一种促进蓝莓营养吸收的菌根真菌及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一株植物内生菌根真菌；特别涉及一株从越橘属植物蓝莓根系分离获得的一种促进蓝莓营养吸收的菌根真菌及其制备方法与应用。

背景技术：

植物菌根是指植物根系与真菌所形成的互惠共生体即“菌根”(mycorrhizas)，是一种极为普遍的生命活动和生态现象。Frank 1885年首次拟创了“菌根”这个术语，之后若干年一直处于平稳发展期，直到20世纪50年代，菌根学在现代分子生物学和生化技术的辅助下进入迅猛共发展期，尤其是近30年，随着新方法、新技术的不断建立，研究内容更加广泛，菌根学研究已成为一项包括多种学科相互渗透的一门边缘生物科学。

菌根真菌的侵染能诱导植物根系形态发生明显变化，影响菌根周围各成员的相互作用。Duckett和Read(1995)研究发现Hymenoscyphus ericae分离物能促使假根根尖膨大，并在其细胞内形成菌丝团。菌根真菌还可通过分泌H⁺和一些酸性化合物，直接影响到土壤化学特性。大量研究表明，菌根真菌能显著促进植物对土壤中营养物质的吸收、提高植物抗病虫害的作用。接种菌根真菌还可促进各类植物生长、提高产量和品质，并促进组培苗的生长，提高移栽成活率。

蓝莓(blueberry)又名越橘，是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium spp.)植物，为多年生落叶或常绿灌木，果实为浆果。在我国原产于高海拔的野生灌木，在吉林长白山分布于海拔1500-2400米的地区。其须根部缺少大部分植物所具有的根毛，需借助合适的菌根菌帮助其吸收水分、矿物质营养等。

技术实现要素：

本发明针对上述现有技术中存在的问题，提供一种从野生越橘根系中获得菌根真菌，目的是促进蓝莓根系生长发育、提高N、P、K吸收作用及提高蓝莓产量。

本发明的另一目的在于提供一种菌根真菌的制备方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的。

一种菌根真菌MF001，该菌根真菌分类名称为：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)，其保藏编号为CGMCC No.4108，保藏日期为2010年8月18日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号。

所述的白囊耙齿菌引物扩增DNA序列如下：

本发明一种菌根真菌的制备方法包括如下步骤：

取新鲜完整的健康野生越橘的根，用自来水冲洗一小时，然后用无菌水冲洗3次，放入70℃的乙醇中灭菌30秒，再转入0.1％的升汞溶液中表面消毒2分钟，然后立即转入1％的无菌硫化钠水溶液中清洗，浸泡2分钟，然后切成0.5厘米长的根段置于PDA培养基平板上，25℃下恒温培养，待长出菌落后，将菌落边缘纯净的菌丝挑入新的PDA培养平板上培养，生长两天确认无污染后转入PDA试管中保存，所得真菌为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108。

所述白囊耙齿菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108的基本培养形态特征为：在PDA板上，28℃培养5天后菌落直径为8.6cm；菌丝粗壮，无分枝，无隔膜，表面白色有细长毛，无分生孢子。

所述的白囊耙齿菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108在蓝莓组培阶段、瓶外生根阶段和大田栽培阶段的应用。

本发明的优点效果如下：

本发明对从健康的野生越橘根系中分离得到的对蓝莓具有促进根系发育，提高N、P、K吸收率，增加蓝莓产量的菌根菌，并对其进行了种属鉴定和回接试验研究，旨在为蓝莓栽培产业开发提供优良的菌根菌株。接种菌根菌白囊耙齿菌对蓝莓的生长起到明显的促进作用。因此该菌株具有较好的应用前景，可以作为蓝莓生产储备菌株。

附图说明

图1为本发明的菌根真菌显微镜下菌丝体形态图。

图2为本发明的菌根真菌分子鉴定进化树图。

图3接种菌根真菌MF001对蓝莓组培苗的生长。

图4接种MF001对驯化阶段的蓝莓组培苗的影响。

图5接种MF001对2年生盆栽蓝莓的影响。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的说明。

表1为盆栽蓝莓叶片中全N、全P、全K的含量及差异显著性分析。

实施例1

蓝莓菌根真菌菌株白囊耙齿菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108菌的筛选及其鉴定

(1)本发明中的真菌分离自长白山南的野生越橘的根系中

具体方法为：取新鲜完整的健康野生越桔根，用自来水冲洗1小时，然后用无菌水冲洗3次，放入70℃的乙醇中灭菌30秒，再转入0.1％的升汞溶液中表面消毒2分钟，然后立即转入1％的无菌硫化钠水溶液中清洗，浸泡2分钟，然后切成0.5厘米长的根段置于PDA培养基平板上，25℃下恒温培养，待长出菌落后，将菌落边缘纯净的菌丝挑入新的PDA培养平板上培养，生长两天确认无污染后转入PDA试管中保存。将获得的真菌继续接种到瓶外生根的蓝莓苗，观察蓝莓接菌后的生长情况，把对蓝莓苗明显促进作用的菌株筛选出来。上述方法从几株真菌中筛选到一株对蓝莓苗有促进作用的菌株，将其命名为MF001。

(2)白囊耙齿菌(Irpex lacteus)的鉴定

在PDA板上，28℃培养5天后菌落直径为8.6cm。菌丝粗壮，无分枝，无隔，菌丝宽50-100μm，无分生孢子。如图1所示。

对该菌株的rDNA-ITS序列即18S，ITS1,5.8S,ITS2和28S区域部分序列进行扩增鉴定：提取菌株的基因组DNA作为模板，采用两条通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTAGATATGC-3’)进行PCR扩增，获得大小约0.6Kb的扩增产物。扩增片段克隆后送由上海生工进行测序，测序获得655个碱基的ITS序列，序列如图2所示。

将该菌株的上述rDNA-ITS序列在Genbank数据库中进行BLAST比对，结果显示，其序列与Irpex lacteus的rDNA-ITS区序列同源性达到99％。

通过上述表性特征和分子特征将其鉴定为Irpex lacteus属真菌，即白囊耙齿菌(Irpex lacteus)，该菌根真菌分类名称为：白囊耙齿菌(Irpex lacteus)，其保藏编号为CGMCC No.4108，保藏日期为2010年8月18日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址为：中国北京市海淀区中关村北一条13号。

所述的白囊耙齿菌引物扩增DNA序列如下：

实施例2

菌根真菌MF001的使用方法及其对蓝莓生长情况的研究结果

1、接种本发明的菌根真菌(MF001)对生根的蓝莓组培苗的影响

将已生根的蓝莓组培苗放在共生培养基中，每瓶一株。用7mm打孔器在菌丝边缘打孔，得到新鲜菌块。将菌块倒置于瓶内组培苗根系附近，每瓶接一个菌块。另设置不接菌对照处理，每种处理5个重复。将组培苗于恒温培养箱放置6个月，温度25℃，光强1500-2000lx，光照12h/d。

实验表明(图3)，接种菌根真菌MF001对蓝莓组培苗的生长促进作用较为明显，接菌处理的生长量比对照高出30％。

2、接种MF001对驯化阶段的蓝莓组培苗的影响

待2个月后形成菌根，用无菌镊子把培养瓶内的琼脂轻轻捣碎，将已形成菌根的蓝莓组培苗从培养基中拔出，然后放入25℃温水中轻轻洗去琼脂培养基。洗去琼脂后将其移植到0.1MPa压力下灭菌2.5小时的营养土上。移植时先用塑料育苗钵盛装己灭菌的培养基质达2/3容器高时，挖定植坑，接入1ml菌种，再栽上组培苗，在根部覆盖2-3cm厚的珍珠岩并浇水透湿。然后，放置在光照培养箱中，温度25℃，光照12h/d，每周浇WPM营养液一次，并进行常规管理。3个月后记录植株生长量。

实验表明(图4)接菌MF001对蓝莓组培苗驯化阶段植株的生长势也表现出明显促进作用，接菌处理的植株生长量高出对照56.1％。

3、接种MF001对盆栽蓝莓的影响

将扩大繁殖的菌根真菌MF001接种在盆栽蓝莓根际周围，20盆重复，2年生每株接种5ml菌液，5年生接种10ml,接种后覆土遮盖植株根系。接种需重复一次，间隔时间为一个月。按照常规方法进行水肥管理。2个月后记录植株生长量及茎粗。

实验表明(图5)，2年生接菌2个月的蓝莓苗盆栽阶段对植株生长的促进作用较明显，生长量高于对照34.54％。5年生接种6个月效果较明显,生长量高出对照28.2％。

即，接种MF001菌后，蓝莓组培苗、驯化苗和株高分别比对照高出30.0％、56.1％，2年生接菌2个月的蓝莓苗盆栽阶段对植株生长的促进作用较明显，生长量高于对照34.54％。5年生接种6个月效果较明显,生长量高出对照28.2％。蓝莓N、P、K吸收率显著提高，分别比对照增加8.76％、11.7％、31.8％。接种菌根菌白囊耙齿菌对蓝莓的生长起到明显的促进作用。因此该菌株具有较好的应用前景，可以作为蓝莓生产储备菌株。

实施例3

蓝莓菌根菌对蓝莓生长过程中N、P、K的吸收的影响

将二年生蓝莓盆栽苗根部在菌剂中迅速浸润，然后定植在花盆里，定植后浇透水。一个月后，在蓝莓根部再次补浇菌剂，每盆5m l。试验设置不接菌的对照处理，每种处理20个重复。采集蓝莓叶片，测定其N、P、K含量。其中采用凯氏定氮法测定全N，钼锑抗比色法测定全、P，原子吸收法测定全K含量。每处理随机采集5份。

结果表明：

1、全N测定中，MF001处理的全N含量为0.993％，与对照相比均达到了显著水平(α＝0.05)，比对照增加了8.76％，说明接菌处理能够增加蓝莓体内N元素的含量。

2、全P测定中，MF001处理的全P含量为0.114％，两种处理存在显著差异，比对照增加了11.7％，说明接菌处理能够增加蓝莓体内P元素的含量。

3、全K测定中，MF001处理的全K含量为0.605％,比对照增加了31.8％,说明接菌处理能够增加蓝莓体内K元素的含量。

表1 盆栽蓝莓叶片中全N、全P、全K的含量及差异显著性分析

Table 5-1 Contents and significance of differences of N,P and K in blueberries