503mg/g DW、8.969mg/g DW、10.210mg/gDW、ll.140mg/g DW、13.984mg/g Dff,10.104mg/g DW，其中在处理72小时后青蒿
素的含量达到最高，是对照组的2倍多。应用本发明方法，在开花前期用CoC12溶液喷洒青蒿植株进行处理，可以显著的提高青蒿植株中青蒿素的含量，同时不影响青蒿植株的生物量，从而显著地提高了青蒿素的产量。由于本方法采用的CoCl2浓度低，因此具有投资少、效果显著、方便易行的特点，对于降低青蒿素的生产成本、满足青蒿素的大规模生产具有重要的意义。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
权利要求
1.一种CoCl2处理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:首先将青蒿的种子种植于发苗培养基中发苗，然后将青蒿苗移栽于泥炭珍珠岩培养基质中用普通营养液每周浇灌青蒿苗一次，在开花前期用CoCl2溶液处理，然后进行按期采收； 所述的发苗培养基，是通过在MS培养液中添加蔗糖和琼脂而得，蔗糖和琼脂在发苗培养基中的浓度分别为30g/L和10g/L ； 所述的泥炭珍珠岩培养基质中泥炭和珍珠岩的质量比为1:1。
2.根据权利要求1所述的CoCl2处理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:所述青蒿移栽的具体方法是当青蒿苗长至5cm时，将其移栽于泥炭珍珠岩培养基质中。
3.根据权利要求1所述的CoCl2处理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:用CoCl2溶液处理的具体方法是待植物生长至开花前期，用CoCl2溶液喷洒整株植株。
4.根据权利要求1、2或3所述的CoCl2处理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:所述CoCl2溶液的浓度为ImM-lOOmM。
5.根据权利要求1所述的CoCl2处理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于: 所述的普通营养液，其配方是 38mg/L KN03、33mg/L NH4NO3、8.8mg/L CaCl2.2H20、7.4mg/L MgSO4.7H2 0、3.4mg/L KH2PO4 和 4g/LNaCl，余量为水。
6.根据权利要求1CoCl2处理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:采收时间在CoCl2处理后的4小时，8小时，16小时，24小时，48小时，72小时或96小时。
7.根据权利要求1CoCl2处理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:采收时间在CoCl2处理后的72小时。
全文摘要
本发明公开了一种CoCl2处理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于首先将青蒿的种子种植于发苗培养基中发苗，然后将青蒿苗移栽于泥炭珍珠岩培养基质中用普通营养液每周浇灌青蒿苗一次，在开花前期用CoCl2溶液处理，然后进行按期采收。本发明能有效地提高青蒿中青蒿素含量，操作简单，不需要基因工程方法所要求的较高的前期投入，有效降低了青蒿素生产成本，对满足青蒿素医药工业大规模生产具有重要意义。
文档编号A01G31/00GK103168669SQ20131009341
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者开国银, 李青青 申请人:上海师范大学