专利名称：醋酸菌生长促进相关基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种耐醋酸微生物，更具体地说，涉及一种编码来自微生物的具有生长促进功能蛋白质的基因，一种其中上述基因多个拷贝被扩增的微生物，以及使用上述微生物制造食醋的方法。
背景技术：
醋酸菌是广泛应用于食醋制造的微生物。特别是属于醋酸杆菌(Acetobacter)属和葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter)属的醋酸菌用于工业醋酸发酵。
在醋酸发酵中，培养基中所含乙醇被醋酸菌氧化并转化为醋酸。结果醋酸蓄积在培养基中。醋酸对醋酸菌也有抑制作用。醋酸蓄积量增加导致培养基中醋酸浓度增高，则醋酸菌的生长能力和发酵能力逐渐下降。
特别是，生长诱导周期，即从醋酸菌实际上开始生长直到可以证实醋酸蓄积的周期，当醋酸浓度增高时趋于延长。
因此，在醋酸发酵中，即使在更高的醋酸浓度下，还是希望能进一步缩短生长诱导周期。作为达到该目的的一个手段，业已披露了一种方法，包括添加PQQ(4，5-二氢-4，5-二氧-1H-吡咯并[2，3-f]喹啉-2，7，9-三羧酸)到发酵液中促进生长，使得所谓的生长诱导周期缩短(如，参见日本专利公开(Kokai)号61-58584 A(1986))。
但是，很难大量获得PQQ，并且PQQ很昂贵。因此，在工业规模上实施上述方法是不经济的。于是，业已尝试在高浓度醋酸存在下，克隆编码具有能缩短所谓生长诱导周期功能蛋白质的基因(生长促进相关基因)，并使用生长促进相关基因通过促进醋酸菌生长(对醋酸耐性)对醋酸菌进行育种和改良。
然而，迄今为止尚未分离到醋酸菌生长促进相关基因。在这样的情况下，希望分离到一种具有生长促进功能并编码下述蛋白质的基因，所述蛋白质在高醋酸浓度存在下具有促进在应用水平上的醋酸菌生长(耐醋酸)和缩短生长诱导周期的功能，并使用该生长促进相关基因产生具有更强生长功能的醋酸菌。
发明内容
本发明的目的在于分离一种具有生长促进功能并编码蛋白质的新基因，该蛋白质在高醋酸浓度存在下能在应用水平上改良生长功能(耐醋酸)并能缩短所谓的生长诱导周期，以便使用具有上述基因生长促进功能的基因培育出一种具有更佳生长促进功能的醋酸菌，并提供一种使用该醋酸菌高效制造具有高浓度醋酸的食醋的方法。
我们提出了一种假说，即在醋酸存在下能生长和发酵的醋酸菌存在编码具有生长促进功能蛋白质的特定基因，该蛋白质可存在于该醋酸菌中而在其他微生物中不存在。接着我们尝试分离这样的基因，并成功地分离出上述新基因。此外，我们发现使用上述编码具有生长促进功能蛋白质的基因能改良生长促进功能和微生物对醋酸的耐性，并能高效制造含高浓度醋酸的新的食醋。因此，由此完成了本发明。
本发明如下列(1)至(8)所述。
(1)下列(A)或(B)的蛋白质(A)含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质；或(B)含有由SEQ ID NO2所示氨基酸序列通过置换、缺失、插入、添加或倒位1个或几个氨基酸得到的氨基酸序列，并具有生长促进功能的蛋白质。
(2)编码下列蛋白质(A)或(B)的DNA(A)含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质；或(B)含有由SEQ ID NO2所示氨基酸序列通过置换、缺失、插入、添加或倒位1个或几个氨基酸得到的氨基酸序列，并具有生长促进功能的蛋白质。
(3)下列(A)、(B)或(C)的DNA(A)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列的DNA；(B)与由与SEQ ID NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列互补的序列组成的DNA在严格条件下杂交，并编码具有生长促进功能蛋白质的DNA；或(C)与由产生自SEQ IN NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列组成的、具有引物或探针功能的DNA在严格条件下杂交，并编码具有生长促进功能蛋白质的DNA。
(4)含有上述(2)或(3)的DNA的重组载体。
(5)用上述(4)的重组载体转化的转化体。
(6)具有增强的生长促进功能的微生物，其中在细胞中上述(2)或(3)的DNA的多个拷贝被扩增。
上述微生物的例子包括属于醋杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌。
(7)一种制造食醋的方法，包括在含有乙醇的培养基中培养上述(6)的微生物，使该微生物在该培养基中生成并蓄积醋酸。
(8)通过上述(7)的方法获得的含高浓度醋酸的食醋。
附图简述
图1是来自Gluconacetobacter entanii基因片段(含有pS10和ompA)的酶切图谱的示意图。
图2显示了在含有醋酸的培养基中培养转化体的过程，该转化体具有来自Gluconacetobacter entanii并与生长促进功能相关的扩增的多拷贝基因。
图3显示了由来自Gluconacetobacter entanii的基因所编码、并与生长促进功能相关的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图4显示了pGI18的构建示意图和酶切图谱。
实现本发明的最佳方式本发明如下所详述。该申请要求了2003年6月26日提交的日本专利申请号2003-183047的优先权，其说明书和/或附图中描述的内容在此并入。
1、分离编码具有生长促进功能蛋白质的基因我们开发了一种用于从醋酸菌中分离具有生长促进功能基因的方法，并尝试分离具有这样功能的基因。根据该分离方法，通过构建醋酸菌染色体DNA文库、用该染色体DNA文库转化醋酸菌、然后筛选在存在1％醋酸的琼脂培养基上3天内能生长的醋酸菌株获得分离得到具有生长促进功能的基因，在相同的培养基上醋酸菌通常需要4天才生长。
通过将该方法应用于实际用于食醋制造的属于葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌中，我们首次成功地克隆出一种具有生长促进功能的新基因。该新基因通过在高醋酸浓度存在下增强在应用水平上的生长功能(耐醋酸)并缩短生长诱导周期，可改良生长促进功能。
因此，作为DDBJ/EMBL/Genbank和SWISS-PROT/PIR同源性搜索的结果，所获得的醋酸耐性基因在一定程度上类似于在大肠杆菌(Escherichia coli)和新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)等中业已发现的ompA基因所产生的一组蛋白质。认为该基因是来自醋酸菌的ompA基因。
此外，本发明的ompA基因在氨基酸序列水平上与来自大肠杆菌的ompA基因具有36％同源性，与来自新月柄杆菌的ompA基因具有30％同源性。由于如此低的同源性水平，因此证实了本发明的ompA基因与来自其他微生物的ompA基因稍微类似，而是一种编码特异于醋酸菌的新蛋白质(在下文中，也称为蛋白质OMPA)的新基因(在下文中，也称为ompA基因)。
在本发明中，通过将ompA基因连接到质粒载体上、然后用该载体转化醋酸菌生成具有扩增的多拷贝ompA基因的转化体。在这样的转化体中，醋酸耐性明显增强(参见实施例3)。此外，当在乙醇存在下通风培养转化体时，其发酵醋酸的能力，特别是其生长促进功能明显增强。在高醋酸浓度存在下生长促进功能(耐醋酸)也得到增强。因此，缩短了生长诱导周期，提高了生长速度，证实了能在增加的醋酸浓度等条件下生长(参见实施例2和4)。因此，可以证实ompA基因的确编码具有生长促进功能的蛋白质，而且为了发挥该蛋白质的功能该基因得到表达。因此，我们预计使用其中扩增了多拷贝ompA基因的微生物，能高效制造具有高醋酸浓度的食醋。
2、本发明的DNA和蛋白质本发明的DNA编码来自醋酸菌的ompA基因和该基因的调控序列。此外，认为该DNA编码具有改良醋酸耐性功能和生长促进功能的蛋白质(SEQ ID NO2)。
本发明的DNA可获得自如下所述的Gluconacetobacter entanii的染色体DNA。
首先，制备Gluconacetobacter entanii的染色体DNA文库，例如Acetobacter altoacetigenes MH-24株(以登记号FERM BP-491于1984年2月23日(原始保藏)保藏于国际专利生物保藏中心(Tsukuba Central6，1-1-1 Higashi Tsukuba，Ibaraki，Japan)，国立高级工业科学和技术研究所(AIST))的染色体DNA文库。可通过常规方法获得该染色体DNA(如，参见日本专利公开(Kokai)号60-9489A(1985))。
其次，为分离ompA基因，自上述获得的染色体DNA构建染色体DNA文库。首先，用合适的限制酶部分消化该染色体DNA文库以获得各种片段的混合物。通过调节酶切反应时间等调节酶切程度，可使用多种不同类型的限制酶。例如，在30℃或更高温度下，优选在37℃下，对于不同的反应时间(1分钟至2小时)在1-10单位/毫升的酶浓度范围内通过将Sau3A I应用于DNA可以消化该染色体DNA。
再次，将这样切割得到的染色体DNA片段连接到在醋酸菌中能自主复制的载体DNA上，从而构建得到重组载体。特别是，该载体DNA在30℃温度、在1-100单位/毫升酶浓度范围内的条件下与限制酶(如，BamH I，其产生的末端核苷酸序列与用于切割该染色体DNA的限制酶Sau3A I的互补)反应1或更多小时，从而完全消化并切割该载体DNA。
又次，将上述获得的染色体DNA片段混合物与该切割得到的载体DNA混合，接着添加T4DNA连接酶并在4℃-16℃温度范围内、在1-100单位/毫升酶浓度范围内的条件下反应1或更多小时(优选6-24小时)，从而获得重组载体。
用于由染色体DNA构建染色体DNA文库的方法为本领域公知(如，鸟枪法)，并不限于上述方法。
在存在1％醋酸浓度的琼脂培养基中，醋酸菌通常需要4天才生长，例如使用如此获得的重组载体转化的醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)No.1023株(以登记号FERM BP-2287于1983年6月27日(原始保藏)保藏于国际专利生物保藏中心(Tsukuba Central 6，1-1-1 HigashiTsukuba，Ibaraki，Japan)，国立高级工业科学和技术研究所)。随后，在含1％醋酸琼脂培养基上涂布该菌株，培养3天。在液体培养基中接种并培养所生成的克隆。从如此所获得的细菌收集质粒，以便能获得含有ompA基因的DNA片段。
本发明DNA的一个特定例子是一种具有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA。在这样的DNA中，SEQ ID NO1中第180-1376位的核苷酸序列是编码区，其编码的蛋白质如SEQ ID NO2所示。
作为DDBJ/EMBL/Genbank和SWISS-PROT/PIR同源性搜索的结果，SEQ ID NO1所示核苷酸序列或SEQ ID NO2所示氨基酸序列(相应于图3的SEQ ID NO1中第180-1376位核苷酸)在氨基酸水平上与来自大肠杆菌的ompA基因具有36％同源性，与来自新月柄杆菌的ompA基因具有30％同源性。因此，认为该相应基因编码蛋白质OMPA。但是，因为这两个同源性都低于40％或更低，显然该基因是不同于这些基因的新基因。
关于本发明的DNA，为该DNA所编码的ompA基因的核苷酸序列业已阐明于此。因此，该DNA可使用醋酸菌Gluconacetobacter entanii的基因组DNA作为模板、以及基于作为引物的核苷酸序列合成的寡核苷酸通过聚合酶链式反应(PCR反应)获得，或例如通过使用基于作为探针的核苷酸序列合成的寡核苷酸杂交获得。具有作为引物或探针功能并、由ompA基因部分序列制备的上述DNA也包括在本发明的DNA中。具体地说，在本发明中由SEQ ID NO3或4所示的序列组成的DNA可用作为引物，但本发明的DNA并不限制于此。在此，“具有作为引物或探针功能”指具有能用作为引物或探针的核苷酸序列的长度和核苷酸组成。上述能作为引物或探针的DNA的设计为本领域技术人员众所周知。
DNA(寡核苷酸)可根据常规方法合成，例如使用多种商业上可获得的DNA合成仪。此外，根据常规方法进行PCR反应，使用Taq DNA聚合酶(TAKARA BIO INC.生产)、KOD-Plus-(TOYOBO CO.，LTD.生产)等，还使用了Applied Biosystems生产的热循环基因扩增PCR系统9700。
此外，本发明的OPMA蛋白质为上述DNA所编码，具体地说含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。只要蛋白质含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列就保留有生长促进功能，其氨基酸序列在多个氨基酸中，优选在1个或几个氨基酸中，可包含诸如置换、缺失、插入、添加或倒位的突变。
例如，本发明的蛋白质也包括含有来自SEQ ID NO2所示的氨基酸序列通过缺失1-10个氨基酸，优选1-5个氨基酸，添加1-10个氨基酸，优选1-5个氨基酸，或用其他氨基酸置换1-10个氨基酸，以及优选1-5个氨基酸得到的氨基酸序列的蛋白质。编码含有如上所述突变的氨基酸序列并具有生长促进功能的上述蛋白质的DNA也可通过位点定向诱变方法获得；特别是通过，例如在特定位点缺失、置换、插入、添加或倒位氨基酸来改变核苷酸序列获得。此外，如上所述改变的DNA也可通过引起突变的常规公知处理获得。
此外，编码具有生长促进功能蛋白质的本发明DNA变体也可通过位点定向诱变方法或类似方法合成得到。另外，向作为基因的DNA中导入突变，可使用诸如Kunkel方法和缺口双链体方法或根据其的改良方法的公知技术进行。例如，使用导入突变的试剂盒导入突变，其使用了位点定向突变方法(如，Mutan-K(TAKARA BIO INC.生产)或Mutan-G(TAKARA BIO INC.生产))等。此外，突变可导入基因，或嵌合基因也可通过诸如易错PCR、DNA改组等技术构建。该易错PCR技术和DNA改组技术为本技术领域所公知。例如，关于易错PCR，参见Chen K和Arnold FH.1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，905618-5622，以及关于DNA改组，参见Stemmer W.P.1994，Nature，370389-391和Stemmer W.P.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，9110747-10751。
在此，“生长促进功能”在本发明中指在醋酸存在下促进微生物生长的功能。更具体地说，该术语指在醋酸存在下细菌的高生长速度或大量生长。此外，该术语也指更高上限的醋酸浓度，在该浓度下生长或醋酸发酵是可能的。上述“生长促进功能”也可指增强醋酸耐性的功能。无论编码具有上述生长促进功能蛋白质的基因其中是否导入上述突变，其可通过在含有醋酸的培养基中测定存在或不存在生长得到证实，如实施例中所示。
此外，通常已知在不同种、株、变体和变种之间，蛋白质的氨基酸序列和编码该蛋白质的核苷酸序列稍有不同。编码基本上同一的蛋白质的DNAs可获得自所有的醋酸菌，特别是那些属于醋杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的种和株，以及它们的变体和变种。
具体地说，例如，在SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中，在严格条件下与由与由核苷酸编号180-1376组成的核苷酸序列互补的核苷酸序列的一部分组成的DNA杂交，或与由可作为探针的制备自核苷酸编号180-1376的DNA一部分的核苷酸序列组成的DNA杂交，以及编码具有生长促进功能蛋白质的DNA，可分离自属于醋杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌、属于醋杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的突变的醋酸菌、或它们的天然突变株或变种。这样，编码基本上同一于上述蛋白质的蛋白质，即保留生长促进功能的蛋白质的DNA也可获得。在此使用的术语“严格条件”指所谓特定的杂合物能形成，而非特异的杂合物不能形成的条件。对该条件明确进行数值化是困难的。举例来说，同源性高的核酸之间，例如具有70％或更高同源性的核酸之间进行杂交，而比他们同源性低的核酸之间不进行杂交的条件。其他这样的例子包括通常的用于杂交的洗涤条件，例如在1x SSC下用相当于0.1％SDS的盐浓度在60℃下进行洗涤的条件。
3、本发明的醋酸耐性微生物(具有增强的生长促进功能的微生物)本发明的DNA编码具有生长促进功能的蛋白质OMPA。通过使用本发明的DNA，可得到生产在醋酸存在下具有增强的生长促进功能的微生物，也就是说，对醋酸具有提高抗性的微生物。
微生物的生长促进功能可被增强，例如通过将ompA基因连接到重组载体上并用该载体转化微生物，使得在细胞内扩增多拷贝的该基因，或通过将该基因的结构基因部分和在微生物中能高效作用的启动子序列连接到重组载体上，并用该载体转化微生物，使得扩增多拷贝的该基因并增强该基因的表达。
本发明的重组载体可通过将编码如上节“2、本发明的DNA和蛋白质”所述的OMPA蛋白质的DNA连接到合适的载体上而获得。转化体可通过使用上述本发明的重组载体转化宿主而获得，以便ompA基因能得到表达。
作为重组载体，可使用在宿主中自发复制的噬菌体或质粒。质粒DNA的例子包括来自大肠杆菌(如pBR322、pBR325、pUC118、pET16b等等)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)(如pUB110、pTP5等等)和酵母(如YEp13、Ycp50等等)的质粒。噬菌体DNA的例子包括λ噬菌体(如λgt10、λZAP等等)。此外，也可使用诸如逆转录病毒或牛痘病毒的动物病毒载体、诸如杆状病毒的昆虫病毒载体、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等制备转化体。
此外，使用多拷贝载体、转座子等也可将靶DNA导入到宿主中。在本发明中，上述多拷贝载体或转座子也包括在本发明的重组载体中。这样的多拷贝载体包括pUF106(如，参见Fujiwara，M等，Cellulose，1989，153-158)、pMV24(如，参见Fukaya，M等，Appl.Environ.Microbiol.，1989，55171-176)、pGI18(如，参见日本专利申请2003-350265的说明书；实施例3)、pTA5001(A)和pTA5001(B)(如，参见日本专利公开(Kokai)号60-9488A(1985))。也可使用染色体整合型载体pMVL1(如，参见Okumura，H等，Agric.Biol.Chem.，1988，523125-3129)。此外，上述转座子的例子包括Mu和IS1452。
为了将本发明的DNA插入到载体中，例如使用一种方法，包括用合适的限制酶切割纯化的DNA，然后将产物插入到合适的载体DNA的限制酶位点或多克隆位点中，使得其与该载体连接。
本发明的DNA应当整合入载体中，以发挥为该DNA所编码的基因的功能。因此，除启动子和本发明的DNA之外，如果需要，可将顺式元件连接到本发明的重组载体上，例如增强子、剪接信号、加polyA信号、选择标记、核糖体结合序列(SD序列)等。此外，上述选择标记的例子包括二氢叶酸还原酶基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和新霉素抗性基因等。
此外，用其他在属于醋杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌中能高效作用的启动子序列替代染色体DNA上ompA基因的启动子序列，构建用于同源重组的载体，然后使用该载体在微生物染色体中进行同源重组。上述启动子序列的例子包括来自非醋酸菌微生物的那些，例如大肠杆菌质粒pBR322(TAKARA BIO INC.生产)氨苄青霉素抗性基因、质粒pHSG298(TAKARA BIO INC.生产)卡那霉素抗性基因、质粒pHSG396(TAKARA BIO INC.生产)氯霉素抗性基因和β-半乳糖苷酶基因等的启动子序列。用于同源重组载体的构建为本领域技术人员所公知。如上所述，通过在强启动子控制下排列微生物中的内源性ompA基因，扩增得到多拷贝的ompA基因，因此增强了表达。
用于转化的微生物没有特别限制，只要它们能表达导入的DNA即可。上述微生物的例子包括细菌(如，大肠杆菌、枯草杆菌和乳酸菌)、酵母和诸如那些属于曲霉(Aspergillus)属的真菌。在本发明中，优选使用醋酸菌作为在此使用的微生物，因为其目的在于增强生长促进功能。在醋酸菌中，属于醋杆菌属和葡糖酸醋酸杆菌属的细菌是优选的。
属于醋杆菌属的细菌的例子是醋化醋杆菌。具体地说，例如可使用醋化醋杆菌No.1023株(FERM BP-2287)、醋化醋杆菌木糖亚种(Acetobacter aceti subsp.xylinum)IFO3288株和醋化醋杆菌IFO3283株。
此外，属于葡糖酸醋酸杆菌的细菌的例子包括Gluconacetobactereuropaeus DSM6160株和Gluconacetobacter entanii。具体地说，例如可使用Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)。
用于将重组载体导入包括醋酸菌的细菌中的方法没有特别限制，只要它们适合于将DNA导入细菌即可。上述方法的例子包括使用钙离子的方法(如，参见Fuyaka，M等，Agric.Biol.Chem.，1985，492091-2097)和电穿孔方法(如，参见Wong，H等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1990，878130-8134)等。
当酵母用作为宿主时，可使用例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Shizosaccharomyces pombe)。用于将重组载体导入酵母中的方法没有特别限制，只要它们适合于将DNA导入酵母中既可。上述方法的例子包括电穿孔方法、原生质球法和醋酸锂法。
利用被导入载体上标记基因的特性可对转化体进行选择。例如，当使用新霉素抗性基因时，选择对G418药物具有抗性的微生物。
在本发明一个优选的实施方案中，可通过转化含有核酸的重组载体而获得转化体，该核酸具有至少SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，例如，通过转移重组载体pOMPA1，其中所述核酸已插入到醋酸菌-大肠杆菌穿梭载体(多拷贝载体)pUF106、醋化醋杆菌No.1023(FERMBP-2287)株中；或通过导入重组载体pOMPA2，其中所述核酸已插入到醋酸菌-大肠杆菌穿梭载体(多拷贝载体)pGI18、醋化醋杆菌木糖亚种IFO 3288株中。
当如上所述在具有氧化乙醇能力的属于醋杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸菌中生长促进功能得到增强时，醋酸的产量和产率可得到增加。
4、食醋制造方法如上节“3、本发明的醋酸耐性微生物”所述，制备具有选择性增强生长促进功能(作为具有上述生长促进功能的基因多拷贝扩增的结果)和氧化乙醇能力的微生物(醋酸菌)。上述微生物可用于制造食醋，因为它们能在醋酸存在下生长并产生醋酸。因此，将具有扩增的多拷贝ompA基因的微生物在含有乙醇的培养基中培养，然后使之在培养基中产生并蓄积醋酸，以便高效制造含有高浓度醋酸的食醋。
本发明制造方法中的醋酸发酵可以类似于使用醋酸菌进行常规发酵的食醋制造方法的方法进行，且用于发酵的方法并没有特别限制。用于醋酸发酵的培养基可以是合成或天然培养基，只要其含有碳源、氮源、无机物和乙醇，如有必要还可含有合适量的所使用的微生物菌株生长需要的营养源即可。
碳源的例子包括各种碳水化合物，例如葡萄糖和蔗糖以及各种有机酸。作为氮源，可使用诸如蛋白胨或微生物发酵裂解物的天然氮源。
此外，培养可在需氧条件下进行，例如那些静置培养方法、振荡培养方法或通风和搅拌培养方法。培养通常在30℃下进行。培养基的pH通常在2.5-7范围内，且优选在2.7-6.5范围内。也可使用各种酸、各种碱、缓冲液等来调节pH。培养通常进行1-21天。
通过培养具有扩增的多拷贝ompA基因的微生物，高浓度醋酸蓄积在培养基中。此外，上述微生物的生长速度提高了，使得醋酸产率也提高。
根据本发明，可赋予微生物生长促进功能以便增强其生长。此外，在具有氧化乙醇能力的微生物中，特别在醋酸菌中，在高醋酸浓度存在下生长功能(耐醋酸)增强了，且生长诱导周期明显缩短。因此，在培养基中高效蓄积高浓度醋酸的能力可赋予上述微生物和细菌。这样所产生的微生物(醋酸菌)可用于制造含有高浓度醋酸的食醋。
实施例具体地说，通过所提及的实施例对本发明进行进一步描述。但是，本发明的技术范围并不为这些实施例所限制。
克隆来自Gluconacetobacter entanii具有生长促进功能的基因并测定其核苷酸序列和氨基酸序列(1)构建染色体DNA文库在补充有6％醋酸和4％乙醇的YPG培养基(3％葡萄糖，0.5％酵母抽提物和0.2％聚胨)中于30℃下振荡培养Acetobacter altoacetigenesMH-24株(FERM BP-491)，其为Gluconacetobacter entanii的一株。在培养后，离心培养基(7,500xg，10分钟)，由此获得细菌细胞。从这样获得的细菌细胞中，根据染色体DNA制备方法(如，参见日本专利公开(Kokai)号60-9489A(1985))制备染色体DNA。
用限制酶Sau3A I(来自TAKARA BIO INC.)部分消化以上述方法获得的染色体DNA。用限制酶BamH I完全消化并切割大肠杆菌-醋酸菌穿梭载体pUF106。混合适当量的这些DNAs并接着用连接试剂盒(TaKaRa DNA连接试剂盒Ver.2，来自TAKARA BIO INC.)连接，由此构建Gluconacetobacter entanii的染色体DNA文库。
(2)克隆具有生长促进功能的基因将上述获得的Gluconacetobacter entanii染色体DNA文库转化入醋化醋杆菌No.1023株(FERM BP-2287)中，已知该菌株通常需要4天才在含1％醋酸的琼脂培养基上生长。接着在含1％醋酸和100μg/ml氨苄青霉素的YAG琼脂培养基上于30℃下培养3天。在含100μg/ml氨苄青霉素的YAG培养基上接种并培养这3天内产生的克隆，然后从所收获的细菌细胞中收集质粒。一约2.3-kbp Sau3AI片段得到克隆，如图1所示，该质粒命名为pS10。
如上所述，所获得具有生长促进功能的基因片段能使醋化醋杆菌No.1023株在含1％醋酸的琼脂培养基上在3天内生长，虽然该菌株在上述含1％醋酸的琼脂培养基上通常需要4天才生长。
(3)测定克隆的DNA片段的核苷酸序列将以上克隆的Sau3A I片段插入到pUC19的BamH I位点中，然后使用Sanger氏双脱氧链终止法测定该片段的核苷酸序列。结果，测定了SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。对具有所有彼此重叠的切割位点的两条DNA链的全部区域进行测序。将如此所获得的基因命名为ompA。
在SEQ ID NO1所示的核苷酸序列中，证实了所存在的编码如SEQ ID NO2(图3)所示的399个氨基酸的开放阅读框在核苷酸编号180-1376范围内。
在来自Gluconacetobacter entanii的具有生长促进功能基因的转化体中缩短生长诱导周期的效果(1)转化入醋化醋杆菌使用KOD-Plus(来自TOYOBOCO.，LTD)通过PCR方法扩增来自Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)的根据实施例1克隆得到的上述ompA基因。将如此扩增的DNA片段插入到醋酸菌-大肠杆菌穿梭载体pUF16(如，参见Fujiwara，M等，CELLULOSE，1989，153-158)的限制酶Sma I切割位点，以制备质粒pOMPA1。插入pOMPA1的扩增片段如图1所示。图1显示了使用Sau3A I克隆的来自Gluconacetobacter entanii基因片段(pS10)的酶切图谱，具有生长促进功能基因的位置，以及插入到pOMPA1中的片段。
PCR方法如下进行。具体地说，PCR在如下PCR条件下进行，即使用Acetobacter altoacetigenes MH-24株的基因组DNA作为模板，引物1(5’-GTTTCCCGGAATTCCCGTTTCAGCTCCTTC-3’SEQ IDNO3)，引物2(5’-ATATCTTTCAGGGCATTTGGAGGTATTCCG-3’SEQ ID NO4)，和KOD-Plus-(来自TOYOBO CO.，LTD)。
具体地说，该PCR方法进行30个循环，每个循环包括在94℃15秒，在60℃30秒，以及在68℃1分钟。
使用电穿孔方法(如，参见Wong，HC等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1990，878130-8134)将pOMPA1转化到醋化醋杆菌No.1023株中。使用补充有100μg/ml氨苄青霉素和1％醋酸的YPG琼脂培养基选择转化体。
从在该选择培养基上3天内已生长的氨苄青霉素抗性转化体中抽提质粒，然后根据常规方法进行分析。这样，证实了持有该质粒的菌株具有生长促进功能的基因。
(2)使用转化体进行醋酸发酵试验比较具有质粒pOMA1的如上所述获得的氨苄青霉素抗性转化体和仅具有穿梭载体pUF106的原始醋化醋杆菌No.1023株的醋酸发酵能力。
具体地说，使用5L小型发酵罐(来自Misuwa Scientific Crop.，KMJ-5A)，在含1％醋酸、4％乙醇和100μg/ml氨苄青霉素的2.5L YPG培养基中于30℃、400rpm和0.20vvm下进行通风和搅拌培养。该菌株可以发酵产生3％浓度的醋酸。随后，倒掉一些培养基，在小型发酵罐中留下700mL的培养基。将含醋酸、乙醇和100μg/ml氨苄青霉素的1.8L YPG培养基添加到所剩余的700mL培养基中，使醋酸浓度达到3％，乙醇浓度达到4％。再次启动醋酸发酵。当添加乙醇时持续进行通风和搅拌培养，以便在培养基中保持1％的乙醇浓度。比较该转化体和原始菌株的醋酸发酵能力。结果概述于表1中。
表1
基于表1的结果，可以证实就转化体而言，特定的生长速度明显更高，生长诱导周期明显缩短，且该转化体能高效进行醋酸发酵。
来自Gluconacetobacter entanii的具有生长促进功能基因的转化体醋酸耐性的增强(1)构建醋酸菌-大肠杆菌穿梭载体pGI18使用来自Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)的约3.1-kb的质粒pGI1和pUC18构建pGI18。
具体地说，自Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)的培养基收集细菌细胞，使用氢氧化钠或十二烷基硫酸钠裂解，用苯酚处理，接着用乙醇处理，由此纯化质粒DNA。
如此获得的质粒是一种具有3个Hinc II识别位点和1个Sfi I识别位点的环状双链DNA质粒。该质粒全长约为3100个碱基对(bp)。此外，该质粒没有EcoR I、Sac I、Kpn I、Sma I、BamH I、Xba I、Sal I、PstI、Sph I或Hind III的识别位点。该质粒命名为pGI1，并用于构建载体pGI18。
使用KOD-Plus-(来自TOYOBO CO.，LTD)通过PCR方法扩增上述获得的质粒pGI1。用Aat II切割该扩增产物。将片段插入到pUC18的限制酶AatII切割位点中，由此制备得到质粒pGI18(图4)。
PCR方法如下详述进行。具体地说，PCR在如下PCR条件下进行，使用质粒pGI1作为模板，以及引物A(SEQ ID NO6)和引物B(SEQ ID NO7)，这些引物具有限制酶Aat II识别位点。
具体地说，该PCR方法进行30个循环，每个循环包括在94℃30秒，在60℃30秒，以及在68℃3分钟。
如图4所示，如此获得的质粒pGI18含有pUC18和pGI1，其全部长度约为5800个碱基对(5.8kbp)。
质粒pGI18的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示。
(2)转化入醋化醋杆菌木糖亚种中使用KOD-Plus-(TOYOBO CO.，LTD.)通过PCR方法将实施例1获得的来自Acetobacter altoacetigenes MH-24株(FERM BP-491)的具有生长促进功能的基因进行扩增。用限制酶Sma I切割(1)中构建的醋酸菌-大肠杆菌穿梭载体pGI18。然后，将所扩增的DNA片段插入到该穿梭载体的限制酶Sma I切割位点中，以制备质粒pOMPA2。插入pOMPA2的扩增片段如图1所示。图1显示了使用Sau3A I克隆的来自Gluconacetobacter entanii基因片段(pS10)的酶切图谱，具有生长促进功能基因的位置，以及插入到pOMPA2中的片段。
PCR方法如下详述进行。具体地说，PCR在如下PCR条件下进行，使用KOD-Plus-(来自TOYOBO CO.，LTD)以Acetobacteraltoacetigenes MH-24株的基因组DNA作为模板，引物1(5’-GTTTCCCGGAATTCCCGTTTCAGCTCCTTC-3’SEQ ID NO3)，引物2(5’-ATATCTTTCAGGGCATTTGGAGGTATTCCG-3’SEQ ID NO4)。
具体地说，该PCR方法进行30个循环，每个循环包括在94℃15秒，在60℃30秒，以及在68℃1分钟。
使用电穿孔方法(如，参见Wong，HC等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1990，878130-8134)将pOMPA2转化到醋化醋杆菌木糖亚种中。使用补充有100μg/ml氨苄青霉素和1％醋酸的YPG琼脂培养基选择转化体。
从在该选择培养基上业已生长的氨苄青霉素抗性转化体中抽提质粒，然后根据常规方法进行分析。这样，证实了持有具有生长促进功能基因的质粒。
(3)转化体对醋酸的耐性在补充有醋酸的YPG培养基中，比较如上获得自(2)的具有质粒pOMPA2的氨苄青霉素抗性转化体和仅具有穿梭载体pGI18导入其中的原始醋化醋杆菌木糖亚种IFO3288株的生长。
具体地说，于30℃下在100ml含3％醋酸和100μg/ml氨苄青霉素的YPG培养基中进行振荡培养(150rpm)。通过测定660nm下的细菌浓度比较转化体和原始菌株在添加了醋酸的培养基中的生长情况。
结果，如图2所示，在补充有3％醋酸的培养基中，可以证实转化体(用空心圆表示)能生长，而原始醋化醋杆菌木糖亚种IFO3288株(用实心圆表示)不能生长。因此，可以证实具有生长促进功能的该基因增强醋酸耐性的功能。
用具有来自Gluconacetobacter entanii的生长促进功能基因的转化体进行醋酸发酵试验比较实施例3中获得的具有质粒pOMPA2的氨苄青霉素抗性转化体和仅具有穿梭载体pGI18导入其中的原始醋化醋杆菌木糖亚种IFO3288株的发酵醋酸能力。
具体地说，将具有1％醋酸浓度和4％乙醇浓度的YPG培养基装入5L小型发酵罐(来自Misuwa Scientific Crop.，KMJ-5A)。将转化体或原始菌株以0.4％在培养基上接种。然后于32℃的发酵温度、500rpm和0.20vvm下进行通风和搅拌培养。当发酵进行到醋酸浓度增加到4％时，添加原料培养基(乙醇浓度7.8％以及醋酸浓度0.26％)继续发酵，该原料培养基是通过混合17.9％糖化米溶液、3.2％醋酸发酵液、7.8％乙醇和71.1％水制备得到的。进一步继续发酵直到醋酸浓度增加到7.2％。
当醋酸浓度增加到7.2％时，继续发酵，调节原料培养基的添加速度以便能保持醋酸浓度。
就原料培养基的添加速率，即添加速度(与产率的比例)比较转化体和原始菌株。结果如表2所示。
此外，当在7.2％醋酸浓度下持续发酵，转化体的添加速度调节到与原始菌株几乎相等时，也比较该转化体和原始菌株的醋酸发酵能力。结果如表3所示。
表2
表3
基于表2的结果，也表明在持续醋酸发酵情况下，转化体较原始菌株生产率(原料培养基的添加速度)更高更好。
此外，基于表3结果，揭示了当在固定生产率(原料培养基的添加速度)下进行持续醋酸发酵时，与原始菌株比较转化体能持续进行醋酸发酵，具有更高醋酸浓度并具有更好的醋酸耐性。
工业实用性本发明提供了一种具有生长促进功能的新基因。通过使用该基因获得的菌株，在高醋酸浓度下具有增强生长功能(耐醋酸)、缩短的生长诱导周期和改良的醋酸耐性。上述菌株可用于高效制造具有高醋酸浓度的食醋。因此，本发明在高效制造具有高醋酸浓度的食醋中是有用的。
所有在此引用的出版物、专利和专利申请其全文并入作为参考。
序列表自由文本SEQ ID NOS3、4、6和7合成的寡核苷酸序列表<110>Mitsukan Group Corporation<120>醋酸菌增殖功能相关基因及其用途<130>PH-2195PCT<150>JP 2003-183047<151>2003-06-26<160>7<210>1<211>2352<212>DNA<213>Gluconacetobacter entanii(Acetobacter altoacetigenes MH-24)<400>1gatccagcca tggacaggtg cgggcaggtt tcccggcatt cccgtttcag ctccttcccg 60ctggcattgc gataatggcc tcaggccaac tgtatcaaca tgcatcaggc cagtgtggaa 120catgccccca tctccacaaa caagaaggcg tctgatcaag tatctttaag gacgggaata 180tgcgtcttcg catggtatta ctggcgactg cacttggcgc agcgccattc gccaccgcaa 240tggccacgac gattacaggg ccatatgtcg atatcggtgg cgggtatgac ctgacccaga 300cccagcatgc ccatggcttt gacaagaacc agtacgaaaa caacgcaaat acggccgggt 360atcttgatgc aacggacaac gcccgcctgc tgaaggaagc ccattcacgc gaacgcatgg 420aacatggcga tggctggacc ggcttcgcca cgttcggctg ggggttcggc aacggcctgc 480gcgcggaaat cgagggggat tacaactggt ccgccctgac cggctacaac tcggtttccg 540gttccgccta tggcaacaat catcagagcg gcaagtccag cggcagcgac cggtcctatg 600gcggattcgt caacgtcctg tatgacatcg acctcaagcg cctgtttaac attgacgtgc 660ccgtgacacc attcgtcggc gttggcgccg gttacctgtg gcagaacgtg gatgccagca 720catccgtgac ccgctacctg aacgtgcgcc agaacggcac gaatggcagc ttcgcctatc 780agggcatggt cggcgcggcc tatgacatcc ccggtgtgcc cggcctgcag atgaccaccg 840aataccgcat gatcggacag gtggaatcct tcgccatggg caatatcagc cagactggcg 900gcggtgaccg cacgctgagc tacgaccatc gcttcaacca tcagttcatc gtcggcgtcc 960gctacgcctt caaccacgcg ccaccgccgc cgccgcccgc gcccgccgtg gcgccccctg1020cccccagcgc ggcccgtacc tatctcgtat tctttgactg ggatggcgcg gtcctgaccg1080atcgcgcgcg cgggatcgtg gcggaagcgg cgcaggcttc cacgcatgtc cagacgaccc1140gtatcgaagt caacggctat accgacaaca cctcggccca ccccggacca cgtggggaga1200agtataacct tggcctgtcc atgcggcgcg cagacagcgt gaaggctgaa ctgatccgtg1260acggcgtacc cgctggcggc atcgacatcc actggtatgg cgaagcccat ccgctggtgg1320tcacccagcc cgatacgcgt gagccgcaga accgtcgcgt cgaaatcatc ctgcactgac1380gacacatact gcaataaatt gataaatagg cttttttaca aaggggcgca caggatgcgc1440ccctttccat atcgaatcgt tccgatgcat cacaggccat gaatcagccc ttccgtttcc1500
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<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>4atatctttca gggcatttgg aggtattccg 30<210>5<211>5734<212>DNA<213>Gluconacetobacter entanii(Acetobacter altoacetigenes MH-24)<400>5catggggcgt cacccccagc ggccagcttg gctacctgat ggacagggcg ggccttctgc 60aagccctcgg ccactgccat ctgccgggat atgaggccaa atacgaaccg aaggaaaagc 120gcaccttctg ctaccccacc cagaacgcca gcggctgggc tgtgcagcca tgatcgccaa 180cccctccctc ttcctgagca attcggaaga gcgatttccg ccgactgaac acgtcgaaaa 240tggcagtttt ccaccgaaaa aaggaaagga ccataggaaa ggattaatat cttattttta 300tctaggggtt tgccgatccg cgattttcgc tgggaaaccg ccaaaaatgg cttgccatta 360ggtcgcacca catgcgacca taaagtcgca cagtgtgcga cctattcggc ccatatacag 420aggttcccca catgcggaat gtcacccgtc tcaagacccg caaagaccgg ctccgcgagg 480accaagccga cctgttgaag caagcccttc tgcccttcgc agaggacgat ggaccgatgc 540gggatgcggt cggacggctc tacgtccaga tcaagaacct caccacccca gaccccggaa 600ccacggagcc gttcgtcatg atccgtcccg cccagaatcg cgccgtcacc ctctggctgc 660tgaagaacag taagcggccc atgaaggccg tggacgtatg gacgctgctg ttcgaccacc 720tgtttcccca taccggccag atcatgctga cccgtgagga aatcgcggaa aaagtcggta 780tccgggtcaa cgaagttaca gccgtcatga acgagctggt gagcttcggc gcgattttct 840ccgagcgcga gaaggtggcc ggaatgcgcg ggccgggcct cgcccgctac tacatgaacc 900ggcatgtggc cgaggtcggc agccgcgcca cgcaggaaga acttgcccta atcccacgcc 960ccggcgccaa gctggcagtc gtgcagggtg gcaaggctta acccatgaag gtttcggaac1020tggacgtgtt cgacagcgcc aaggcggcac aagacccgtt ggtgcgggaa gaactgctgc1080aagcagcgca ggcggacggc cacggccccg ccctcgctca tgcccgttcc gtcatagcca1140aggcgcgggc cgggcaggac gccaaggctt aacggccccg ccctctcccg cctcgatccc1200ggcgggcctg tagcatctcc tgatgctcct tggcgttttt ggcccgctgc tcggcccgct1260ctttctcggc cgctgcggct cttaggcgct cttcggccag ccgcatccgc tcgtccatct1320gacgtttccg atctgcctcg gcatccttgg cggctcctgc cttcagccct ttgctgaaag1380ccatccactt attggcggtt ttctcggctt tctgctgtat cggcggggtc agccggtcaa1440atgcctgggc caccctctcg aagccctcac gcatggcgtt gacggcctgc gccagtttag1500ccagggcgaa atctatcacc tcggcccgct gggcgttctc ggcccggata cgccggttgt1560ggttgccggt cggggtctgg tggcccttcc gttccagagc caccacattc ggccccatgt1620gccgctctgg aacgcggtct agcccctgct ccgcattgct ccggtgatct atccgggcct1680cttgcccagc ccgctctagc gcggcattgg caaggcccgc ccatagctgc cggatttcct1740tcacctcgtc ggcggccttc cccagtccca tgccctgccg cttcttgtcg gacagttcga1800tggttgattt gtctccaaag gacagcttgc catcggcccc ccgctccacc gtgcgggtgg1860
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<223>人工序列描述合成的寡核苷酸<400>7ggccaagacg tctgcagcat ggggcgtcac 30
权利要求
1.一种下列(A)或(B)的蛋白质(A)含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质；或(B)含有由SEQ ID NO2所示氨基酸序列通过置换、缺失、插入、添加或倒位1个或几个氨基酸得到的氨基酸序列，并具有生长促进功能的蛋白质。
2.一种DNA，其编码下列蛋白质(A)或(B)(A)含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质；或(B)含有由SEQ ID NO2所示氨基酸序列通过置换、缺失、插入、添加或倒位1个或几个氨基酸得到的氨基酸序列，并具有生长促进功能的蛋白质。
3.一种下列(A)、(B)或(C)的DNA(A)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列的DNA；(B)与由与SEQ ID NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列互补的序列组成的DNA在严格条件下杂交，并编码具有生长促进功能蛋白质的DNA；或(C)与由产生自SEQ IN NO1所示核苷酸序列中第180-1376位的核苷酸序列的一部分的核苷酸序列组成的、具有引物或探针功能的DNA在严格条件下杂交，并编码具有生长促进功能蛋白质的DNA。
4.一种重组载体，其含有根据权利要求2或3的DNA。
5.一种转化体，其用根据权利要求4的重组载体转化。
6.一种具有增强的生长促进功能的微生物，其中在细胞中根据权利要求2或3的DNA的多个拷贝被扩增。
7.根据权利要求6的微生物，其是属于醋杆菌属(Acetobacter)或葡糖酸醋酸杆菌属(Gluconacetobacter)的醋酸菌。
8.一种制造食醋的方法，其包括在含乙醇的培养基中培养根据权利要求6或7的微生物，并使该微生物在该培养基中生成并蓄积醋酸。
9.含高浓度醋酸的食醋，其通过根据权利要求8的方法获得。
全文摘要
本发明提供了一种醋酸菌生长促进相关的新基因；一种促进微生物生长的方法，特别是，一种含有该基因的醋酸菌；以及一种使用具有改良的生长促进功能的醋酸菌在短时间内高效制造含高浓度醋酸的食醋的方法。
文档编号C12J1/00GK1842595SQ20048002446
公开日2006年10月4日 申请日期2004年6月16日 优先权日2003年6月26日
发明者中野繁 申请人:株式会社味滋集团公司